Überwachung der Stub1-vermittelten Pexophagie

Summary

Dieses Protokoll enthält Anweisungen zum Auslösen und Überwachen der Stub1-vermittelten Pexophagie in lebenden Zellen.

Abstract

Säugetierzellen können Peroxisomen durch Stub1-vermittelte Pexophagie umwandeln. Der Signalweg ermöglicht möglicherweise die zelluläre Kontrolle der Quantität und Qualität von Peroxisomen. Während dieses Prozesses translozieren das Hitzeschockprotein 70 und die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1 auf Peroxisomen, die umgedreht werden, um die Pexophagie zu initiieren. Die Aktivität der Stub1-Ligase ermöglicht die Akkumulation von Ubiquitin und anderen Autophagie-relevanten Modulen auf gezielten Peroxisomen. Eine Erhöhung des Spiegels der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im peroxisomalen Lumen kann die Stub1-vermittelte Pexophagie aktivieren. Man kann daher die farbstoffgestützte ROS-Generierung nutzen, um diesen Signalweg auszulösen und zu überwachen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Verwendung von zwei Klassen von Farbstoffen, fluoreszierenden Proteinen und synthetischen Fluorophoren, um die Pexophagie in Säugetierzellkulturen zu initiieren. Diese farbstoffgestützten Protokolle, die auf der ROS-Generierung basieren, können nicht nur verwendet werden, um alle Peroxisomen innerhalb einer Zellpopulation weltweit anzusprechen, sondern können auch die Manipulation einzelner Peroxisomen innerhalb einzelner Zellen ermöglichen. Wir beschreiben auch, wie die Stub1-vermittelte Pexophagie mit Hilfe der Lebendzellmikroskopie verfolgt werden kann.

Introduction

Peroxisomen sind an eine einzelne Membran gebundene Organellen, die in den meisten eukaryotischen Zellen vorkommen. Peroxisomen sind ein metabolisches Kompartiment, das für die Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren, den Purinkatabolismus und die Synthese von Etherphospholipiden und Gallensäuren unerlässlich^{ist 1}. Peroxisom-abgeleitetes Acetyl-CoA steuert die Lipidhomöostase, indem es die zentrale Signalübertragung im Stoffwechsel^{reguliert 2}. Daher ist es nicht verwunderlich, dass beeinträchtigte peroxisomale Funktionen bei verschiedenen Krankheiten impliziert sind, darunter neurodegenerati....

Protocol

1. Präparation von Zellen, die diKillerRed oder selbstmarkierende Proteine (SLPs) im Peroxisomlumen exprimieren

1. Säen Sie die gewünschten Zellen auf Zellkulturschalen mit Glasboden. Für das hier durchgeführte Experiment werden 2 x 10⁵ humane SHSY5Y-Zellen in 840 μl Nährmedium (DMEM/F-12 ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin) oder 6 x 10⁴ NIH3T3-Mäusezellen in 840 μl Nährmedium (DMEM ergänzt mit 10 % Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin) auf einer 35-mm-Kulturschale mit einem Glasmikroloch mit 20 mm Durchmesser aussaatgut.
   Anmerkungen: Die Anzahl der ausgesäten Zellen sollte propor....

Results

Das hier gezeigte Stub1-vermittelte Pexophagie-Induktionsschema nutzt die Vorteile der farbstoffgestützten ROS-Generierung innerhalb des Peroxisomlumens. Dieser Vorgang erfordert minimale Lichtintensitäten. Peroxisomen, die fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe enthalten, können daher mit handelsüblichen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen beleuchtet werden. Fokale Beleuchtung führt zu einer sofortigen und lokalisierten ROS-Produktion innerhalb einzelner Peroxisomen, wie der Fluoreszenzreporter roGFP2-VKSKL zeigt (<.......

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie Stub1-vermittelte Pexophagie in Zellkulturen ausgelöst werden kann, indem der peroxisomale ROS-Spiegel mit Licht erhöht wird. Da das Protokoll auf farbstoffgestützter ROS-Generierung beruht, muss eine ausreichende Expression von diKillerRed-VKSKL oder farbstoffmarkierten SLP-Liganden in den interessierenden Zellen sichergestellt werden. Angesichts der Tatsache, dass verschiedene Zelltypen oder Zellen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund Peroxisomen mit leicht unterschiedlichen Ei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm-Kulturschale mit einem Mikrotimul aus Glas mit 20 mm Durchmesser	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm
3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
Rinderserum	ThermoFisher Scientific	16170060
Zellkultur-Inkubator	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		hergestellt durch Anfügen des KillerRed Tandem-Dimers an PTS1 (VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	Das Rückgrat von EGFP-C1 wurde für die Klonierung von EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	verwendet Academia Sinica		Hsp70-Gen (HSPA1A) PCR, amplifiziert aus HeLa-cDNA und kloniert in EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgen	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		erzeugt durch Einfügen des humanen SQSTM1-Gens (durch PCR-Amplifikation der HeLa-Zell-cDNA) in EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		, erzeugt durch Einfügen des Maus-Stub1-Gens (durch PCR-Amplifikation der gesamten mausfarbenen Nieren-cDNA) in EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
fötales Rinderserum	ThermoFisher Scientific	10437028
HaloTag TMR-Ligand	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 angehängt und kloniert in EGFP-C1
Backbone HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Inverses Konfokalmikroskop	Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,   Mikroskop mit einem TOKAI HIT Kammerinkubator und dem UNIV2-D35 Schüsselaufsatz
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
Lipofectamin 2000	ThermoFisher Scientific	11668	Transfektionsreagenz
NIH3T3-Zellen	ATCC	CRL-1658	adhärent
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	reduziertes Serummedium
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplifiziert aus HeLa cDNA und kloniert intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		, erzeugt durch Anhängen von eroGFP (entnommen aus Addgene plasmid 20131) mit der Aminosäuresequenz VKSKL und kloniert in die EGFP-C1
SHSY5Y-Zelle	ATCC	CRL-2266	adhärent