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Glykogen, ein verzweigtes Glukosepolymer, spielt eine wichtige Rolle im Energiestoffwechsel von Prokaryoten und Eukaryoten. Unter den Bedingungen der Nährstoffbeschränkung nutzen Bakterien und Hefen Glykogen für das Überleben der Zellen1. Bei Säugetieren hat Glykogen gewebespezifische Rollen, einschließlich der lokalen Verwendung in den Muskeln, um die Kontraktion zu fördern, und in der Leber, um den Blutzuckerspiegel zu regulieren2. Die Synthese von Glykogen wird durch die Glykogensynthase katalysiert, die Glukosereste über Alpha-1,4-Bindungen verbindet, und das verzweigte Enzym, das Alpha-1,6-Bindungen bildet und so Verzweigungen im Glykogen-Makromolekül bildet. Die Nutzung dieses Energiespeichers wird durch die Glykogenphosphorylase in Verbindung mit dem entzweigenden Enzym erleichtert, was zum Umbau des Glykogens und zur Freisetzung von Glukose-1-P führt. Die Struktur des Glykogens, einschließlich der Partikelgröße und der Verzweigung, ist zum Teil von Interesse, weil die Verzweigung die Glykogenlöslichkeit beeinflusst, die Größe der Glykogenpartikel ihre Abbaurate beeinflusst und die strukturelle Instabilität des Glykogens mit Diabetes in Verbindung gebracht wird. Darüber hinaus ist die Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Glykogen in Geweben wie Muskeln wichtig, um Informationen über die Rolle dieses Brennstoffs während des Trainings zu erhalten.
Die Akkumulation von Glykogen wird durch die relativen Aktivitäten der Glykogen-synthetisierenden Enzyme und derjenigen, die das Makromolekül abbauen, gesteuert. Wilson3 beschreibt Techniken zur Messung der enzymatischen Aktivität von Glykogensynthase, Glykogenphosphorylase, verzweigendem Enzym und debranchierendem Enzym. Diese biochemischen Methoden messen die Produktion oder den Verbrauch von NADH/NADPH oder kolorimetrischen Veränderungen mit einem Spektralphotometer. Dabei handelt es sich um skalierbare Ansätze, die die hohen Kosten, die spezialisierte Ausrüstung und den regulatorischen Aufwand umgehen, die mit der empfindlicheren Methode zur Verwendung von Radioisotopen verbunden sind. Die beschriebenen Methoden eignen sich am besten für die Messung der Enzymaktivität mit gereinigten Enzymen, obwohl sie bei ausreichender Homogenatverdünnung und geeigneten Kontrollen mit Gewebeproben verwendet wurden. Wilson3 beschreibt auch einen einfachen kolorimetrischen Assay zur Messung der Glykogenverzweigung. Obwohl diese Methode weniger Informationen über die Feinstruktur des Glykogens liefert als aufwendigere Trenntechniken, bietet sie eine einfache und schnelle Messung der relativen Verzweigungsgrade.
Fermont et al.4 beschreiben die Verwendung der Fluorophor-assistierten Kohlenhydratelektrophorese (FACE), einer Methode zur Bestimmung der Kettenlängenverteilung (CLD), die eine Reflexion der Glykogenpartikelgröße und des prozentualen Anteils der Verzweigung ist. Die Struktur des Glykogens beeinflusst die Fähigkeit von Bakterien, Hunger zu überleben, und abnormales Glykogen reichert sich bei mehreren Glykogenspeicherkrankheiten an, was die Bedeutung von Methoden zur Untersuchung der Größe und Verzweigung dieser Brennstoffquelle unterstreicht. Bei der FACE handelt es sich um die reduktive Aminierung einer Hemiacetalgruppe mit 8-Amino-1,3,6-Pyrentrisulfonsäure (APTS). Neben der Bereitstellung von Informationen über die CLD ist FACE nützlich, um die katalytischen Eigenschaften von verzweigenden Enzymen aus verschiedenen Quellen zu messen. Die primäre konkurrierende Technik, HPAEC-PAD, hat den Vorteil, dass keine nicht-reduzierenden Enden erforderlich sind, aber diese Technik hat ein Problem der Massenverzerrung.
Der Grad der Verzweigung und die Größe der Glykogenpartikel sind wichtige Eigenschaften des Glukosepolymers. Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie wurde beobachtet, dass Glykogen in drei Strukturen vorliegt: kugelförmige Beta-Teilchen (~20 nm), zu denen mehrere Gamma-Teilchen (3 nm) gehören, und größere rosettenförmige Alpha-Teilchen (~300 nm), die aus Beta-Teilchenbestehen 5. Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Glykogen sind für die Messung der Glykogenkonzentration ausreichend, beeinträchtigen jedoch die Feinstruktur des Glykogens, so dass die Entwicklung einer milderen Technik erforderlich ist. Eine Kaltwasserextraktion unter Verwendung einer Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation wird von Wang, Wang et al.6 für den Einsatz in Bakterien beschrieben. Diese Technik ist anderen Methoden überlegen, wenn es darum geht, sowohl größere Glykogenmoleküle, gemessen durch Größenausschlusschromatographie (SEC), als auch längere Ketten, gemessen durch Fluorophor-gestützte Kapillarelektrophorese (FACE)6, zu konservieren. Wang, Liu et al.7 wenden eine ähnliche Methode auch auf die Leber an. Wie wichtig es ist, die Glykogenstruktur zu verstehen, zeigt ein kürzlich veröffentlichter Bericht, der zeigt, dass Leberglykogen-Alpha-Partikel bei Diabetes "zerbrechlich" sind, was zu einem schnelleren Abbau im Vergleich zu stabilen Alpha-Partikeln führt, was sich möglicherweise auf die Blutzuckerkontrolle auswirkt. Zu den Einschränkungen dieser auf Saccharosegradienten basierenden Isolationsmethoden gehören der Verlust von Glykogen im Überstand, der durch eine niedrigere Saccharosekonzentration gemildert werden kann, und der enzymatische Abbau eines Teils des Glykogens aufgrund der verwendeten milden Bedingungen. Letzteres wird durch einen kurzen Siedeschritt abgeschwächt, der jedoch die zugehörigen Proteine stört.
Schließlich beschreiben Jensen et al.8 den Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Abbildung der subzellulären Glykogenverteilung und der Partikelgröße in einzelnen Skelettmuskelfasern. Diese Methode ist die einzige, die für die Untersuchung von subsarkolemmalen, intermyofibrillären und intramyofibrillären Glykogenpools zur Verfügung steht und wurde an Muskelgeweben einer Vielzahl von Tieren angewendet. Da einige subzelluläre Prozesse bevorzugt Glykogen als Brennstoff verwenden, ist es wichtig, die Lage dieser Brennstoffspeicher zu charakterisieren. Darüber hinaus bietet diese Methode die Möglichkeit, den Glykogenstoffwechsel in verschiedenen Muskelfasertypen zu untersuchen, was im Training wichtig ist, wo die Müdigkeit nur in ausgewählten Fasern glykogenabhängig ist. Eine Einschränkung der TEM-Methode ist die Unfähigkeit, kleine Glykogenpartikel zu erkennen, und dies ist insbesondere unter Bedingungen, unter denen Glykogen abgebaut wird, wie z. B. während der Muskelkontraktion, ein Problem.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methodensammlung eine Stichprobe der Techniken darstellt, die verwendet werden, um die Struktur des Glykogens und die Enzyme zu untersuchen, die den Anabolismus und Katabolismus dieses Makromoleküls regulieren. Diese Methoden werden entscheidend dazu beitragen, unser Verständnis des Glykogenstoffwechsels sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Zuständen zu verbessern.