Das Auge enthält durchsichtige Medien, denen Blutgefäße fehlen, einschließlich der Hornhaut, der Augenlinse und des Glaskörpers. Das Licht muss diese Medien passieren, bevor es die Photorezeptoren auf der Rückseite der Netzhaut erreicht. Insbesondere der Hornhaut, der Augenlinse und dem Glaskörper fehlen Blutgefäße, um die Absorption des Lichts und die Verzerrung der Bilder zu vermeiden1. Die retinalen Blutgefäße sind in drei Schichten unterteilt: die oberflächliche Schicht, die sich von der Sehscheibe bis zur Peripherie innerhalb der Nervenfaserschicht erstreckt; die mittlere Schicht, die sich innerhalb der inneren plexiformen Schicht befindet; und die tiefe Schicht, die durch die äußere plexiforme Schicht verteilt ist. Dieses Gefäßnetzwerk versorgt die innere Netzhaut mit Blut, während die Photorezeptoren durch Diffusion aus den Aderhautgefässen versorgt werden. Die Ernährung der inneren und äußeren Netzhaut wird streng durch die innere und äußere Blut-Netzhaut-Schranke (BRBs) kontrolliert. Retinale Endothelzellen, Perizyten und Gliazellen bilden das innere BRB. Auf der anderen Seite bilden retinale Pigmentepithelzellen (RPE), choroidale Endothelzellen und die Bruch-Membran das äußere BRB. Krankhafte Veränderungen der retinalen Blutgefäße sind Kennzeichen verschiedener Netzhauterkrankungen, wie z. B. der diabetischen Retinopathie, der altersbedingten Makuladegeneration und der Frühgeborenenretinopathie. Zu diesen pathologischen Veränderungen gehören unter anderem Gefäßentzündungen, der Abbau des BRB, Kapillardegeneration, Veränderungen des retinalen Blutflusses und pathologische retinale Neovaskularisationen (RNV)2,3,4. Daher ist es wichtig, effektive Methoden zu entwickeln, um diese Veränderungen sowohl in vivo an Versuchstieren als auch in vitro durch die Kultivierung verschiedener Netzhautzellen unter Bedingungen zu untersuchen, die der biologischen und biochemischen Umgebung bei menschlichen Krankheiten ähneln. Forscher können verschiedene experimentelle Ansätze verwenden, um die zugrunde liegenden molekularen und zellulären Mechanismen von retinalen Gefäßerkrankungen zu entschlüsseln. Das Ziel dieser Methodensammlung ist es, die Expertise von Sehwissenschaftlern und Augenärzten in Bezug auf Methoden zur Untersuchung der normalen Gefäßentwicklung und der Gefäßanomalien bei verschiedenen Netzhauterkrankungen mit anderen Forschern zu teilen.
Der Artikel von Damsgaard et al. stellt eine flussverstärkte Ultraschallmethode vor, die es den Untersuchern ermöglicht, die Augengefäße ohne den Einsatz von Kontrastmitteln dreidimensional abzubilden5. Diese Methode überwindet die Einschränkungen anderer Methoden aufgrund ihrer Stabilität bei der Abbildung des Auges hinter der pigmentierten Netzhaut. Obwohl die Methode bereits an Goldfischen demonstriert wurde, kann sie auf alle anderen experimentellen Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen angewendet werden. Diese Methode ist wertvoll für die Visualisierung der okulären Blutgefäße unter normalen und pathologischen Bedingungen und könnte bei der Untersuchung des okulären Blutflusses hilfreich sein. Diese Methode ist jedoch durch den Mangel an kernhaltigen roten Blutkörperchen bei Säugetieren eingeschränkt. Im Vergleich zu Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen erzeugt der flussverstärkte Ultraschall also nur bei Säugetieren einen Blutflusskontrast. Darüber hinaus reagiert diese Methode empfindlich auf Bewegungsgeräusche, z. B. durch Atembewegungen, die verschwommene Bilder und Artefakte erzeugen können. Dieses Bewegungsgeräusch kann durch prospektives oder nachträgliches Gating angepasst werden. Sowohl bei 2D- als auch bei 3D-Aufnahmen ist es entscheidend, Bewegungsartefakte zu begrenzen, die durch die Bewegung des Tieres aufgrund einer unzureichenden Anästhesie oder eines instabilen Schallkopfaufbaus verursacht werden. Die Entwicklung dieser Technik ebnet den Weg für die nicht-invasive in vivo Untersuchung der tiefen Gefäßnetzwerke im Auge bei der überwiegenden Mehrheit der Wirbeltiere, die kernhaltige Erythrozyten besitzen.
Die von Macouzet-Romero et al. vorgestellte Methode evaluiert den relativen Beitrag der retinalen Gefäße zur Makulaperfusionsdichte mittels optischer Kohärenztomographie (OCT)-Angiographie6. Mit dieser Methode wird der Anteil einer Fläche charakterisiert, der aus erweiterten Gefäßen durchblutet ist. Bemerkenswert ist, dass eine Gefäßerweiterung eine Reaktion auf pathologische Zustände sein kann. Dieser Ansatz kann indirekt die Vasodilatation skizzieren und indirekt eine geringe Sauerstoffversorgung bei retinalen Gefäßerkrankungen wie der diabetischen Retinopathie (DR), dem Zentralvenenverschluss oder der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) identifizieren. Mit dieser Methode waren die wichtigsten Ergebnisse von Macouzet-Romero et al.6 , dass der Beitrag von Gefäßen, die größer als die retinalen Kapillaren sind, zur Netzhautzirkulation bei gesunden Probanden 18,2 % betrug. Somit könnte dieser Prozentsatz als Referenz verwendet werden, um frühe Veränderungen der Perfusionsdichte aufgrund von retinalen Gefäßerkrankungen zu identifizieren. Zum Beispiel betrug der prozentuale Beitrag 2,6 % bei Patienten mit arterieller Hypertonie und 16,4 % bei Patienten mit Diabetes, was darauf hindeutet, dass diese Methode möglicherweise zur Bewertung des Fortschreitens von Netzhauterkrankungen im Zusammenhang mit Gefäßanomalien verwendet werden könnte.
Die von Subirada et al. vorgestellte Methode bewertet verschiedene Parameter von Gefäßveränderungen (das Ausmaß der Kapillardegeneration [avaskuläre Bereiche], pathologische retinale Neovaskularisation [neovaskuläre Bereiche], Dilatation und Tortuosität der retinalen Arteriolen) in experimentellen Modellen ischämischer Retinopathien, wie z.B. der sauerstoffinduzierten Retinopathie (OIR) und dem experimentellen Diabetes7. Bemerkenswert ist, dass die OIR die Frühgeborenenretinopathie und einige Aspekte der proliferativen diabetischen Retinopathie reproduziert. Die Fähigkeit, das Ausmaß der retinalen Neovaskularisation (RNV) oder Kapillardegeneration in experimentellen Modellen zu quantifizieren, ist entscheidend für die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen und zellulären Mechanismen sowie für die Prüfung der möglichen therapeutischen Wirkungen pharmakologischer oder molekularer Interventionen. Zusammenfassend werden in diesem Artikel klassische, etablierte und reproduzierbare Techniken vorgestellt, um einige der relevantesten vaskulären Parameter zu quantifizieren, die in der klinischen Praxis berücksichtigt werden.
Der Artikel von Vaglienti et al. stellt Methoden zur Messung des Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Müller-Gliazellenvor 8. Die Rolle von oxidativem Stress bei der mikrovaskulären Dysfunktion der Netzhaut bei ischämischen Retinopathien wurde nachgewiesen und hat die Forscher dazu ermutigt, zu untersuchen, inwieweit reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sowohl in vivo als auch in vitro zum Abbau von BRB und RNV beitragen 9,10,11,12 . Vaglienti et al. verwenden 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFD), um das Ausmaß der intrazellulären Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu bewerten. Diese Methode basiert auf der Diffusion von DCFD in die Zelle und der anschließenden Oxidation von DCFD durch ROS zu 2', 7' -Dichlorfluorescein (DCF). DCF ist stark fluoreszierend und kann durch Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden. Mit dieser Methode kann das Ausmaß der ROS-Erzeugung sowohl in Netzhautzellen als auch in Geweben abgebildet und gemessen werden.
Der Artikel von Tomaszewski et al. zeigt die Isolierung und das Wachstum von retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) der Maus13. RPE-Zellen tragen zum äußeren BRB bei und spielen eine wesentliche Rolle bei der Hämostase und Integrität der Photorezeptoren. Die Dysfunktion von RPE-Zellen ist ein Kennzeichen verschiedener Netzhauterkrankungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf AMD und DR. Daher sind In-vitro-Studien zur Funktion von RPE-Zellen bei Gesundheit und Krankheit entscheidend für das Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen verschiedener vaskulärer Netzhauterkrankungen. Zu diesem Zweck könnte die Isolierung von primären RPE-Zellen ein wichtiges Instrument sein, um die zugrundeliegenden Mechanismen und die Pathogenese verschiedener Augenkrankheiten zu untersuchen und neue therapeutische Anwendungen für diese Krankheiten vorzuschlagen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Veränderungen in der Struktur und Funktion von RPE-Zellen und deren Auswirkungen auf das äußere BRB bei AMD und DR. Darüber hinaus kann die Technik angewendet werden, um Veränderungen in RPE-Zellen zu untersuchen, die aus Wildtyp-C57BL6-Mäusen und verschiedenen genetisch veränderten Mäusen isoliert wurden, und um verschiedene pharmakologische Verbindungen als therapeutische Ziele für AMD14 zu testen.
Der Artikel von Elmasry et al. stellt ein ex vivo experimentelles Modell vor, das zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen durch Kultivierung von retinalen Explantaten über einen längeren Zeitraum verwendet werden kann15. In diesem ex vivo-System präsentieren retinale Explantate intakte Gefäß- und Glianetzwerke sowie retinale Neuronen für bis zu 2 Wochen in Kultur. Organotypische retinale Explantate haben sich als zuverlässiges Werkzeug für die Untersuchung von Netzhauterkrankungen wie DR und degenerativen Netzhauterkrankungen erwiesen16,17. Im Vergleich zu anderen bestehenden Techniken unterstützt die Verwendung von retinalen Explantaten sowohl in vitro retinale Zellkulturen als auch in vivo Tiermodelle, indem sie eine einzigartige Funktion hinzufügen, die es ermöglicht, die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Netzhautzellen (z. B. Gefäß-, Glia- und neuronale Zellen) unter denselben biochemischen Parametern und unabhängig von systemischen Variablen zu untersuchen. Die Explantatkulturen halten verschiedene Netzhautzellen zusammen in derselben Umgebung und bewahren die interzellulären physikalischen und molekularen Interaktionen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass retinale Explantate die morphologische Struktur und Funktionalität der kultivierten Netzhautzellen erhalten können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass retinale Explantate eine geeignete Plattform darstellen können, um die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Netzhautzellen als Reaktion auf biochemische Veränderungen wie Hyperglykämie und Hypoxie zu untersuchen, ähnlich denen, die bei der diabetischen Retinopathie (DR) oder der Frühgeborenenretinopathie (ROP) beobachtet werden. Dieser Ansatz ermöglicht auch die Erprobung therapeutischer Interventionen in einem eingeschränkten biochemischen Umfeld. Die retinale Explantatkultur stellt eine kontrollierbare Technik und ein sehr flexibles experimentelles Modell dar, das zahlreiche pharmakologische Manipulationen ermöglicht und verschiedene molekulare Mechanismen von Netzhauterkrankungen aufdecken kann.