Methodenartikel

Zellfreie Expressionssysteme: Herstellungs- und Verwendungsmethoden

28. Juli 2023

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1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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DISKUTIERTE ARTIKEL:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE zellfreies System. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. Von der Zelle zur zellfreien Proteinsynthese innerhalb von 24 Stunden mit zellfreiem Autoinduktions-Workflow. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Schnelle, erschwingliche und unkomplizierte Produktion von bakteriellem zellfreiem Lysat. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping unter Verwendung zellfreier Systeme. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Schnelle Charakterisierung genetischer Teile mit zellfreien Systemen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. Ein ertragreiches Transkriptions-Translations-Toolkit für Streptomyces für die synthetische Biologie und Naturstoffanwendungen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Flüssigchromatographie gekoppelt mit Brechungsindex- oder massenspektrometrischer Detektion für die Erstellung von Metabolitenprofilen in lysatbasierten zellfreien Systemen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Herstellung von multifunktionalen Mikrokapseln auf Seidenbasis, die mit DNA-Plasmiden beladen sind, die für RNA-Aptamere und Riboschalter kodieren. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Design-to-Implementation-Studie zur Entwicklung und Patientenvalidierung von papierbasierter Fußschalterdiagnostik. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (184), doi:10.3791/63223 (2022).

Editorial

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Zellfreie Expressionssysteme (CFE) sind eine Reihe von Werkzeugen, die die wichtigsten zellulären Prozesse der Transkription, Translation und des Stoffwechsels außerhalb der Grenzen der Zelle rekonstituieren1. Solche Methoden haben schnell an Popularität gewonnen, indem sie vereinfachte Experimente durch die Entfernung von Zellmembranen und eine geringere Komplexität durch die Entfernung genomischer DNA und die entsprechende Komplexität der Wechselwirkungen zwischen einem genetischen Konstrukt und dem Wirt bieten. CFE-Systeme werden heute in der Grundlagenforschung, Sensorik, Bioproduktion und Bildung eingesetzt. Diese Methodensammlung stellt neun Beispiele für neue Wege zur Herstellung und Verwendung zellfreier Systeme vor.

Drei der Methoden konzentrieren sich darauf, die Herstellung zellfreier Systeme zugänglicher zu machen. Grasemann et al. beschreiben einen einfacheren Weg, das PURE-System herzustellen, ein CFE-System, das alle für die Transkription und Translation erforderlichen Komponenten rekonstituiert, anstatt zelluläre Lysate2 zu verwenden. Anstatt jede der 36 Proteinkomponenten zu exprimieren und zu reinigen, poolen die Autoren die Expressionsstämme und bieten so die Produktion eines funktionellen PURE-Systems innerhalb einer Woche an. Smith et al. bieten einen vereinfachten Prozess für die Herstellung von lysatbasierten CFE-Systemen unter Verwendung eines optimierten Kultivierungsansatzes, der den gesamten Arbeitsablauf auf 24 Stunden verkürzt und innerhalb der normalen Arbeitszeit erreicht werdenkann 3. Cooper et al. beschreiben eine Methode, bei der ein modifizierter E. coli-Stamm verwendet wird, der die Zelllyse durch Gefrier-Auftauen ermöglicht, wodurch die für andere Methoden erforderliche Spezialausrüstung überflüssig wird4. All diese Methoden tragen zu einem Trend der Bemühungen bei, die Herstellung zellfreier Systeme für Labore mit weniger Infrastruktur und Fachwissen in den komplizierten traditionellen Protokollen erreichbar zu machen. Mit der Verfügbarkeit konkurrierender kommerzieller Kits können immer mehr Labore die Vorteile von CFE-Systemen mit geringem Risiko erkunden. Mit Methoden wie den hier vorgestellten können diese Labore dann ihre eigenen CFE-Systeme herstellen, die auf ihre Bedürfnisse zugeschnitten sind, ohne einen großen Aufwand an Ausrüstung oder Zeit.

Zwei Methoden konzentrieren sich auf die Vorteile des schnellen und hohen Durchsatzes, der mit CFE-Systemen möglich ist. Dopp et al. stellen eine Methode zur Amplifikation linearer DNA-Templates für ein schnelles Screening genetischer Konstruktevor 5. Mit ihrem Ansatz können genetische Designs bei DNA-Synthesefirmen bestellt und dann innerhalb von 24 Stunden amplifiziert und gescreent werden. McManus et al. beschreiben einen ähnlichen Ansatz, bei dem ein Reportergen mit unterschiedlichen Primern amplifiziert wird, die für verschiedene regulatorische Komponenten kodieren6. Die niedrigen Kosten von Oligos in Kombination mit CFE-Systemen ermöglichen ein schnelles und kostengünstiges Screening von Komponenten wie Promotoren. Beide Methoden unterstreichen das Potenzial von CFE-Systemen für schnelle Experimente und verkürzen die Zeiträume für das Entwerfen und Testen eines Konstrukts von Wochen mit herkömmlichem Klonen auf Tage oder sogar Stunden.

Die nächsten drei Methoden bieten Werkzeuge für den speziellen Einsatz von CFE-Systemen. Toh et al. bieten eine Methode zur Herstellung von CFE-Systemen aus Streptomyces venezuelae7 an. Die meisten CFE-Protokolle basieren auf E. coli, einschließlich aller anderen Methoden in dieser Sammlung. Diese neue Methode für S. venezuelae bringt die Vorteile von CFE-Systemen zu einem Organismus, der für die Herstellung von Naturstoffen von großem Interesse ist. Dinglasan et al. bieten eine Möglichkeit, die Metabolitenkonzentrationen in zellfreien Reaktionen zu messen8. Solche Messungen sind entscheidend für Anwendungen im zellfreien Metabolic Engineering, bei dem der intakte Stoffwechsel von CFE-Systemen zur Herstellung von Nicht-Proteinprodukten von Interesse genutzt wird. Drittens präsentieren Drachuk et al. die Mikroverkapselung von DNA als Ergänzung zu CFE-Reaktionen9. Dieser Ansatz steht stellvertretend für eine Reihe von Techniken, die es ermöglichen, die Vorteile der Kompartimentierung nach dem Entfernen natürlicher Membranen bei der Herstellung von CFE-Systemen rationell wieder in CFE-Systeme einzuführen. Jede dieser Methoden erweitert das Spektrum der Anwendungen, für die CFE-Systeme eingesetzt werden können.

Schließlich beschreiben Jaenes et al. Methoden zur Erstellung einer realen Diagnostik für das Zika-Virus auf der Grundlage von CFE-Systemen10. Die Tests und Instrumente sind im Vergleich zu konkurrierenden Technologien wie PCR kostengünstig, und die Autoren haben ihre Diagnostik erfolgreich an Patientenproben in mehreren Ländern getestet. Diese Arbeit ist ein starkes Beispiel für Point-of-Need-Sensoranwendungen, was vielleicht der Bereich ist, in dem CFE-Systeme bereit sind, die unmittelbarsten Auswirkungen auf die reale Welt zu erzielen.

Als Sammlung erfassen diese Methoden einen repräsentativen Ausschnitt der Hauptbereiche der aktiven Forschung zu CFE-Systemen in den letzten Jahren. Die Methoden, die die Herstellung von CFE-Systemen verbessern und Experimente mit hohem Durchsatz ermöglichen, sind gut vertreten, und es werden Beispiele für die zahlreichen spezifischeren Anwendungen von CFE-Systemen vorgestellt. Weitere Interessengebiete sind die Herstellung komplexer Proteine für medizinische Anwendungen, der Einbau nicht-kanonischer Aminosäuren, die Optimierung für die Langzeitlagerung und die Entwicklung künstlicher Zellen. Wir gehen davon aus, dass sich die Einführung von CFE-Systemen weiter beschleunigen wird, da die Eintrittsbarriere geringer ist, das Potenzial für schnelle Experimente besteht und ein breiteres Spektrum an Funktionen vorhanden ist, die alle durch Methoden wie die in dieser Sammlung vorgestellten ermöglicht werden. Die verbleibenden Herausforderungen hängen vom Anwendungsbereich ab. Für die Bioproduktion wird die Kostensenkung in großem Maßstab durch die Umstellung auf billigere Substrate und ein verbessertes Recycling von entscheidender Bedeutung sein. Für die Sensorik sind umfangreiche Arbeiten am Beispiel von Jaenes et al. erforderlich, um eine robuste Leistung in verschiedenen Point-of-Need-Anwendungen zu demonstrieren. Im Großen und Ganzen muss das Feld die Kerntechniken weiter verfeinern und gleichzeitig das Repertoire dessen erweitern, was mit CFE-Systemen möglich ist.

Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem Office of the Secretary of Defense's Applied Research for the Advancement of S &T Priorities Programm für die Unterstützung der Zusammenarbeit, die zu dieser Sammlung geführt hat.

Referenzen

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  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

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Schlagwörter

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

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