Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.
Abstract
Autophagie ist ein spezialisierter kataboler Prozess, bei dem zytoplasmatische Komponenten, einschließlich Proteine und beschädigte Organellen, selektiv abgebaut werden. Autophagie ermöglicht es Zellen, physiologisch auf Stressreize zu reagieren und so die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Krebszellen könnten ihre Autophagie modulieren, um sich an widrige Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel oder Schäden durch Chemotherapie anzupassen. Das duktale Pankreas-Adenokarzinom ist eine der tödlichsten Krebsarten. Pankreaskarzinomzellen weisen aufgrund der transkriptionellen Hochregulation und posttranslationalen Aktivierung von Autophagieproteinen eine hohe Autophagieaktivität auf.
Hier wurde die PANC-1-Zelllinie als Modell für menschliche Krebszellen der Bauchspeicheldrüse und die AR42J-Pankreas-Azinuszelllinie als physiologisches Modell für hochdifferenzierte Säugetierzellen verwendet. In dieser Studie wurde die Immunfluoreszenz der Mikrotubuli-assoziierten Protein-Leichtkette 3 (LC3) als Indikator für den Status der Autophagie-Aktivierung verwendet. LC3 ist ein Autophagieprotein, das unter basalen Bedingungen ein diffuses Verteilungsmuster im Zytoplasma aufweist (in diesem Zustand als LC3-I bekannt). Die Autophagie-Induktion löst die Konjugation von LC3 mit Phosphatidylethanolamin auf der Oberfläche neu gebildeter Autophagosomen aus, um LC3-II zu bilden, ein membrangebundenes Protein, das die Bildung und Expansion von Autophagosomen unterstützt. Um die Anzahl der markierten autophagischen Strukturen zu quantifizieren, wurde die Open-Source-Software FIJI mit Hilfe des Tools "3D Objects Counter" eingesetzt.
Die Messung der autophagischen Konzentrationen sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch in Krebszellen ermöglicht es uns, die Modulation der Autophagie unter verschiedenen Bedingungen wie Hypoxie, Chemotherapie oder dem Knockdown bestimmter Proteine zu untersuchen.
Introduction
Makroautophagie (allgemein als Autophagie bezeichnet) ist ein spezialisierter kataboler Prozess, bei dem zytoplasmatische Komponenten, einschließlich Proteine und beschädigte Organellen, selektiv abgebaut werden 1,2. Autophagie ermöglicht es Zellen, physiologisch auf Stressreize zu reagieren und so die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten3. Bei der Autophagie entsteht ein Doppelmembranvesikel: das Autophagosom. Das Autophagosom enthält die Frachtmoleküle und treibt sie zum Abbau in das Lysosom 1,4.
Autophagosomen werden durch das autophagische Protein Mikrotubuli-assoziiertes Protein Light Chain 3 (LC3)5 dekoriert. Wenn keine Autophagie induziert wird, diffundiert LC3 im Zytoplasma und Zellkern in der LC3-I-Konformation. Wenn andererseits Autophagie induziert wird, wird LC3 mit einem Phosphatidylethanolamin in der Membran der autophagischen Strukturenkonjugiert 6. Diese neue LC3-Konformation wird als LC3-II1 bezeichnet. Die Konformationsverschiebung von LC3 führt zu Veränderungen in der zellulären Lokalisation und der Migration der Dodecylnatriumsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die durch Techniken wie Immunfluoreszenz und Western Blot 5,7 nachgewiesen werden können. Auf diese Weise ist die LC3-Konjugation ein Schlüsselereignis im autophagischen Prozess, das zur Messung der autophagischen Aktivität verwendet werden kann.
Die Azinuszelle der Bauchspeicheldrüse ist eine hochdifferenzierte Zelle, die unter gesunden Bedingungen eine geringe Autophagierate aufweist. Unter verschiedenen physiologischen Bedingungen oder unter pharmakologischer Stimulation können sie jedoch die Autophagie aktivieren. Daher ist die Bestimmung der autophagischen Konzentrationen in dieser Zelllinie nützlich, um die möglichen direkten oder indirekten Auswirkungen verschiedener pharmakologischer oder biologischer Wirkstoffe auf die Autophagie zu untersuchen 8,9.
Das duktale Pankreas-Adenokarzinom ist aufgrund seiner späten Diagnose und seiner hohen Chemotherapieresistenz eine der tödlichsten Krebsarten10. Pankreaskarzinomzellen weisen aufgrund der transkriptionellen Hochregulation und posttranslationalen Aktivierung von Autophagie-verwandten Proteinen eine hohe Autophagieaktivität auf11. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen können ihre Autophagie als Reaktion auf ungünstige Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel oder Chemotherapie-induzierte Schäden anpassen11. Daher kann die Analyse des Autophagieniveaus in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen helfen zu verstehen, wie sie sich an unterschiedliche Umgebungen anpassen, und die Wirksamkeit von autophagiemodulierenden Behandlungen bewerten.
Diese Studie zeigt eine Methode zur Durchführung von LC3-Immunfluoreszenz in zwei verschiedenen zellulären Modellen der Bauchspeicheldrüse. Das erste Modell, PANC-1-Zellen, diente als Modell für das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse. Diese Zellen wurden mit Gemcitabin behandelt, einem Chemotherapeutikum, von dem bereits gezeigt wurde, dass es Autophagie induziert, insbesondere in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, die das onkogene Kirsten-Rattensarkomvirus-Gen (KRAS) tragen12,13. Das zweite Modell, AR42J-Zellen, diente als physiologischeres Modell exokriner Pankreaszellen. Diese Zellen wurden mit Dexamethason differenziert, um den azinären Pankreaszellen ähnlicher zu werden14. In diesen Zellen wurde die Autophagie pharmakologisch durch die Verwendung von PP242 induziert, das ein potenter mTOR-Inhibitor ist15. In dieser Studie demonstrieren wir die Anwendbarkeit des beschriebenen Protokolls mit zwei verschiedenen Pankreasmodellen und seine Fähigkeit, zwischen Zuständen niedriger und hoher Autophagie zu unterscheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zellvorbereitung
- Tränken Sie 12 mm runde Deckgläser in absolutem Ethanol und legen Sie sie senkrecht in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
- Entfernen Sie die Abdeckung und setzen Sie die Multi-Well-Platte 15 Minuten lang ultravioletter Strahlung aus.
- Positionieren Sie die Deckgläser horizontal und waschen Sie sie mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
- Säen Sie eine geringe Anzahl von Pankreaszellen. Die Menge sollte so angepasst werden, dass am Tag der Fixierung eine Konfluenz von 50%-75% erreicht wird16.
HINWEIS: Es wird empfohlen, 2,5 × 10 4 PANC-1 oder 4 × 104 AR42J-Zellen pro Vertiefung zu säen, um die Zellen nach 3 Tagen zu fixieren. - Kultur der Zellen in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem Inkubator bei 37 °C unter befeuchteter Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid (CO2).
HINWEIS: Für PANC-1-Zellen wird empfohlen, die Zellen zwischen der Zellaussaat und den folgenden Schritten 2 Tage lang zu inkubieren. Nach dieser Zeit können die Zellen transfiziert, behandelt oder fixiert werden. Dieses Protokoll veranschaulicht beispielhaft die Behandlung mit Gemcitabin in nicht-transfizierten PANC-1-Zellen und die Differenzierung und PP242-Behandlung bei nicht-transfizierten AR42J-Zellen.
2. Behandlung der Zellen
- Gemcitabin-Behandlung für PANC-1-Zellen
- Bereiten Sie 2 Tage nach der Aussaat eine Lösung von 1 μg/μl Gemcitabin in DMEM vor. Behandeln Sie jede Vertiefung mit 2,6 μl der 1 μg/μl Gemcitabinlösung, um eine endgültige Verdünnung von 20 μM zu erreichen.
- Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden im Inkubator.
- AR42J-Differenzierung und PP242-Behandlung
- Bereiten Sie eine Lösung von 4 μg/ml Dexamethason in DMEM vor.
- Behandeln Sie jede Vertiefung mit 4,9 μl 4 μg/ml Dexamethasonlösung, um eine endgültige Verdünnung von 100 nM zu erhalten.
- Inkubieren Sie die Zellen für 48 Stunden im Inkubator.
- Entfernen Sie das Medium und behandeln Sie jede Vertiefung mit 0,5 μl 1 mM PP242, um eine endgültige Verdünnung von 1 μM zu erhalten.
- Inkubieren Sie die Zellen für 2 Stunden im Inkubator.
3. Fixierung und Permeabilisierung der Zellen
- Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit kaltem Methanol und eine 6-Well-Platte mit kaltphosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mMKH2PO4) vor. Halte sie auf Eis.
- Nehmen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette, waschen Sie es zweimal in PBS und inkubieren Sie es 6 Minuten lang in Methanol.
4. Blockieren der Zellen
- Waschen Sie jedes Deckglas zweimal in PBS und inkubieren Sie es 1 h lang in 10%igem fötalem Kälberserum in PBS (Blockierlösung).
HINWEIS: In diesem Schritt kann das Protokoll angehalten werden. Die Deckgläser können über Nacht im Kühlschrank in der Blockierlösung aufbewahrt werden, und das Protokoll kann am nächsten Tag fortgesetzt werden.
5. Inkubation der Deckgläser mit dem Primärantikörper
- Bereiten Sie eine 1:1.000-Lösung von Anti-LC3 in der Blockierlösung vor und halten Sie sie auf Eis.
- Legen Sie ein Stück Laborversiegelungsfolie über den Multiwell-Deckel.
- Geben Sie einen Tropfen (25 μl) pro Deckglas der Anti-LC3-Lösung auf die Versiegelungsfolie.
- Nehmen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette und legen Sie es über den primären Antikörpertropfen, wobei Sie darauf achten sollten, dass die Zellseite mit der Lösung in Kontakt kommt.
- Bereiten Sie eine feuchte Kammer vor, indem Sie ein feuchtes Stück Papier in eine Plastikbox mit flachem Boden legen.
- Legen Sie die Multiwell-Platte in die Feuchtigkeitskammer, decken Sie sie mit Folie ab und inkubieren Sie sie über Nacht im Kühlschrank.
6. Inkubation der Deckgläser mit dem Sekundärantikörper
- Nehmen Sie die Multi-Well-Platte aus der Feuchtigkeitskammer und legen Sie die Deckgläser wieder in die Multi-Well-Platte.
- Führen Sie drei Wäschen mit PBS durch.
- Bereiten Sie eine Lösung aus fluoreszenzmarkiertem Anti-Kaninchen mit einer Verdünnung von 1:800 in der Blockierlösung vor und bewahren Sie sie lichtgeschützt auf Eis auf.
- Legen Sie ein Stück Siegelfolie über den Multiwell-Deckel.
- Geben Sie einen Tropfen (25 μl) pro Deckglas der Anti-Kaninchen-Lösung auf die Versiegelungsfolie.
- Nehmen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette und legen Sie es über den primären Antikörpertropfen, wobei Sie darauf achten sollten, dass die Zellseite mit der Lösung in Kontakt kommt.
- Inkubieren Sie die Multiwell-Platte in der Feuchtekammer für 2 h bei Raumtemperatur (RT) lichtgeschützt.
7. Färbung der Zellen mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)
- Nehmen Sie die Multi-Well-Platte aus der Feuchtigkeitskammer und legen Sie die Deckgläser wieder in die Multi-Well-Platte.
- Führen Sie drei Wäschen mit PBS durch.
- Bereiten Sie eine 300-nM-DAPI-Lösung in PBS (lichtgeschützt) vor.
- Inkubieren Sie jedes Deckglas 10 Minuten lang mit der DAPI-Lösung.
- Führen Sie drei Wäschen mit PBS durch. Bewahren Sie die Multi-Well-Platte vor Licht geschützt auf.
8. Montage
- Bereiten Sie zwei Becher mit Wasser und einem Blatt Papier vor.
- Geben Sie einen Tropfen (10 μl) pro Deckglas einer Polyvinylalkohol-Bis(trimethylalumin)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octan-Addukt-Lösung (PVA-DABCO) auf einen Objektträger.
HINWEIS: PVA-DABCO wird durch die Kombination von 0,25 M DABCO, 10 % W/V PVA, 20 % Glycerin und 50 % Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) in Reinstwasser hergestellt. - Nehmen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette, waschen Sie es in jedem Wasserbecher, trocknen Sie es im Papier ab und legen Sie es über den PVA-DABCO-Tropfen (wobei die Zellen mit der Lösung in Kontakt kommen).
- Über Nacht lichtgeschützt trocknen lassen.
9. Konfokale Mikroskopiebetrachtung und Bildaufnahme
- Visualisieren Sie die Deckgläser in einem inversen konfokalen Mikroskop mit einem Objektiv von etwa 63x17.
- Nehmen Sie repräsentative Bilder der markierten Zellen auf.
10. Quantifizierung der LC3-Punkte
- Ziehen Sie jede Bilddatei, die die erfassten Kanäle enthält, z. B. ".czi", per Drag & Drop in den ImageJ (FIJI)-Bildschirm, um sie zu öffnen. Klicken Sie im Dialogfeld auf OK und schließen Sie das Konsolenfenster .
- Wählen Sie auf der Registerkarte " Bild " die Option " Farbe" > "Kanäle teilen" aus.
- Schließen Sie die Bilder, die den anderen Kanälen als dem LC3-Bild entsprechen.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Bild die Option > Farbbalance anpassen aus
- Verschieben Sie den Schieberegler "Maximum " nach links, bis das Bild gesättigt ist, um die Zellenkonturen zu visualisieren.
- Zeichnen Sie den Zellenumriss mit dem Freihandauswahl-Werkzeug .
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen , um die Farbanpassung zurückzusetzen.
- Wählen Sie auf der Registerkarte " Bearbeiten " die Option "Ausschneiden " aus, um das ausgewählte Element auszuschneiden.
- Schließen Sie das Bild, ohne es zu speichern.
- Wählen Sie auf der Registerkarte " Bearbeiten " die Option " Einfügen" aus.
- Wählen Sie im Menü " Analysieren " das Werkzeug " Zähler für 3D-Objekte" aus.
- Legen Sie den Schwellenwert fest. Im Beispiel dieser Studie ist der Schwellenwert auf 2.000 festgelegt.
- Legen Sie den Größenfilter fest. In dieser Studie liegt sie zwischen 50 und 500.
- Achten Sie darauf, dass die Kästchen Objekte und Zusammenfassung markiert sind.
- Klicken Sie auf OK. Die Anzahl der Punkte wird in der Zusammenfassung als erkannte Objekte beschrieben.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des LC3-Immunfluoreszenzprotokolls. Schematische Darstellung, die das allgemeine Protokoll für die LC3-Immunfluoreszenz darstellt. Mit BioRender.com erstellte Figur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieses Protokoll führt die Immunfluoreszenz von LC3 in Pankreaszelllinien durch, um die Autophagieniveaus unter verschiedenen Bedingungen zu bestimmen. Das Ergebnis dieses Experiments war die Gewinnung zellulärer Bilder aus dem roten und blauen Kanal, die LC3 und DAPI entsprechen. Die LC3-Bilder zeigen die zelluläre Verteilung dieses Proteins, während die DAPI die Kernlokalisation zeigt. Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Bild der Immunfluoreszenz von LC3 und seiner Verschmelzung mit der DAPI-Färbung in PANC-1-Zellen unter basalen oder Gemcitabin-Behandlungsbedingungen. Eine Reihe von Bildern der LC3-Färbung wurde mit dem Tool 3D Objects Counter in FIJI analysiert. Mit dieser Software wurde die Anzahl der LC3-Punkte pro Zelle quantifiziert. Das Balkendiagramm in Abbildung 2B zeigt die Ergebnisse der LC3-Punktquantifizierung in PANC-1-Zellen unter basalen im Vergleich zu Gemcitabin-Behandlungsbedingungen. In dieser Grafik stiegen die LC3-Punkte unter Gemcitabin-Behandlung signifikant an, wobei die Anzahl der LC3-Punkte direkt auf die autophagische Aktivität hinweist. Wir haben auch bereits gezeigt, dass Gemcitabin Autophagie in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen auslöst12. Insgesamt ermöglicht die in diesem Artikel vorgestellte Methode den Nachweis des Anstiegs der durch Gemcitabin induzierten Autophagie-Aktivierung in diesen Zellen.
Während sich dieses Protokoll auf die Verwendung der LC3-Immunfluoreszenz zur Bestimmung der autophagischen Aktivität in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen konzentriert, könnte es möglicherweise auf andere Zelllinien angewendet werden, einschließlich physiologisch relevanterer Modelle. Um die Wirksamkeit der Methode bei der Beurteilung physiologischer Reaktionen zu testen, wurde die AR42J-Zelllinie verwendet. Obwohl diese Zellen aus einem exokrinen Pankreastumor der Ratte stammen, können sie mit Glukokortikoidstimulation in exokrine Zellen differenziert werden, was sie zu einem geeigneten Pankreasmodell macht 8,14,18. Die AR42J-Zellen wurden mit 100 nM Dexamethason für 48 h differenziert, gefolgt von einer Behandlung mit dem mTOR-Inhibitor PP242, um Autophagie zu induzieren15. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt, die einen signifikanten Anstieg der Anzahl der LC3-Punkte pro Zelle unter der PP242-Behandlung zeigt.
Bisher konnten wir zeigen, dass die vorgestellte Methode sowohl für die Beurteilung der autophagischen Aktivität in Krebszellen als auch in einem physiologischeren Modell effektiv ist. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass geringfügige Abweichungen vom vorgestellten Protokoll zu nicht interpretierbaren Ergebnissen führen können.
Abbildung 4A zeigt ein repräsentatives Bild aus einem suboptimalen Experiment, bei dem zu viele Zellen auf den Deckgläsern ausgesät wurden und eine übermäßige Konfluenz erzielt wurde. Diese Art von Experiment kann aus verschiedenen Gründen nicht interpretiert werden. Zum einen stammen die in dieser Arbeit erwähnten Zelltypen aus der exokrinen Bauchspeicheldrüse, wo die Zellen in Acini gruppiert sind. Bei einem übermäßigen Zusammenfluss neigen diese Zellen dazu, sich zu stapeln und übereinander zu wachsen (wie z. B. Zelle 1 und Zelle 2 in Abbildung 4A, die sich über Zelle 3 und Zelle 4 befinden). Dieses Phänomen macht es praktisch unmöglich zu wissen, zu welcher Zelle die LC3-Punkte gehören, was es sehr schwierig macht, die Anzahl der Punkte pro Zelle abzuschätzen. Auf der anderen Seite neigen Zellen mit hoher Konfluenz dazu, gestresst zu sein, was die Autophagie auslöst. Infolgedessen könnten sich die Unterschiede in den autophagischen Konzentrationen zwischen den Kontrollzellen und den behandelten Zellen aufgrund einer Zunahme der autophagischen Hintergrundaktivität verringern.
In Abbildung 4B ist ein repräsentatives Bild aus einem anderen suboptimalen Experiment zu sehen, bei dem die Zellen mit Paraformaldehyd anstelle von Methanol fixiert wurden. Während diese Fixierungsmethode im Allgemeinen für die Konservierung einer Vielzahl von Proteinen wirksam ist, ist sie für LC3 nicht geeignet, da das resultierende Bild seine wahre Verteilung nicht genau widerspiegelt. Dieser technische Fehler könnte es unmöglich machen, Unterschiede zwischen niedrigen und hohen autophagischen Konzentrationen zu finden.
Im Allgemeinen können Zelllinien 1 Tag nach der Aussaat behandelt, transfiziert oder fixiert werden. Es ist jedoch wichtig zu erwähnen, dass im Falle von PANC-1-Zellen nach der Aussaat 2 Tage gewartet werden muss, um die vollständige Haftung der Zellen auf den Glasdeckgläsern sicherzustellen, bevor mit den nachfolgenden Schritten des Experiments fortgefahren wird. Abbildung 4C zeigt ein repräsentatives Bild aus einem Experiment, bei dem die Zellen nur 1 Tag nach der Aussaat mit Gemcitabin behandelt wurden. Aus der Abbildung ist ersichtlich, dass die Zellen in diesem Experiment eine runde Form hatten. Diese Morphologie verringerte die Beziehung zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern, was es schwierig machte, die intrazelluläre Verteilung von LC3 zu verstehen und zwischen niedrigen und hohen autophagischen Konzentrationen zu unterscheiden. Es ist wichtig zu beachten, dass AR42J dieses Problem nicht hat und am Tag nach der Aussaat behandelt oder repariert werden kann.
Ein weiteres suboptimales Ergebnis könnte erzielt werden, wenn der Zeitpunkt der Methanolfixierung variiert wird. Kürzere Fixierungszeiten können zu einer unvollständigen Fixierung führen, wie in Abbildung 4D dargestellt, wo die Zellen für 3 Minuten fixiert wurden. Eine unvollständige Fixierung kann die ordnungsgemäße LC3-Immunmarkierung beeinträchtigen, was zu unklaren Bildern und einer suboptimalen Quantifizierung führt.
Abbildung 2: LC3-Immunfluoreszenz in PANC-1-Zellen unter basalen oder Gemcitabin-Bedingungen und LC3-Punktquantifizierung. Die PANC-1-Zellen wurden entweder 24 h lang mit 20 μM Gemcitabin behandelt oder unbehandelt gelassen und anschließend mit anti-LC3 immunmarkiert. (A) Repräsentative Bilder jeder Bedingung werden angezeigt. Maßstabsbalken: 10 μm. (B) Das Balkendiagramm stellt die Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte (REM) der LC3-Punkte pro Zelle für jede Bedingung dar. N = 10 Zellen pro Bedingung aus drei unabhängigen Experimenten. p < 0,001 durch einen Student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: LC3-Immunfluoreszenz in AR42J-Zellen unter basalen oder PP242-Bedingungen und LC3-Punktquantifizierung. Die AR42J-Zellen wurden mit 100 nM Dexamethason für 48 h differenziert und dann entweder mit 1 μM PP242 für 2 h behandelt oder unbehandelt gelassen, gefolgt von einer Immunmarkierung mit anti-LC3. (A) Repräsentative Bilder jeder Bedingung werden angezeigt. Maßstabsbalken: 10 μm. (B) Das Balkendiagramm stellt die Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte (REM) der LC3-Punkte pro Zelle für jede Bedingung dar. N = 10 Zellen pro Bedingung aus drei unabhängigen Experimenten. ** p < 0,01 durch den t-Test eines Schülers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Suboptimale Experimente. Gezeigt werden repräsentative Bilder der LC3-Immunfluoreszenz in suboptimalen Experimenten. Maßstabsbalken: 10 μm. (A) Überschüssige Konfluenz: 7 × 104 PANC-1-Zellen wurden ausgesät, mit Gemcitabin behandelt und mit anti-LC3 immunmarkiert. Vier Zellen sind markiert, um anzuzeigen, dass Zelle 1 und Zelle 2 über Zelle 3 und Zelle 4 liegen. (B) PFA-Fixierung: PANC-1-Zellen wurden mit Gemcitabin behandelt, mit PFA fixiert und mit Anti-LC3 immunmarkiert. (C) Unvollständige Streckung: PANC-1-Zellen wurden am Tag nach der Aussaat mit Gemcitabin behandelt und mit Anti-LC3 immunmarkiert. (D) Unvollständige Fixierung: PANC-1-Zellen wurden mit Gemcitabin behandelt, 3 min lang mit Methanol fixiert und mit Anti-LC3 immunmarkiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die in diesem Protokoll beschriebene Methode ermöglicht es, die endogene LC3-Verteilung in der Zelle zu visualisieren und die autophagischen Konzentrationen unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren. Eine weitere ähnliche Methode zur Analyse der LC3-Verteilung und zur Bestimmung der Autophagieaktivierung ist die fluoreszenzmarkierte LC3-Transfektion (z. B. RFP-LC3)19. Die RFP-LC3-Transfektion hat den Vorteil, dass keine Fixierung erforderlich ist (was die Anwendung dieser Methode in der Lebendzellbildgebung ermöglicht20), billiger ist und nicht von der Reaktivität des LC3-Antikörpers abhängt. Andererseits hat die Immunfluoreszenz von LC3 den Vorteil, dass sie ein Bild des endogenen LC3 liefert und so mögliche Probleme im Zusammenhang mit der Überexpression von LC3 vermeidet, wie z. B. die Bildung von Proteinaggregaten, die unabhängig von der Autophagie sind21. Darüber hinaus hängt diese Methode nicht von der Leichtigkeit der Transfizierung der Zellen ab, was bedeutet, dass sie auf verschiedene Zelllinien anwendbar ist. Abhängig vom verwendeten LC3-Antikörper und seiner Reaktivität gibt es jedoch einige zelluläre Linien, in denen er möglicherweise nicht funktioniert. Einige Antikörper können bei bestimmten Spezies gut funktionieren, bei anderen jedoch nicht, selbst wenn sie theoretisch mit verschiedenen Spezies kompatibel sind. Im Fall des in diesem Protokoll verwendeten Antikörpers (LC3B D11) haben wir festgestellt, dass er perfekt für menschliche Zellen (PANC-1, HEK293T, HeLa) und Rattenzellen (AR42J) funktioniert. Es funktioniert jedoch nicht für Mauszellen (MEF-Zellen), da wir eine unspezifische Kernfärbung beobachtet haben. Es ist erwähnenswert, dass die Quantifizierung von LC3-Spots, ob endogen oder überexprimiert, Einschränkungen bei der Unterscheidung zwischen Veränderungen in der Autophagie-Aktivierung, die auf eine erhöhte Produktion von LC3-II hinweisen können, und Veränderungen im LC3-II-Abbau, die auf einen autophagischen Flusszustand hinweisen können, aufweist. Mit weiteren Methoden kann die Autophagieaktivität umfassend beurteilt werden. Zum Beispiel kann die Verwendung der RFP-GFP-LC3-Expression eine genaue Beurteilung ermöglichen, indem zwischen LC3-II innerhalb und außerhalb des Lysosoms unterschiedenwird 22,23.
Wie in Abbildung 4 dargestellt, gibt es einige kritische Schritte im Protokoll, die nicht geändert werden dürfen, da ihre Änderung zu suboptimalen Ergebnissen führen kann. Zunächst ist es wichtig, die richtige Anzahl der zu säenden Zellen einzustellen. Wenn nicht genügend Zellen ausgesät werden, neigen sie dazu, Transfektion oder Behandlungen nicht zu widerstehen und bleiben rund. Im Gegenteil, wenn Zellen im Übermaß ausgesät werden, neigen sie dazu, auf den Nachbarzellen zu wachsen, was es schwierig macht, sich auf einzelne Zellen zu konzentrieren und zwischen ihren LC3-Punkten zu unterscheiden. Insbesondere in Situationen, in denen sich Zellen in unmittelbarer Nähe befinden, sich aber nicht überlappen, wie in 4A dargestellt, kann es hilfreich sein, eine Immunfärbung mit spezifischen Membranmarkern, wie z. B. EGFR, zu verwenden, um zwischen den positiven Markern zu unterscheiden, die zu jeder Zelle24 gehören. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bestimmte Marker wie E-Cadherin und EpCAM aufgrund ihrer reduzierten Membranexpression, die sich aus dem typischen epithelial-mesenchymalen Übergangsprozess dieses Zelltyps ergibt, für diesen Zweck in PANC-1-Zellen nicht geeignet sind25,26,27. Zweitens ist es bei der Arbeit speziell mit PANC-1-Zellen wichtig, mindestens 1 Tag zwischen der Aussaat und den nachfolgenden Schritten des Experiments zu warten. Umgekehrt können die Zellen, wenn man nicht auf den richtigen Zeitpunkt wartet, abgerundet werden, was die Interpretation der Ergebnisse erschwert. Drittens ist die Fixierung ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Wie wir gezeigt haben, funktioniert die Methode nur mit einer adäquaten Methanolfixierung. Die Paraformaldehyd-Fixierung funktioniert bei der LC3-Immunmarkierung nicht korrekt, während die Methanol-Fixierungszeit nicht verändert werden sollte, da kürzere Zeiten zu einer unvollständigen Fixierung führen können. Wir testeten Methanol-Fixierungszeiten von bis zu 1 h und beobachteten keine Unterschiede in der LC3-Markierung. Dennoch raten wir von der Verwendung längerer Fixierungszeiten ab, da die Methanolfixierung zum Verlust löslicher zellulärer Proteine und frei fluoreszierender Moleküle führen kann28. Daher wird empfohlen, die Standard-Fixierzeit einzuhalten, um präzise und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten.
Einige Änderungen können im beschriebenen Protokoll akzeptiert werden. Zum Beispiel kann eine 12-Well-Platte anstelle der 24-Well-Platte verwendet werden, sowie die Zellen über 15 mm runde Deckgläser anstelle von 12-mm-Deckgläsern wachsen lassen. In diesem Fall ist zu berücksichtigen, dass die Anzahl der zu säenden Zellen sowie die Mengen der verwendeten Reagenzien größer sind als die in diesem Protokoll beschriebenen. In diesem Fall sollten 4 × 10 4 PANC-1 und 6,5 × 104 AR42J gesetzt werden. Darüber hinaus kann die verwendete Blockierungslösung durch andere ersetzt werden, z. B. durch 1 % BSA in PBS, was zu ähnlichen Ergebnissen führen würde. Auf die gleiche Weise konnte die Sperrzeit auf bis zu 24 h erhöht werden, ohne die Ergebnisse wesentlich zu verändern. Die Inkubationszeiten und die Konzentration der Antikörper können angepasst werden und sich beispielsweise ändern, wenn ein anderer LC3-Antikörper verwendet wird. Obwohl in dieser Studie eine PVA-DABCO-Lösung vorbereitet wird, können auch kommerzielle Montagelösungen verwendet werden. Andererseits kann die Quantifizierungsmethode modifiziert werden. Zum Beispiel ist es möglich, einige Filter oder Masken auf die Bilder anzuwenden, und ein alternatives Werkzeug kann für die Punktquantifizierung verwendet werden.
In dieser Arbeit haben wir die Anwendung der Immunfluoreszenz von LC3 geleitet, um das Verhalten von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zu untersuchen. In diesen Zellen ist die Autophagie basal aktiviert und kann als Reaktion auf verschiedene Stresssituationen wie Chemotherapie, Hypoxie oder Nährstoffmangel moduliert werden11,12. Die Bestimmung der Autophagie in diesen Zellen könnte auf die Untersuchung der zellulären Reaktion auf Chemotherapie, Strahlentherapie oder andere Behandlungen, die die Autophagie modulieren, anwendbar sein. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kann die vorgestellte Methode in physiologischen Modellen angewendet werden. Obwohl wir uns in dieser Arbeit auf die Quantifizierung der autophagischen Konzentrationen konzentriert haben, könnte die Immunfluoreszenz von LC3 auch die Bewertung der Kolokalisation zwischen LC3 und verschiedenen Proteinen ermöglichen. Es kann zum Beispiel als mechanistischer Ansatz dienen, um Proteine an verschiedenen Punkten des autophagischen Prozesses zu markieren und zu bewerten, ob die Kolokalisation mit LC3 durch einige Behandlungen oder durch die Herunterregulierung einiger Proteine beeinflusst wird. Auf diese Weise konnte beispielsweise festgestellt werden, ob ein Autophagie-Inhibitor den autophagischen Fluss vor oder nach der LC3-Konjugation unterbricht. Schließlich kann die Methode auch an Gewebeproben angepasst werden, um die Autophagie-Aktivierung in Tiermodellen oder humanen Biopsieproben zu bestimmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Universität Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), des Nationalen Rates für wissenschaftliche Forschung und Technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; und PUE 22920170100033) und der Nationalen Agentur für wissenschaftliche und technologische Förderung (PICT 2019-01664) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A.
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E.
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T.
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N.
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
