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Tiere sind hochkomplexe Systeme, die aus Hunderten von verschiedenen Zelltypen bestehen, die in Dutzenden von verschiedenen Geweben und Organen organisiert sind. Die Untersuchung, wie Zellgruppen während der Embryonalentwicklung miteinander und mit ihrer Umgebung interagieren, ermöglicht uns nicht nur ein besseres Verständnis dafür, wie erwachsene Körper aufgebaut sind, sondern kann auch die molekularen und zellulären Grundlagen von Krankheiten und Geburtsfehlern aufdecken. Bestimmte Modellsysteme sind besser geeignet, spezifische biologische Fragestellungen zu beantworten als andere, und Wissenschaftler verwenden eine Vielzahl von Arten und experimentellen Techniken, um die gesamte Vielfalt der organismischen Biologie zu untersuchen. Ein bestimmtes entwicklungsbiologisches Experiment kann beispielsweise Gentechnik, Tiersektionen, Molekularbiologie, Biochemie und hochauflösende Mikroskopie umfassen. Es kann schwierig sein, solche Methoden allein auf der Grundlage schriftlicher Beschreibungen und Abbildungen zu reproduzieren, und daher ist es wichtig, sie in Videoform zu dokumentieren, um die Verbreitung der richtigen Technik und Analysemethoden zu fördern.
Die Beziehung zwischen Entwicklungsmechanismen und Regeneration, insbesondere im Nervensystem, ist ein Bereich, der von großem Interesse ist, und der Zebrafisch, Danio rerio, ist aufgrund seines lebenslangen Wachstums und seiner Regenerationsfähigkeit zu einem Schlüsselmodell auf diesem Gebiet geworden. Bemerkenswert ist, dass es ein komplexes Zusammenspiel zwischen Zellen in der Netzhaut und dem optischen Tectum gibt, und dieses Zusammenspiel ist notwendig, um die richtigen Verbindungen herzustellen, wenn neue Neuronen zu den Augen und zum Gehirn hinzugefügt werden1. Hagen et al. beschreiben eine Technik zur Charakterisierung, wie das neuronale Wachstum und die Entwicklung durch Denervation nach Augenentfernung bei lebenden Zebrafischembryonen beeinflusst werden2. Sie beschreiben im Detail, wie 1) eine Augenentfernungsoperation durchgeführt wird, 2) Larven nach der Operation kultiviert werden, 3) die Gehirnproben fixiert, präpariert und gelagert werden, 4) Immunfluoreszenz durchgeführt wird und 5) die Proben richtig montiert und abgebildet werden. Diese Technik kann verwendet werden, um eine Vielzahl von neurologischen Entwicklungsprozessen in fixierten Geweben zu untersuchen, und sie kann auch für Experimente an lebenden Embryonen modifiziert werden.
Neuralleistenzellen (NCCs) stellen eine wichtige Entwicklungslinie dar, aus der Pigmentzellen, Knorpel, Knochen, glatte Muskeln, Neuronen und Gliazellen hervorgehen, und diese Zellen sind an vielen Arten von Geburtsfehlern beteiligt3. Neben ihrer beeindruckenden Pluripotenz durchlaufen NCCs auch einen Übergang von Epithel zu Mesenchym, gefolgt von einer ausgedehnten Migration während der Entwicklung, was sie zu einem faszinierenden Paradigma für das Verständnis des Zusammenspiels zwischen Zellschicksal und Morphologie macht4. Hühnerembryonen sind ein leistungsfähiges System für die Untersuchung der NCC-Biologie, da NCCs in vivo visualisiert und ex vivo kultiviert werden können, was viele Arten von molekularen Behandlungen ermöglicht, die mit anderen Systemen schwierig sind. Jacques-Fricke et al. beschreiben ein flexibles Verfahren zur Kultivierung kranialer Neuralfalten zur Erzeugung primärer NCC-Kulturen auf Fibronektin-beschichteten Deckgläsern, an die dann Fixed-Imaging- oder Live-Imaging-Experimente folgen können5. Sie beschreiben, wie man 1) die Embryonen inkubiert und isoliert, 2) die Nervenfalten präpariert und plattiert, 3) die NCCs fixiert und färbt und 4) die NCC-Morphologie quantifiziert und analysiert.
Die Basalmembran – eine extrazelluläre Matrix, die entlang der basalen Oberfläche von Epithelzellen gebildet wird – ist entscheidend für die Etablierung der Gewebemorphologie und der Organfunktion bei Tieren6. Das Follikelepithel von Drosophila , das die sich bildende Eizelle umgibt, ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Bildung von Basalmembranen, da es alle wichtigen konservierten Bestandteile der Basalmembransezerniert 7 und die Matrix zur "Außenseite" der Eikammer hin ausgerichtet ist, was mikroskopische Analysen erleichtert8. Shah und Devergne beschreiben die Verwendung einer der beliebtesten Arten der hochauflösenden Mikroskopie – Airyscan – um zu untersuchen, wie sich der vesikuläre Transport auf die Bildung von Basalmembranen auswirkt9. Sie zeigen, wie man 1) Drosophila-Eierstöcke sammelt und fixiert, 2) Immunfluoreszenz durchführt, 3) die Proben richtig einfasst und 4) qualitativ hochwertige, hochauflösende Datensätze für die dreidimensionale Analyse erfasst. Wir weisen darauf hin, dass dieser Artikel ein äußerst nützliches und prägnantes Tutorial zur korrekten Erfassung von nicht gesättigten, dreidimensionalen konfokalen Datensätzen enthält, das für jeden, der Fluoreszenzbilder quantifizieren möchte, von allgemeinem Interesse sein sollte.
Mikroskopbasierte Superauflösungstechnologien (z. B. STED, SIM und Airyscan)10 werden zwar immer häufiger eingesetzt, sind aber teurer als konfokale Standardmikroskope und stehen nicht allen Forschern zur Verfügung. Eine alternative Technik zur Gewinnung hochauflösender Bilder ist die Expansionsmikroskopie (ExM), bei der eine biologische Probe physikalisch in drei Dimensionen vergrößert wird, indem sie in ein quellfähiges Hydrogel eingebettet und gebunden wird11. Die expandierten Proben können dann mit einem konfokalen Standardmikroskop visualisiert werden, um Bilder mit einer lateralen Auflösung in der Größenordnung von Dutzenden von Nanometern zu erzeugen, die mit anderen Arten der hochauflösenden Mikroskopiekonkurrieren 12. Unsere Gruppe beschreibt, wie ExM in Drosophila-Embryonen implementiert werden kann, um subzelluläre Merkmale des Aktomyosin-Zytoskeletts und der mitochondrialen Netzwerke aufzudecken, die mit der konfokalen Standardmikroskopie nicht nachweisbar sind13. Wir beschreiben, wie man 1) richtig inszenierte Embryonen auswählt, 2) Immunfluoreszenz durchführt, 3) die Embryonen für die Expansion vorbereitet und mountet, 3) die Embryonen verdaut und expandiert und 4) hochauflösende Datensätze sammelt. Diese Technik sollte für eine Vielzahl von biologischen Proben in der Größenordnung von 1 mm modifizierbar sein, so dass sie für eine Vielzahl von Biologielabors zugänglich ist.
Die Entwicklungsbiologie ist notwendigerweise ein äußerst erfinderisches und interdisziplinäres Gebiet, das sich auf Techniken aus verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen stützt, um die Zellbiologie, wie sie im Tier vorkommt, zu quantifizieren. Hier stellen wir vier entwicklungsbiologische Methoden im Zebrafisch, Küken und Fruchtfliegen vor, die sowohl klassische als auch hochmoderne Techniken zur Untersuchung der Zellmorphologie und der subzellulären Proteinlokalisierung während der Tierentwicklung umfassen. Derzeit konzentriert sich das Feld auf die Zusammenführung quantitativer Analysen der Zellmorphologie und des Zellverhaltens mit transkriptomischen und proteomischen Experimenten, um die gesamte Vielfalt der Moleküle und biomechanischen Kräfte aufzudecken, die die Entwicklung von Tieren steuern.