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Schon bevor 2017 der Nobelpreis für die Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) biologischer Moleküle verliehen wurde, sorgte das Feld für Aufregung. Die Auflösungsrevolution war in vollem Gange, und die Strukturbiologie betrachtete die KryoEM als eine Charakterisierungsmethode, die sich dem Goldstandard der Röntgenkristallographieannäherte 1. Schon früh umfasste das Gebiet der KryoEM vor allem Daten, die mit Kryo-Transmissionselektronenmikroskopen (KryoTEMs) erzeugt wurden. Mit der Weiterentwicklung von Mikroskopen, Instrumenten zur Probenvorbereitung und Methoden zur Probenvorbereitung sind die Arten der generierten Daten vielfältiger geworden. Die KryoEM ist nicht mehr nur der Proteincharakterisierung durch KryoTEM vorbehalten. Das Feld ist gewachsen und umfasst nun Daten, die von Kryo-Rasterelektronenmikroskopen und fokussierten Ionenstrahlen (cryoSEM/FIB) generiert wurden. Die Auswirkungen sind in mehreren Disziplinen zu spüren, einschließlich der bildgebenden Forschung an Molekülen, Zellen, Geweben und synthetischen Materialien wie Hydrogelen.
Fortschritte bei den Bildgebungsmöglichkeiten waren eine treibende Kraft bei der Entwicklung der KryoEM. Verbesserungen bei Kameras, Detektoren und Bildverarbeitung haben den Weg für die Bildgebung mit geringerem Energieaufwand geebnet, wodurch empfindliche biologische Proben den Bildgebungsprozess überstehen können. In TEM hat sich die niedrig dosierte Strahlbelichtung auf die Anwendung der Tomographie übertragen, bei der eine einzelne Probe wiederholt aus mehreren Winkeln abgebildet wird, um eine 3D-Rekonstruktion zu erzeugen 2,3. Fortschritte bei SEM/FIBs haben auch zu einer verbesserten Auflösung bei geringerem Energieverbrauch geführt. Wichtig ist, dass dies zu einer verbesserten Bildgebung von nichtleitenden Proben geführt hat, was sich in einer besseren Volumenabbildung in REM/FIBs niederschlägt 4,5. Diese Verbesserungen haben die gesamte biologische Elektronenmikroskopie verbessert, aber sie haben vor allem die Kryo-Bildgebung verbessert, bei der die Proben empfindlich sind und keine zusätzlichen Schwermetalle hinzugefügt werden, um den Kontrast zu verbessern.
Mit der Weiterentwicklung der Bildgebungsmöglichkeiten haben sich auch die Instrumente zur Probenvorbereitung weiterentwickelt. Bei der KryoEM-Probenvorbereitung ist der erste Schritt die erfolgreiche Vitrifizierung der Proben. Hydratisierte Proben werden eingefroren, um amorphes Eis zu bilden, wodurch Schäden durch die Bildung von Eiskristallen vermieden werden. Die führenden Strategien sind das Tauchgefrieren in flüssigem Ethan für Moleküle und kleine Zellen oder das Hochdruckgefrieren (HPF) für größere Proben mit einer Dicke von bis zu einigen hundert Mikrometern. Fortschritte in der Tauchgefriertechnologie ermöglichen ein besseres Einfangen von Molekülen in allen Ausrichtungen, indem sie die Selbstorganisation entlang der Luft-Wasser-Grenzfläche reduzieren6. Darüber hinaus ermöglichen Fortschritte in der HPF-Technologie die leichte und elektrische Stimulation von Proben kurz vor dem Einfrieren7. Kürzlich wurde eine neue HPF-Technologie entwickelt, die mit einem Fluoreszenzmikroskop verbunden werden kann und eine kurze Zeitverzögerung (<2 s) zwischen der Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen und dem HPF-Einfrierenermöglicht 8.
Die oben genannten Fortschritte haben das Gebiet der KryoEM belebt und die Entwicklung neuer Methoden inspiriert. Es gab auch eine Wiederbelebung etablierter Techniken. Hier stellen wir eine Sammlung von Methoden vor, die sich auf die Weiterentwicklung der KryoEM konzentrieren, mit dem Ziel, diese Strategien in das schnell wachsende Forschungsfeld zu bringen.
Während die Verbesserungen der Bildgebungsfunktionen und der Probenvorbereitungsinstrumente eine wichtige treibende Kraft hinter den Fortschritten auf dem Gebiet der KryoEM waren, ist eine große Hürde in dieser Forschung nach wie vor die praktische Vorbereitung der Proben. Truong et al.9 stellen eine Methode vor, die sich die Bildung von Lipid-Monolagen an der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser zunutze macht. Auf dem TEM-Gitter bildet sich eine Lipidschicht, die als Gerüst für die interessierenden Membranproteine dient. Für mehrlamellare oder gestapelte Membranproben stellen Johnson et al.10 eine Strategie vor, um die überschüssigen Schichten "abzuschälen" und eine einzelne Schicht auf dem Gitter zu verbleiben, die für die TEM-Bildgebung geeignet ist. In einem anderen Artikel erkennen Chang et al.11 an, dass einige Proteine temperaturabhängig sind und dass die entsprechende Struktur bei erhöhten Temperaturen beobachtet wird. Sie beschreiben ein modifiziertes Tauchgefrierverfahren, das es ermöglicht, Proben bei erhöhten Temperaturen auf das Gitter aufzubringen, während nach dem Tauchgefrieren immer noch Glaseis erhalten wird. Um den Prozess der Kryo-Gitterherstellung weiter zu kontrollieren, stellen Kang et al.12 eine Hochdurchsatzmethode zur Herstellung von mikrostrukturierten Chips für TEM-Gitter vor, in denen die Poren eine kontrollierbare Tiefe aufweisen. Diese Methode könnte eine weitere Variable liefern, um die Dicke von amorphem Eis während der Gittervorbereitung zu kontrollieren.
Die Korrelation mehrerer Bildgebungsmodalitäten ist wirkungsvoll. Bieber et al.13 beschreiben einen Kryo-Workflow, bei dem ein gefrorenes Gitter in einem Kryo-Fluoreszenzmikroskop abgebildet wird, um eine fluoreszierende Region von Interesse zu lokalisieren. Das Gitter wird dann auf ein KryoREM/FIB übertragen, wo Passermarken verwendet werden, um das Fluoreszenzbild mit dem REM-Bild auszurichten, so dass der Fluoreszenzbereich für das FIB-Fräsen anvisiert werden kann. Die Zielregion wird auf einige hundert Nanometer verdünnt, und dann wird das Gitter zur Tomographie an der verdünnten Zielstelle auf ein KryoTEM übertragen. DiCecco et al.14 weisen eine Korrelation zwischen flüssigem TEM und KryoTEM auf und kommen damit dem Ziel näher, hochauflösende KryoTEM-Daten mit den TEM-Daten von Molekülen in dynamischer Bewegung zu koppeln.
Auch die automatisierte Erfassung großer Datenmengen ist ein Interessengebiet. Wertvolle Gerätezeit muss maximiert werden, und die Automatisierung ist ein wichtiger Schritt. Kumar et al.15 beschreiben die Klick-für-Klick-Einrichtung einer automatisierten Datenerfassungssoftware für die KryoTEM-Bildgebung.
Mit der Weiterentwicklung des Gebiets der KryoEM werden weitere Fortschritte bei der Probenvorbereitung zu verzeichnen sein, und die Auswirkungen der KryoEM werden in mehr Disziplinen zu spüren sein. Einige Fortschritte werden nicht mit neuen Techniken, sondern mit der Stärkung bestehender Techniken verbunden sein. Die Techniken werden schneller, einfacher und robuster sein, mit höherem Durchsatz. Mit der zunehmenden Automatisierung der Datenausgabe werden wichtige Entwicklungsbereiche in der Bildanalyse und Datenverarbeitung liegen. Darüber hinaus wird KI eine wichtige Rolle spielen. Wir sollten mit einer Reduzierung der Instrumentierungskosten und des Platzbedarfs rechnen, was es ermöglichen wird, diese Technologie breiter zugänglich zu machen, auch wenn diese Entwicklungen möglicherweise langsamer eintreten.