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Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung, von der etwa 1 von 400 Menschen im Laufe ihres Lebens betroffen ist. Die Erkrankung äußert sich zunächst als Beeinträchtigung der oberen und unteren Motoneuronen und schreitet schließlich innerhalb von 2–5 Jahren nach Symptombeginn zu Lähmungen und Tod infolge von Atemversagen fort1. ALS kann erblich sein, mit über 30 verschiedenen genetischen Mutationen, aber nur 4 Genvarianten (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP), die etwa 55% der familiären ALS ausmachen. Die Mehrzahl der ALS-Fälle, etwa 90 %, stellt eine sporadische ALS dar, deren Hauptursachen noch nicht vollständig geklärt sind2. Es besteht ein dringender Bedarf, die Mechanismen von ALS mit den geeigneten Werkzeugen und Modellorganismen zu entschlüsseln. In dieser Methodensammlung geben wir einen Überblick über die jüngsten Forschungsfortschritte in Bezug auf die Nachahmung dieser Krankheit und hoffentlich letztendlich die Suche nach Behandlungsoptionen. So bietet beispielsweise die Anwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die in Motoneuronen oder Astrozyten differenziert werden können, ein humanisiertes Modellsystem 3,4,5. Darüber hinaus werden in dieser Methodensammlung Tiermodelle vorgestellt, wie z.B. Drosophila zur Untersuchung der Glukoseaufnahme und der neuromuskulären Verbindung (NMJ) in vivo 6,7, Mäuse zur Untersuchung kortikaler Neuronen8 und C. elegans oder Zebrafisch zur Untersuchung motorischer Beeinträchtigungen 9,10 und postmortales Patientengewebe11.
Zebrafischlarven sind durchsichtig und ihre Motoneuronen sind direkt sichtbar, was sie zu einem perfekten Werkzeug für nicht-invasive In-vivo-Studien macht. Asakawa et al. zeigen den Phasenübergang von optogenetisch exprimiertem TDP-43 in einzelnen spinalen Motoneuronen9. Nach der Bestrahlung kann die zytoplasmatische Relokation von TDP-43 beobachtet und analysiert werden. Die Aggregation von zytoplasmatischem TDP-43 ist ein Kennzeichen für degenerierende Motoneuronen bei ALS. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Untersuchung und Analyse von ALS-assoziierten Proteinen auf subzelluläre, zeitliche Weise.
Unter Verwendung der superauflösenden strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) beschreiben Coyne und Rothstein ein Protokoll, das die Zellkerne isoliert, und beschreiben, wie Nukleoporinkomplexe untersucht werden11. Nukleoporin-Komplexe bestehen aus mehreren Kopien von etwa 30 verschiedenen Nukleoporin-Proteinen (Nups). Es hat sich gezeigt, dass eine Beeinträchtigung des nukleozytoplasmatischen Transports (NCT) und Nup-Veränderungen frühe Kennzeichen vieler neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich ALS, sind. Durch die Extraktion der Zellkerne ist es möglich, die einzelnen Nup-Proteine innerhalb des NPC und des Nukleoplasmas in 3D zu untersuchen. Interessanterweise kann dies nicht nur auf iPSC-abgeleitete Zellen, sondern auch auf postmortales Gewebe angewendet werden.
Currey und Liachko beschreiben zwei Assays zur Unterscheidung zwischen leichter, mittelschwerer und schwerer motorischer Beeinträchtigung in C. elegans-Modellen von ALS10. Beim radialen Lokomotionsassay wird das Kriechen auf einer Oberfläche gemessen, was ihn zu einem einfachen und kostengünstigen Assay macht. Bei ihrer zweiten Methode, dem Schwimm-Assay, können Dreschbewegungen mit Hilfe eines computergestützten Tracking-Verfahrens gemessen werden. Die Autoren nutzen dies, um TDP-43 und Tau zu untersuchen.
Hayes et al. beschreiben auch eine Methode zur Untersuchung von NCT8. Sie wenden eine Permeabilisierungsmethode auf neuronale Kulturen an. Unter Verwendung primärer kortikaler Neuronen der Maus beschreiben sie eine Methode, die die Integrität der Kernmembran durch hypotone Lyse in Kombination mit einem Rinderserumalbuminkissen aufrechterhält. Auf diese Weise funktioniert der nukleare Import weiterhin energieabhängig und bietet somit eine High-Content-Mikroskopie- und Analyseplattform. Diese Plattform wird in Zukunft eine breite Anwendbarkeit für die Untersuchung des passiven und aktiven Kerntransports in primären Neuronen haben.
Die schnelle Beurteilung, wie sich Manipulationen, krankheitsrelevante Proteine oder RNA auf synaptische Prozesse auswirken und ob therapeutische Medikamente diese Funktionen wiederherstellen können, ist für die ALS-Forschung unerlässlich. Unter Verwendung von iPSC-abgeleiteten Motoneuronen sowie primären Neuronen von Mäusen stellen Krishnamurthy et al. ein Protokoll vor, das die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinstroms und der synaptischen Vesikelmembranfusion ermöglicht3. Die Autoren zeigen, dass die C9orf72-(GA)50-Transfektion die synaptische Übertragung beeinträchtigt, was die Eignung dieser Methoden zum Nachweis mutationsbasierter Unterschiede in der synaptischen Funktion unterstreicht.
Eine veränderte Glukoseaufnahme ist eine der pathobiologischen Eigenschaften der ALS. In diesem Drosophila-Modell beschreiben Loganathan et al. eine FRET-basierte Methode zur Messung intrazellulärer Veränderungen der Glukoseaufnahme in bestimmten Zellen6. Mit einem genetisch kodierten Glukose-FRET-Sensor validieren sie ihre Methode mit TDP-43-Expressionsneuronen, die eine höhere Glukoseaufnahme aufweisen. In der TDP-43G298S-Mutantenlinie ist eine erhöhte Glukoseaufnahme nur nach Glukosestimulation nachweisbar. Diese Methode stellt ein wichtiges Werkzeug dar, um die Glykolyse nicht nur bei ALS, sondern auch allgemein in Bezug auf die Regeneration von Motoneuronen zu untersuchen.
Präparierungstechniken, die die NMJ-Architektur erhalten, sind von größter Bedeutung für die Untersuchung von Veränderungen in den Motoneuronen entlang des Drosophila-Beins im Laufe der Zeit. Stilwell und Agudelo verwenden eine Technik, die die Charakterisierung des NMJ zur Identifizierung von Motoneuronendornen mit Hilfe der Immunzytochemie ermöglicht7. Interessanterweise sind die adulten Neuronen während der gesamten Lebensdauer einer Fliege, die etwa 90 Tage beträgt, vorhanden. Beim Vergleich einer SOD1H71Y-Mutation mit dem Wildtyp zeigen die Autoren unterschiedliche Marker für altersabhängige Bouton-Schwellungen, Proteinaggregate und vergrößerte Mitochondrien.
Die Innovation, ein NMJ mit Hilfe eines Co-Kultursystems nachzuahmen, entspricht dem dringenden Bedarf, die Dissoziation zwischen Motoneuronen und Myotuben zu untersuchen. In Bezug auf diese Methode beschreiben Stoklund Dittlau et al. , wie humane iPSC-abgeleitete Motoneuronen und humane primäre Mesoangioblasten-abgeleitete Myotuben kultiviert werden können, um funktionell aktive NMJs zu bilden4. Die Autoren zeigen ihre Funktionalität durch die Aktivierung von Motoneuronen mit Kaliumchlorid und Calciumeinstrom in Fluo-4-markierte Myotuben danach, die durch die Gabe von NMJ-Blockern aufgehoben wurde.
In jüngster Zeit haben Co-Kultur-Systeme zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen. Die Untersuchung nicht nur eines, sondern mehrerer Zelltypen in einer Schale hat den Vorteil, dass sie physiologische Bedingungen besser nachahmt als Methoden mit monokulturellen Zellen. ALS-bezogene Pathobiologie, wie z.B. Astrozyten-vermittelte Toxizität und neuronale Übererregbarkeit, können mit diesem Ansatz untersucht werden. In dem Video von Taga et al. wird die Erzeugung von kortikalen Neuronen und Astrozyten in einer Co-Kultur in Kombination mit einem Multi-Elektroden-Array (MEA)-Aufbau zur Überwachung der Elektrophysiologie gezeigt5. Die funktionelle Aktivität kann über die Zeit überwacht werden, was Flexibilität in der zellulären Zusammensetzung sowie bei unterschiedlichen Kulturbedingungen ermöglicht. Darüber hinaus bietet dies eine Plattform, um das therapeutische Potenzial von Medikamenten und ihren Einfluss auf die funktionelle Aktivität zu testen.
Derzeit gibt es nur drei von der FDA zugelassene Behandlungen für ALS, die alle nur ein begrenztes Anwendungspotenzial haben. Um vielversprechendere Behandlungen zu finden, muss die zukünftige Forschung die Pathobiologie besser verstehen, indem sie mehrere Modellsysteme und -ansätze einsetzt. Zweifellos werden humane iPSC-abgeleitete Modelle eine interessante Plattform bieten, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu untersuchen. In Kombination mit Modellsystemen wie Zebrafischen, C. elegans, Drosophila oder Nagetieren wird dies zu Fortschritten auf diesem Gebiet führen. Darüber hinaus wird die zukünftige epidemiologische Forschung hoffentlich mehr Erkenntnisse darüber liefern, welche Rolle Umweltfaktoren bei der Entstehung von ALS12 spielen. Mit den wachsenden Datensätzen und der sich mit hoher Geschwindigkeit entwickelnden Bioinformatik wird es in Zukunft einfacher werden, die gemeinsamen Nenner neurodegenerativer Erkrankungen zu enträtseln. Dies wird zu neuen Wegen der Therapie oder sogar der Prävention führen.