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Proteomik-Ansätze können den Nachweis und die Quantifizierung der Peptide, Proteine und spezifischen posttranslationalen Modifikationen (PTMs) umfassen, die in einem bestimmten zellulären Zustand vorhanden sind, sowie der Proteine, die in spezifischen Organellen oder makromolekularen Proteinkomplexen zusammenkommen. Die Proteomik ist ein vielfältiges Gebiet, das in allgemeine und quantitative Arbeitsabläufe unterteilt werden kann. Die quantitative Proteomik konzentriert sich auf die Bestimmung der Menge an Protein oder Protein-PTM in einer Probe. Die biologische Frage sollte vor der Durchführung eines Proteomik-Experiments berücksichtigt werden, um die am besten geeignete Probenvorbereitungs-, Sequenzierungs- und Datenanalysemethode zu bestimmen, die zur Beantwortung der Frage erforderlich ist. Proteine sind hochdynamisch und Massenspektrometer sind empfindlich gegenüber der Sequenzierung von Proteinen mit höherer Häufigkeit gegenüber weniger häufigen PTMs; Daher ist die Wahl der Arbeitsabläufe für die Probenvorbereitung und -sequenzierung von entscheidender Bedeutung. Diese Methodensammlung beschreibt Ansätze zur Quantifizierung bestimmter Arten von Proteinen mit modernsten MS-Methoden und bietet einen Datenanalyse-Workflow für Proteinnetzwerke.
Peptidomik ist die Untersuchung von Peptiden, die auf natürliche Weise sowohl während normaler zellulärer Prozesse als auch unter Krankheitsbedingungen erzeugt werden, und dieser Ansatz war in der Vergangenheit auf die Antikörper-basierte Quantifizierung beschränkt, bis die Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie und die Peptidextraktionsprozesse zu ihrem heutigen Zustand gelangten1. Diese Fortschritte, zusammen mit der Anwendung der Hitzeinaktivierung endogener Proteasen, ermöglichen nun die Identifizierung und Quantifizierung von Hunderten von intrazellulären Peptiden. In Correa et al.2 beschreiben die Autoren einen Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung, der die Hitzeinaktivierung, die Peptidextraktion unter milden Bedingungen zur Erhaltung der Peptidbindungen und die relative Quantifizierung durch stabile Isotopenmarkierung von Aminen umfasst. Die Autoren haben einen kostengünstigen Ansatz entwickelt, der die Identifizierung und Quantifizierung von nativen und biologisch aktiven Peptiden aus Zellkultur- und Gewebeproben ermöglichen könnte. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um krankheitsspezifische Peptid-Biomarker, antimikrobielle Peptide oder Ziele für die zukünftige therapeutische Entwicklung zu entdecken.
Fortschritte in der massenspektrometrischen und bioinformatischen Forschung ermöglichen nun die detaillierte Charakterisierung von Proteomen aus verschiedenen Quellen von biologischem Material3. Die Entschlüsselung der biologischen Signifikanz aus den proteomischen Expressionsmustern in diesen komplexen Proben bleibt eine große Herausforderung in diesem Bereich. Um dieser Herausforderung zu begegnen, stellen Vanderwall et al. JUMPn vor, ein systembiologisches Programm und den damit verbundenen Arbeitsablauf, der proteomische Daten in Modulen (d. h. Proteinkomplexen) organisiert, die Protein-Co-Expressionscluster mit verwandten Protein-Protein-Interaktions-Netzwerkknoten (PPI) verbinden4. Die Autoren evaluieren die Wirksamkeit dieses Tools anhand vorhandener Proteom-Datensätze sowie simulierter Daten und zeigen seinen Nutzen für die Erleichterung der biologischen Interpretation komplexer Proteom-Datensätze. Ihre Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz zur Messung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors und der Kinase-Kaskade verwendet werden kann, was seinen Nutzen für die Identifizierung von Krankheitstreibern beim Menschen und für andere Studien zeigt, die versuchen, biologische Mechanismen aus tiefen Proteomdaten zu bestimmen.
Inositolpyrophosphate (PP-InsPs) kommen in allen eukaryotischen Zellen vor, wo sie als metabolische Signalmoleküle fungieren und verschiedene Prozesse regulieren5. In der Vergangenheit war die Analyse aufgrund der physikalischen Eigenschaften und der geringen Abundanz von PP-InsPs auf die Verwendung von radioaktiven Tracern beschränkt, die teuer sind und besondere Sorgfalt und Lagerung erfordern. Als Alternative haben Qiu et al. ein Protokoll entwickelt, das eine absolute Quantifizierung von Inositolpyrophosphaten aus Zellkulturen oder Gewebeausgangsmaterial mit hohem Durchsatz durch Kapillarelektrophorese-gekoppelte Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (CE-ESI-MS)ermöglicht6. In ihrem Bericht zeigen sie, wie dieser Ansatz genutzt werden kann, um ein Profil aller in einer Probe vorhandenen PP-InsPs zu erstellen, Spezies aufzulösen und Regioisomere zu identifizieren, um räumliche und zeitliche Veränderungen unter verschiedenen Bedingungen und Krankheitszuständen zu identifizieren.
Ein großer Teil der zellulären Prozesse wird durch Proteinphosphorylierung gesteuert, und Fehler in diesen Signalwegen sind mit vielen verschiedenen Krankheitszuständen verbunden7. Es gibt jedoch noch erhebliche Lücken im Verständnis der vollständigen Mechanismen, die Proteinphosphatasen und -kinasen in verschiedenen Zelltypen und unter verschiedenen Bedingungen regulieren. Um diese Verständnislücken zu schließen, stellen Smolen et al. einen neuartigen Arbeitsablauf vor, bei dem Phosphatase-Inhibitor-Kügelchen in Verbindung mit Massenspektrometrie (PIB-MS)8 verwendet werden. Mit einem nicht-selektiven Phosphoprotein-Phosphatase-Inhibitor, Microcystin-LR, gekoppelten Tosepharose-Kügelchen sind die Autoren in der Lage, diese Zielproteine anzureichern. Darüber hinaus waren sie durch die Verwendung milder Waschbedingungen zur Entfernung unspezifischer Containments auch in der Lage, Proteininteraktoren einzufangen. Sie zeigen, wie dieser Ansatz genutzt werden kann, um Phosphoproteinphosphatasen, ihren Phosphorylierungsstatus und mögliche Protein-Protein-Wechselwirkungen sowohl in Zellkultur als auch im Gewebe zu identifizieren und zu quantifizieren.
Die Fortschritte bei den Methoden der Probenvorbereitung, wie z. B. Strategien zur Quantifizierung endogener Peptide, die Anreicherung von Phosphatasen und Kinasen, Proteininteraktionen und Inositolpyrophosphate, erweitern die Wissensbasis für die Proteindynamik in biologischen Prozessen. Die Weiterentwicklung von Massenspektrometern, wie z. B. die datenunabhängige Erfassung im Gegensatz zur datenabhängigen Erfassung, ermöglicht eine größere Tiefe der Sequenzierungskapazität, um Peptide so zu identifizieren, dass die Peptide mit höherer Häufigkeit die Peptide mit geringerer Häufigkeit während der Datenerfassung nicht maskieren, was die Identifizierung anderer Klassen von Proteinen ermöglicht. Die timsTOF-Massenspektrometer werden dazu beitragen, die Zukunft voranzutreiben, indem sie die Ionenmobilität zusätzlich zur Flüssigchromatographie als zusätzliche Trennung von Peptiden einbeziehen, um eine noch tiefere Sequenzierung und eine größere Chance auf den Nachweis von Peptiden aus den in dieser Sammlung beschriebenen Probenvorbereitungsstrategien zu ermöglichen. Das Gebiet der Proteomik wird sich weiter entwickeln, basierend auf neuen Methoden zur Probenvorbereitung, Fortschritten bei Massenspektrometern für die Datenerfassung und bioinformatischen Analysewerkzeugen wie JUMPn, um die biologische Komplexität und Funktion zu verstehen.