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Bestimmung von Selbst(in)kompatibilitäts- und Inter(in)kompatibilitätsbeziehungen bei Zitrusfrüchten mittels manueller Bestäubung, Mikroskopie und S-Genotyp-Analysen

DOI:

10.3791/65056

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June 30th, 2023

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1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll bietet eine schnelle Methode zur Bestimmung der Pollenkompatibilität und -unverträglichkeit bei Zitrussorten.

Abstract

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Zitrusfrüchte nutzen die S-RNase-basierte Selbstinkompatibilität, um Selbstpollen abzulehnen, und benötigen daher für eine erfolgreiche Bestäubung und Befruchtung in der Nähe von Bestäuberbäumen. Die Identifizierung geeigneter Sorten, die als Bestäuber dienen können, ist jedoch ein zeitaufwändiger Prozess. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine schnelle Methode zur Identifizierung bestäubungskompatibler Zitrussorten entwickelt, die Agarose-Gelelektrophorese und Anilinblaufärbung nutzt. Die Pollenkompatibilität wird auf der Grundlage der Identifizierung von S-Genotypen durch Extraktion der Gesamt-DNA und Durchführung von PCR-basierten Genotypisierungsassays mit spezifischen Primern bestimmt. Zusätzlich werden die Stile 3-4 Tage nach der manuellen Bestäubung gesammelt und eine Anilinblaufärbung durchgeführt. Abschließend wird der Wachstumszustand der Pollenschläuche mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Pollenkompatibilität und -inkompatibilität kann festgestellt werden, indem beobachtet wird, ob das Pollenschlauchwachstum normal bzw. unterdrückt ist. Aufgrund ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz ist diese Methode ein effektives Werkzeug, um die Pollenkompatibilität und -inkompatibilität verschiedener Zitrussorten zu bestimmen, um Inkompatibilitätsgruppen und Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen verschiedenen Sorten zu ermitteln. Diese Methode liefert Informationen, die für die erfolgreiche Auswahl geeigneter Bestäuberbäume unerlässlich sind, und erleichtert so die Anlage neuer Obstplantagen und die Auswahl geeigneter Eltern für Zuchtprogramme.

Introduction

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Selbstinkompatibilität (SI) ist ein genetisch gesteuerter Mechanismus, der bei etwa 40 % der Angiospermenarten vorkommt. Dabei stößt der Stempel Pollen einer Pflanze mit gleichem SI-Genotyp ab und verhindert so die Selbstbefruchtung 1,2. Ma jia pummelo ist eine lokale Sorte in der Provinz Jinagsu, China, mit den hervorragenden Eigenschaften von großen, rosa Früchten, einem reichhaltigen Saftgehalt, einem süß-sauren Geschmack und einer dicken Schale3. Obwohl SI die Auskreuzung fördert, wirkt es sich negativ auf den Ertrag und die Qualität der Früchteaus 4 und erfo....

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Protocol

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1. Vorbereitung für die Anilinblaufärbung

  1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Werkzeuge für das Experiment vor: einen Bestäuberpinsel, eine Pinzette, einen Bleistift, Sulfatpapier, einen Bestäubungsbeutel, Zip-Lock-Beutel, Büroklammern, Formaldehyd, Eisessig, absolutes Ethanol, Zentrifugenröhrchen, Pinzetten, Klebstofftropfer, Glasobjektträger, Deckgläser, Skalpelle und Polyethylenglykol.
  2. Bereiten Sie in vitro Keimmedium her, das 0,02 %MgSO4, 0,01 % KNO 3, 0,03 % Ca(NO3)2, 0,01 % H3BO3, 20 % PEG-4000 und 15 % Saccharose enthält. Stellen Sie den pH-Wert....

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Results

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Für die hier durchgeführten Experimente wurden reife Blüten ausgewählt, die Staubbeutel gesammelt, in einem Ofen getrocknet und der Pollen 12 h lang bei 28°C gekeimt. Die Lebensfähigkeit und die Keimraten der Pollen wurden wie in Abbildung 1 dargestellt quantifiziert.

Zitrusfrüchte wurden manuell bestäubt und die Pollenverträglichkeit und -unverträglichkeit wurden mittels Anilinblaufärbung und Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Der verträgliche Pollen könnte auf der.......

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Discussion

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In Obstkulturen sind sowohl Parthenokarpie als auch SI wichtige Merkmale, da sie den Weg für kernlose Früchte ebnen - eine Eigenschaft, die von den Verbrauchern sehr geschätzt wird. Die Selbstinkompatibilität fördert die Abstoßung von Selbstpollen und beugt so Inzucht vor20. Unter den Zitrusfrüchten ist Pummelo eine selbstunverträgliche Sorte7. Fast 40% aller Angiospermenarten weisen SI21 auf. Diese Eigenschaft verhindert den Fruchtansatz, senkt den .......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie nichts zu enthüllen haben.

Acknowledgements

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Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523) finanziell unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
absolutes EthanolSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10009218
AnilinblauSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
Borsäure, H3BO3Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10004818
Braune FlascheLabgic Technology Co., Ltd
Calciumnitrat Tetrahydrat, Ca(NO3)2Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd80029062
ZentrifugalröhrchenLabgic Technology Co., Ltd
ZentrifugenröhrchenLabgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0(CAS)
DroppingJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
Ethylendiamintetraessigsäure, EDTASinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10009617
PinzetteLUXIANZI Biotechnology Co., Ltd
FormaldehydSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10010018
Vollautomatischer Proben-SchnellschleiferShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-96
EisessigSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218
MahlrohrShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd
IsoamylalkoholSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10003218
IsopropylalkoholSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80109218
EtikettM & Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.
Leica DMi8Shanghai Leica Co., Ltd21903797
Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
MICROSCOPE DeckglasZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318
BüroklammernM& Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.
BleistiftM& Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.
BestäuberbürsteShanghai Yimei Plastics Co., Ltd
Polyethylenglykol, PEG 6000Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., LtdDH229-1
Polyethylenglykol, PEG-4000Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd1521GR500
Kaliumhydroxid, KOHSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10017008
Kaliumnitrat, KNO3Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10017218
ScalpelJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
SlideZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
Natriumhydroxid, NAOHSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
SaccharoseSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd
SulfatpapierTaizhou Jinnong Mesh Factory
Thermostat WasserbadShanghai Jinghong Experimental Equipment Co., LtdL-909193
TrichlormethanSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10006818
Trikaliumphosphat tribasisches Trihydrat, K3PO4Shanghai Lingfeng Chemisches Reagenz Co., Ltd20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
Zip-Lock-BeutelM & Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.
β-MercaptoethanolGEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)
10021418

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
  2. Goldberg, E. E., et al.

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Citrus Self IncompatibilityS Genotype AnalysisManual PollinationPollen CompatibilityAniline Blue StainingAgarose Gel ElectrophoresisFluorescence MicroscopyPollen Tube GrowthPCR GenotypingPollinizer Selection

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