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Methodenartikel

Bestimmung von Selbst(in)kompatibilitäts- und Inter(in)kompatibilitätsbeziehungen bei Zitrusfrüchten mittels manueller Bestäubung, Mikroskopie und S-Genotyp-Analysen

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DOI:

10.3791/65056

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30. Juni 2023

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1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine schnelle Methode zur Bestimmung der Pollenkompatibilität und -unverträglichkeit bei Zitrussorten.

Zusammenfassung

Zitrusfrüchte nutzen die S-RNase-basierte Selbstinkompatibilität, um Selbstpollen abzulehnen, und benötigen daher für eine erfolgreiche Bestäubung und Befruchtung in der Nähe von Bestäuberbäumen. Die Identifizierung geeigneter Sorten, die als Bestäuber dienen können, ist jedoch ein zeitaufwändiger Prozess. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine schnelle Methode zur Identifizierung bestäubungskompatibler Zitrussorten entwickelt, die Agarose-Gelelektrophorese und Anilinblaufärbung nutzt. Die Pollenkompatibilität wird auf der Grundlage der Identifizierung von S-Genotypen durch Extraktion der Gesamt-DNA und Durchführung von PCR-basierten Genotypisierungsassays mit spezifischen Primern bestimmt. Zusätzlich werden die Stile 3-4 Tage nach der manuellen Bestäubung gesammelt und eine Anilinblaufärbung durchgeführt. Abschließend wird der Wachstumszustand der Pollenschläuche mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Pollenkompatibilität und -inkompatibilität kann festgestellt werden, indem beobachtet wird, ob das Pollenschlauchwachstum normal bzw. unterdrückt ist. Aufgrund ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz ist diese Methode ein effektives Werkzeug, um die Pollenkompatibilität und -inkompatibilität verschiedener Zitrussorten zu bestimmen, um Inkompatibilitätsgruppen und Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen verschiedenen Sorten zu ermitteln. Diese Methode liefert Informationen, die für die erfolgreiche Auswahl geeigneter Bestäuberbäume unerlässlich sind, und erleichtert so die Anlage neuer Obstplantagen und die Auswahl geeigneter Eltern für Zuchtprogramme.

Einleitung

Selbstinkompatibilität (SI) ist ein genetisch gesteuerter Mechanismus, der bei etwa 40 % der Angiospermenarten vorkommt. Dabei stößt der Stempel Pollen einer Pflanze mit gleichem SI-Genotyp ab und verhindert so die Selbstbefruchtung 1,2. Ma jia pummelo ist eine lokale Sorte in der Provinz Jinagsu, China, mit den hervorragenden Eigenschaften von großen, rosa Früchten, einem reichhaltigen Saftgehalt, einem süß-sauren Geschmack und einer dicken Schale3. Obwohl SI die Auskreuzung fördert, wirkt es sich negativ auf den Ertrag und die Qualität der Früchteaus 4 und erfordert geeignete Bestäuberbäume mit unterschiedlichen SI-Genotypen für zuverlässige Fruchtansatzraten und hohe Erträge. Gegenwärtig gibt es zwei Haupttypen von SI, die sporophytische Selbstinkompatibilität (SSI), die durch Brassicaceae repräsentiert wird, und die gametophytische Selbstinkompatibilität (GSI), die durch Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae und Solanaceae repräsentiert wird 5,6,7,8.

Zitrusfrüchte sind eine der wichtigsten Obstkulturen der Welt. Das S-RNase-basierte GSI-System findet sich in vielen Zitrusakzessionen und beeinflusst die Fruchtansatzrate negativ9. In diesem System wird SI durch den S-Locus kontrolliert, einen einzelnen polymorphen Locus mit zwei komplexen Allelen, die Stempel-S-Determinanten und Pollen-S-Determinanten 7 tragen. Die weibliche Determinante ist die S-Ribonuklease (S-RNase) und die männliche Determinante ist die S-Locus-F-Box (SLF)7. Die Zellen des Stempels sezernieren S-RNase-Proteine. Die non-self S-RNasen werden von den SLF-Proteinen erkannt, was zur Ubiquitinierung und zum Abbau der non-self S-RNasen durch den 26S Proteasomweg führt. Im Gegensatz dazu sind die eigenen S-RNasen in der Lage, das Pollenschlauchwachstum (PT) zu akkumulieren und zu hemmen, da sie den SLF-Proteinen ausweichen und daher an der Ubiquitinierung gehindert werden10,11,12,13.

Hier berichten wir über eine In-vivo-Technik, die für die Identifizierung von S-Genotypen und den Grad der Pollenkompatibilität und -inkompatibilität nützlich ist. Das Protokoll umfasst die Extraktion der Gesamt-DNA aus Blättern und die Vorhersage des S-Genotyps mithilfe von S-spezifischen Primern. Darüber hinaus liefern Anilinblaufärbung und Fluoreszenzmikroskopie mit anschließender Handbestäubung Hinweise auf den Grad der Verträglichkeit und Inkompatibilität. Das Semi-in-vivo-Bestäubungsverfahren, bei dem Blüten im Labor manuell bestäubt werden14,15, wurde ebenfalls angepasst, um den Grad der Selbstverträglichkeit und Inkompatibilität zu beurteilen. Wir haben jedoch auch eine Feldbestäubung mit anschließendem Einsacken von Blüten verwendet, um eine Kontamination durch unerwünschte Pollen zu vermeiden, damit sich die Pollenschläuche unter natürlichen Bedingungen entwickeln können. Dieses Protokoll ist einfach und unkompliziert und liefert die Informationen, die für die erfolgreiche Auswahl geeigneter Bestäuberbäume erforderlich sind.

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Protokoll

1. Vorbereitung für die Anilinblaufärbung

  1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Werkzeuge für das Experiment vor: einen Bestäuberpinsel, eine Pinzette, einen Bleistift, Sulfatpapier, einen Bestäubungsbeutel, Zip-Lock-Beutel, Büroklammern, Formaldehyd, Eisessig, absolutes Ethanol, Zentrifugenröhrchen, Pinzetten, Klebstofftropfer, Glasobjektträger, Deckgläser, Skalpelle und Polyethylenglykol.
  2. Bereiten Sie in vitro Keimmedium her, das 0,02 %MgSO4, 0,01 % KNO 3, 0,03 % Ca(NO3)2, 0,01 % H3BO3, 20 % PEG-4000 und 15 % Saccharose enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 6,0-6,2 ein. Verwenden Sie einen Magnetrührer, da PEG-4.000 schwer aufzulösen ist.
  3. Bereiten Sie die Carnoy-Fixierlösung vor, bei der es sich um absolutes Ethanol und Eisessig handelt, die im Verhältnis 3:1 gemischt werden. Bereiten Sie die FAA-Fixierungslösung vor, die aus 40 % Formaldehyd, 80 % Ethanol und Eisessig (1:8:1) besteht. Bereiten Sie 4 M Natriumhydroxid (NaOH) und Anilinblaulösung vor, die 0,1 % Anilinblau in 0,1 MK3PO4 ist. Verwenden Sie eine bernsteinfarbene Flasche, um die Anilinblaulösung aufzubewahren, da sie lichtempfindlich ist.

2. Pollensammlung

  1. Kennen Sie die Blütezeit der Versuchsbäume (Ma jia pummelo in dieser Studie) im Voraus. Sammle reife, ungeöffnete Blüten vom Beginn der Blütezeit bis zum Höhepunkt der Blütezeit und lege sie in einen Zip-Lock-Beutel. Die Blüten können bei 4 °C im Kühlschrank für 24 h gelagert werden.
  2. Bringen Sie die Blumen ins Labor. Sammeln Sie die Staubbeutel mit einer Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit Filterpapier. Sammle Staubbeutel von 20 bis 30 Blüten.
  3. Stellen Sie die Petrischale mit den Staubbeuteln für 24 h in einen 28 °C heißen Ofen, bis die Pollenkörner getrocknet sind. Für die detaillierte Blütenorganisation siehe Hu et al.9.
  4. Geben Sie den getrockneten Pollen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Bewahren Sie die Pollen in einem luftdichten Zip-Lock-Beutel auf, der farbwechselndes Kieselgel (Trockenmittel) enthält. Verschließen Sie den Beutel und beschriften Sie den Beutel mit dem Namen der Pollensorte und dem Datum der Lagerung. Der getrocknete Pollen kann in einem Kühlschrank bei −20 °C 96 Wochen gelagert werden16.

3. In-vitro-Pollenkeimungstest

  1. Gießen Sie 300 μl flüssiges Medium in eine Zellkulturschale oder die Kappe eines 2-ml-Zentrifugenröhrchens und bestreuen Sie den Pollen gleichmäßig mit Hilfe einer Bestäubungsbürste. Inkubieren Sie den Pollen bei 28 °C in einer befeuchteten dunklen Umgebung für 12 h.
  2. Entfernen Sie die oberen 1 mm der Spitze einer 1.000-μl-Pipettenspitze. Verwenden Sie die Pipette, um den Pollen mit einer kleinen Menge Kulturlösung aufzunehmen und in die Mitte des Objektträgers zu bringen. Decken Sie es mit einem Deckglas ab. Betrachten Sie die Probe mit einem inversen Mikroskop mit einem 10-fach-Objektiv.
  3. Führen Sie drei unabhängige Replikate durch, wobei für jedes Replikat ungefähr die gleiche Pollendichte verwendetwird 17. Kontrollieren Sie die Pollenmenge visuell und stellen Sie sicher, dass die gesamte Petrischale mit Pollen bedeckt ist und dass jede Petrischale fast die gleiche Menge an Pollen enthält.
  4. Der gekeimte Pollen produziert einen Pollenschlauch mit einer Länge von etwa dem Doppelten seines Durchmessers. Berechnen Sie die Keimrate aus 20 Sichtfeldern, die den prozentualen Anteil der gekeimten Pollen in allen Pollenfeldern angibt.

4. Bestäubung

  1. Wählen Sie einen sonnigen Tag ohne Wind für die Bestäubung. Wählen Sie 10 voll entwickelte Knospen aus, die kurz vor dem Öffnen stehen, schälen Sie die Blütenblätter vorsichtig ab und achten Sie darauf, sie nicht zu quetschen.
  2. Verwenden Sie eine Bestäubungsbürste, um eine ausreichende Menge lebensfähiger Pollen auf der Oberfläche der Narbe zu verteilen, und achten Sie darauf, den Stempel nicht zu beschädigen. Verwenden Sie für die Selbstbestäubung den Pollen derselben Pflanze/Sorte. Verwenden Sie für die Fremdbestäubung den Pollen einer Pflanze mit einem anderen Genotyp.
  3. Decken Sie die bestäubten Blüten mit einer Sulfat-Papiertüte ab. Verwenden Sie eine Büroklammer, um den Beutel zu verschließen und die Bestäubung durch genotypisch unterschiedliche Pollen zu verhindern.
  4. Schreiben Sie den Namen der Art sowie die Anzahl und den Zeitpunkt der Bestäubung auf das Etikett. Hängen Sie das Etikett an die Zweige in der Nähe der bestäubten Blüten.

5. Probenahme, Fixierung und Konservierung

  1. Entfernen Sie die Bestäubungsbeutel etwa 3-4 Tage nach der Bestäubung und sammeln Sie die bestäubten Blüten in Zip-Lock-Beuteln.
  2. Entfernen Sie sofort die Blütenblätter, Gefäße und Eierstöcke von den Blüten und tauchen Sie die zu den Stielen verschmolzenen Narben in ein Zentrifugenröhrchen mit einer frisch zubereiteten Fixierlösung. Inkubieren Sie die Narben und Griffel in der Fixierlösung über Nacht bei 4 °C.
  3. Entsorgen Sie am nächsten Tag die Fixierlösung und waschen Sie die Narben und Frisuren zwei- bis dreimal in 95%igem Ethanol.
  4. Übertragen Sie die Frisuren in eine 70%ige Ethanollösung. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in die Lösung eingetaucht ist. Die Styles können zu diesem Zeitpunkt 1-2 Monate bei 4 °C gelagert werden.

6. Anilinblau-Färbung

  1. Waschen Sie die in 70% Ethanol gelagerten Stilproben drei- bis viermal mit destilliertem Wasser. In 4 M NaOH-Lösung tauchen, verschließen und 60 min im 65 °C warmen Wasserbad inkubieren. Während dieses Schritts ändert sich die Farbe des Stils von gelb-weiß zu orange-rot.
  2. Die Frisuren 30 Minuten in destilliertem Wasser einweichen. Entsorgen Sie das destillierte Wasser und waschen Sie die Stile drei- bis viermal mit destilliertem Wasser oder bis die Farbe des Stils gelb wird.
  3. Geben Sie die Probe in ein 10-ml-Röhrchen, fügen Sie das Anilinblau hinzu, bis die Probe eingetaucht ist, und färben Sie sie 12 Stunden lang im Dunkeln.
  4. Beobachten Sie das Wachstum der Pollenschläuche mit einem Fluoreszenzmikroskop.

7. Fluoreszenzmikroskopie

  1. Bevor Sie die Proben betrachten, legen Sie den Objektträger auf einen flachen Tisch und geben Sie zwei bis drei Tropfen Polyethylenglykol auf die Oberfläche des Objektträgers.
  2. Waschen Sie den zu beobachtenden Stil mit destilliertem Wasser. Teilen Sie es mit einem Skalpell entlang der Längsachse in zwei Hälften. Legen Sie eine Hälfte des Stils auf den Objektträger und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.
  3. Legen Sie den Objektträger auf den Tisch des Mikroskops über der Blende und visualisieren Sie ihn mit einem 10-fach-Objektiv. Verwenden Sie den DAPI-Filter (Anregung: 325-375 nm; Emission: 435-485 nm). Beobachten Sie fünf Stile für jede Art der Bestäubung. Beobachte das Wachstum der Pollenschläuche.

8. PCR-basierte Identifizierung des S-Genotyps

  1. Extrahieren Sie die genomische DNA aus der Stigma-Probe mit der CTAB-Methode18.
    1. Geben Sie die gesammelten Blätter in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. HCl:EDTA:NaCl:H2O-Pufferim Verhältnis 1:1:3:5 und ein Chloroform-Isoamylalkoholgemisch im Verhältnis 24:1 herstellen
    2. Geben Sie 10 ml des vorbereiteten Puffers, 0,2 g CTAB und 200 μl Mercaptoethanol in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie 5 Minuten lang in ein Wasserbad bei 65 °C, bis die Lösung klar und transparent wird.
    3. Legen Sie die Klingen in einen Mörser, fügen Sie die gefrorenen Proben hinzu, fügen Sie flüssigen Stickstoff hinzu und mahlen Sie. Geben Sie die gemahlene Probe in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 600 μl CTAB-Mischung hinzu, legen Sie sie 60 Minuten lang in ein Wasserbad bei 65 °C und mischen Sie sie alle 30 Minuten auf den Kopf.
    4. Fügen Sie 700 μl des Chloroform-Isoamylalkohol-Gemischs (24:1) hinzu und mischen Sie es 10 Minuten lang kopfüber. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 24 °C bei 12.000 x g , pipettieren Sie den Überstand und füllen Sie ihn in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
    5. 60 μl 5 M NaCl-Lösung und 1 ml absolutes Ethanol zugeben und verkehrt herum mischen. 30 min bei −20 °C einfrieren und 5 min bei 24 °C und 9.000 x g zentrifugieren.
    6. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml 70%ige Ethanollösung hinzu und lassen Sie ihn 1-2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Bei 24 °C, 9.000 x g für 5 min zentrifugieren, Überstand entsorgen, überschüssige Ethanollösung absaugen und 5 min an der Luft trocknen lassen.
    7. Fügen Sie 100 μl steriles Wasser hinzu, um es aufzulösen, messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und frieren Sie es zur Langzeitlagerung in einem Gefrierschrank bei -4 °C ein.
    8. Konfigurieren Sie das RT-PCR-Reaktionssystem. Bereiten Sie die folgende Reaktionsmischung für 10 μl vor, die 5 μl 2x PCRMix, je 0,25 μl Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 1 μl DNA (100 ng/μl) und 3,5 μlH2Oenthält.
  2. Richten Sie das PCR-Programm gemäß Tabelle 1 ein. Das PCR-Programm für alle Isoformen betrug 95 °C für 5 min 32x (95 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 1 min) und 72 °C für 5 min. Trennen Sie die Produkte von 1,5%igen TAE-Agarose-Gelen und Foto9. Verifizieren Sie den spezifizierten S-Genotyp anhand genomischer DNA.

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Ergebnisse

Für die hier durchgeführten Experimente wurden reife Blüten ausgewählt, die Staubbeutel gesammelt, in einem Ofen getrocknet und der Pollen 12 h lang bei 28°C gekeimt. Die Lebensfähigkeit und die Keimraten der Pollen wurden wie in Abbildung 1 dargestellt quantifiziert.

Zitrusfrüchte wurden manuell bestäubt und die Pollenverträglichkeit und -unverträglichkeit wurden mittels Anilinblaufärbung und Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Der verträgliche Pollen könnte auf der...

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Diskussion

In Obstkulturen sind sowohl Parthenokarpie als auch SI wichtige Merkmale, da sie den Weg für kernlose Früchte ebnen - eine Eigenschaft, die von den Verbrauchern sehr geschätzt wird. Die Selbstinkompatibilität fördert die Abstoßung von Selbstpollen und beugt so Inzucht vor20. Unter den Zitrusfrüchten ist Pummelo eine selbstunverträgliche Sorte7. Fast 40% aller Angiospermenarten weisen SI21 auf. Diese Eigenschaft verhindert den Fruchtansatz, senkt den ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie nichts zu enthüllen haben.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523) finanziell unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
absolutes EthanolSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10009218
AnilinblauSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
Borsäure, H3BO3Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10004818
Braune FlascheLabgic Technology Co., Ltd
Calciumnitrat Tetrahydrat, Ca(NO3)2Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd80029062
ZentrifugalröhrchenLabgic Technology Co., Ltd
ZentrifugenröhrchenLabgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0(CAS)
DroppingJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
Ethylendiamintetraessigsäure, EDTASinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10009617
PinzetteLUXIANZI Biotechnology Co., Ltd
FormaldehydSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10010018
Vollautomatischer Proben-SchnellschleiferShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-96
EisessigSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218
MahlrohrShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd
IsoamylalkoholSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10003218
IsopropylalkoholSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80109218
EtikettM & Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.
Leica DMi8Shanghai Leica Co., Ltd21903797
Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
MICROSCOPE DeckglasZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318
BüroklammernM& Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.
BleistiftM& Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.
BestäuberbürsteShanghai Yimei Plastics Co., Ltd
Polyethylenglykol, PEG 6000Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., LtdDH229-1
Polyethylenglykol, PEG-4000Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd1521GR500
Kaliumhydroxid, KOHSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10017008
Kaliumnitrat, KNO3Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10017218
ScalpelJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
SlideZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
Natriumhydroxid, NAOHSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
SaccharoseSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd
SulfatpapierTaizhou Jinnong Mesh Factory
Thermostat WasserbadShanghai Jinghong Experimental Equipment Co., LtdL-909193
TrichlormethanSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10006818
Trikaliumphosphat tribasisches Trihydrat, K3PO4Shanghai Lingfeng Chemisches Reagenz Co., Ltd20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
Zip-Lock-BeutelM & Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.
β-MercaptoethanolGEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)
10021418

Referenzen

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