Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

2.2K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/65082

⸱

22. Dezember 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University, 2Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Pharmacology, University of Oxford

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll führt eine optische Dual-Dye-Kartierung von Mausherzen ein, die von Wildtyp- und Knock-in-Tieren mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie betroffen sind, einschließlich elektrophysiologischer Messungen der Transmembranspannung und intrazellulärerCa2+ -Transienten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Zusammenfassung

Die pro-arrhythmische Herzerkrankung katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) manifestiert sich als polymorphe ventrikuläre Tachykardie-Episoden nach körperlicher Aktivität, Stress oder Katecholamin-Provokation, die sich zu potenziell tödlichem Kammerflimmern verschlechtern können. Das Mäuseherz ist eine weit verbreitete Spezies zur Modellierung von erblichen Herzrhythmusstörungen, einschließlich CPVT. Die gleichzeitige optische Kartierung des Transmembranpotentials (Vm) und der Kalziumtransienten (CaT) aus Langendorff-perfundierten Mäuseherzen hat das Potenzial, die Mechanismen aufzuklären, die der Arrhythmogenese zugrunde liegen. Im Vergleich zur Untersuchung auf zellulärer Ebene kann die optische Mapping-Technik einige elektrophysiologische Parameter testen, wie z. B. die Bestimmung der Aktivierung, der Leitungsgeschwindigkeit, der Aktionspotentialdauer und der CaT-Dauer. In diesem Artikel werden der Aufbau der Instrumentierung und das experimentelle Verfahren für die optische Kartierung von CaT und Vm in murinen Wildtyp- und heterozygoten RyR2-R2474S/+-Herzen vorgestellt, kombiniert mit programmierter elektrischer Stimulation vor und während der Isoproterenol-Challenge. Dieser Ansatz hat eine praktikable und zuverlässige Methode zur mechanistischen Untersuchung der CPVT-Erkrankung in einem ex vivo Mausherzpräparat gezeigt.

Einleitung

Die katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) manifestiert sich als Episoden einer polymorphen ventrikulären Tachykardie (PVT) nach körperlicher Aktivität, Stress oder Katecholaminbelastung, die sich zu einem potenziell tödlichen Kammerflimmern verschlechtern kann 1,2,3,4 . Neuere Hinweise nach dem ersten Bericht als klinisches Syndrom im Jahr 1995 implizierten Mutationen in sieben Genen, die alle an der Freisetzung von Ca 2+ durch sarkoplasmatische retikuläre (SR) Speichern beteiligt sind: die am häufigsten berichteten RYR2-kodierenden Ryanodinrezeptor 2 (RyR2) der Ca2+-Freisetzungskanäle5,6, FKBP12.67, CASQ2, die für kardiales Calsequestrin8 kodieren, TRDN kodiert für das junktionale SR-Protein Triadin 9 und CALM1 9, CALM2 10 und CALM3, die identisch für Calmodulin11,12 kodieren. Diese genotypischen Muster führen die arrhythmischen Ereignisse auf die unregulierte pathologische Freisetzung des SR-Speichers Ca2+12 zurück.

Die spontane Freisetzung von Ca 2+ aus SR kann als Ca 2+ Funken oder Ca 2+ Wellen nachgewiesen werden, wodurch der Na+/Ca 2+ Austauscher (NCX) aktiviert wird. Der Wärmetauscher von einem Ca2+ für drei Na+ erzeugt einen nach innen gerichteten Strom, der die diastolische Depolarisation beschleunigt und die Membranspannung an die Schwelle des Aktionspotentials (AP) treibt. In RyR2-Knock-in-Mäusen führt die erhöhte Aktivität von RyR2R4496C im Sinusknoten (SAN) zu einer unerwarteten Abnahme der SAN-Automatik durch Ca2+-abhängige Abnahme der ICa,L- und SRCa2+-Depletion während der Diastole, wodurch subzelluläre pathophysiologische Veränderungen identifiziert werden, die zur SAN-Dysfunktion bei CPVT-Patienten beitragen13,14. Das Auftreten der verwandten zytosolischenCa2+-Wellen von Kardiomyozyten ist wahrscheinlicher, wenn die zytosolische [Ca2+] im Hintergrund nach einer RyR-Sensibilisierung durch Katecholamin, einschließlich Isoproterenol (ISO), erhöht wird.

Detaillierte kinetische Veränderungen in der Ca 2+ Signalübertragung nach RyR2-vermittelter Ca2+ Freisetzung als Reaktion auf die Aktivierung des Aktionspotentials (AP), die die Ursache für die beobachteten ventrikulären Arrhythmien in intakten kardialen CPVT-Modellen sein könnten, müssen noch für das gesamte Spektrum der berichteten RyR2-Genotypen bestimmtwerden 12. In diesem Artikel werden der Aufbau und die experimentelle Vorgehensweise für die Hochdurchsatzkartierung von Ca2+ Signalen und Transmembranpotentialen (Vm) in murinen Wildtyp- (WT) und heterozygoten RyR2-R2474S/+ Herzen vorgestellt, kombiniert mit programmierter elektrischer Stimulation vor und nach Isoproterenol-Provokation. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur mechanistischen Untersuchung der CPVT-Erkrankung in isolierten Mäuseherzen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Für die Experimente werden männliche 10 bis 14 Wochen alte Wildtyp-Mäuse oder RyR2-R2474S/+-Mäuse (C57BL/6-Hintergrund) mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Alle Verfahren wurden vom Komitee für Tierpflege und -verwendung der Southwest Medical University, Sichuan, China, genehmigt (Zulassungs-Nr.: 20160930) in Übereinstimmung mit den nationalen Richtlinien, nach denen die Einrichtung arbeitet.

1. Vorbereitung

  1. Lagerlösungen
    1. Blebbistatin-Stammlösung: 1 ml 100%iges Dimethylsulfoxid (DMSO) in den Originalkolben mit 2,924 mg (-) Blebistatin-Pulver geben, um eine Konzentration von 10 mM zu erreichen.
    2. Spannungsanzeiger RH237 Stammlösung: 1 ml 100% DMSO in den Originalkolben mit 1 mg RH237-Pulver geben, um eine Konzentration von 2,01 mM zu erreichen.
    3. Kalziumindikator Rhod-2 AM Stammlösung: Geben Sie 1 ml 100% DMSO in 1 mg Rhod-2 AM-Pulver, um eine Konzentration von 0,89 mM zu erreichen.
    4. Pluronic F127 Stammlösung: 1 ml 100% DMSO in 200 mg Pluronic F127 geben, um eine Konzentration von 20% w/v (0,66 mM) zu erreichen.
    5. Aliquotieren Sie die Stammlösungen in 200-μl-PCR-Röhrchen in 21-51 μl (21 μl RH237, 31 μl Rhod-2 AM und 51 μl Blebbistatin) zur einmaligen oder doppelten Verwendung, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Wickeln Sie die Lösungen dann in Aluminiumfolie ein und lagern Sie sie bei -20 °C, mit Ausnahme der Pluronic F127-Stammlösung, die in einem dunklen Raum bei Raumtemperatur gelagert wird.
  2. Perfusionslösung
    1. Krebslösung (in mM): Bereiten Sie 1 L Krebslösung (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 und Glucose 10) vor.
    2. Die Lösung wird mit einem aseptischen 0,22-μm-Nadelfilter filtriert und mit 95 % O2/5 %CO2 oxygeniert.
    3. Nehmen Sie 40 ml Krebslösung in ein 50-ml-Zentrifugalröhrchen und lagern Sie es bei 4 °C für die anschließende Herzisolierung.
  3. Das Langendorff-Perfusionssystem und das optische Mapping-Gerät
    1. Richten Sie das Langendorff-Perfusionssystem ein.
      1. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
      2. Waschen Sie das Langendorff Perfusionssystem mit 1 L deionisiertem Wasser.
      3. Perfundiert die Lösung aus dem Ansaugtrakt und stellen Sie die Abflussrate auf 3,5-4 ml/min ein. Anschließend wird das Perfusat mit O2/CO2-Gas (95 %/5 %) bei 37 °C oxygeniert.
        HINWEIS: Eine Blase ist im Perfusionssystem niemals erlaubt.
    2. Bereiten Sie das optische Mapping-System vor.
      1. Installieren Sie die EMCCD-Kamera (512 × 512 Pixel), die Linse (40-fache Vergrößerung), die Leuchtdioden (LEDs) des Wellenlängenteilers, den EKG-Monitor (Elektrokardiogramm) und die Stimulationselektrode (Abbildung 1).
      2. Stellen Sie den richtigen Arbeitsabstand zwischen der Linse und der Herzposition ein.
      3. Stellen Sie zwei LEDs an der diagonalen Position des Thermostatbades für eine gleichmäßige Ausleuchtung ein und stellen Sie eine Wellenlänge von 530 nm zur Erzeugung von Anregungslicht bereit. Verwenden Sie einen ET525/50 Sputter-beschichteten Filter, um jegliches Out-of-Band-Licht für die LEDs zu entfernen.
      4. Stellen Sie den Griffschalter so ein, dass ein gleichmäßiges Quadrat der Zieloberfläche erreicht wird, sodass die Spannungs- und Kalziumbilder auf der Erfassungsschnittstelle angemessen angezeigt werden.
      5. Drehen Sie die Blende des Objektivs auf den maximalen Durchmesser, um ein Austreten von Spannungs- oder Kalziumsignalen zu vermeiden.
      6. Stellen Sie das Kameraobjektiv auf die richtige Höhe ein, da es einen feinen Arbeitsabstand zum Thermostatbad hat, meistens werden 10 cm verwendet.
      7. Schalten Sie die Kamera für eine stabile Probenahmetemperatur bei -50 °C ein.

2. Verfahren

  1. Entnahme, Kantubierung und Perfusion von Mäuseherzen
    1. Intraperitoneal injizieren Sie den Tieren Avertinlösung (1,2 %, 0,5-0,8 ml) und Heparin (200 Einheiten), um Leiden und Schmerzreflexe zu minimieren und die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. Nach 15 Minuten opfern Sie die Tiere durch Gebärmutterhalsverrenkung.
    2. Öffnen Sie den Brustkorb mit einer Schere, entnehmen Sie das Herz vorsichtig und legen Sie es in die kalte Krebslösung (4 °C, 95 % O2, 5 %CO2), um den Stoffwechsel zu verlangsamen und das Herz zu schützen.
    3. Entfernen Sie das umliegende Gewebe der Aorta, kanülieren Sie die Aorta mit einer speziell angefertigten Kanülennadel (Außendurchmesser: 0,8 mm, Innendurchmesser: 0,6 mm, Länge: 27 mm) und fixieren Sie sie mit einer 4-0 Seidennaht.
    4. Das Herz mit dem Langendorff-System mit einer konstanten Geschwindigkeit von 3,5-4,0 ml/min durchbluten und die Temperatur bei 37 ± 1 °C halten.
      HINWEIS: Alle nachfolgenden Verfahren werden in diesem Zustand ausgeführt.
    5. Führen Sie ein kleines Kunststoffröhrchen (0,7 mm Durchmesser, 20 mm Länge) in die linke Herzkammer ein, um den Lösungsstau in der Kammer zu lösen und eine Überlastung zu vermeiden.
  2. Entkoppler von Anregungs-Kontraktion und Dual-Dye-Beladung
    1. Stecken Sie zwei Elektroden in das Perfusat in der Badewanne, schalten Sie die Stromversorgung der EKG-Verstärkerbox und des elektrischen Stimulationsreglers ein und starten Sie dann die referenzierte EKG-Software und überwachen Sie das EKG kontinuierlich.
    2. Führen Sie die folgenden Schritte im Dunkeln durch, wenn das Herz einen stabilen Zustand erreicht hat (das Herz schlägt rhythmisch mit ~400 Schlägen pro Minute).
    3. Mischen Sie 50 μl 10 mM Blebistatin-Stammlösung mit 50 ml Krebslösung, um eine Konzentration von 10 μM zu erreichen. Perfusionieren Sie die Blebistatin-Krebs-Lösungsmischung 10 Minuten lang konstant in das Herz, um die Kontraktion von der Erregung zu entkoppeln und Kontraktionsartefakte während des Filmens zu vermeiden.
    4. Verwenden Sie eine rote Taschenlampe, um zu überprüfen, ob die Herzkontraktion vollständig aufhört, da die Kontraktion die Qualität der Farbstoffbeladung beeinflusst.
    5. Nach der Entkopplung von Anregung und Kontraktion werden 15 μl Rhod-2 AM-Stammlösung mit 15 μl pluronic F127-Stammlösung in 50 ml Krebslösung gemischt, um die Endkonzentrationen von 0,267 μM Rhod-2 AM und 0,198 μM pluronic F127 zu erreichen. Anschließend wird das Herz 15 Minuten lang kontinuierlich mit Rhod-2 AM-Arbeitslösung im Langendorff-Perfusionssystem perfundiert.
    6. Halten Sie die Sauerstoffversorgung während der intrazellulären Kalziumfarbstoffbeladung aufrecht. Da sich in Pluronic F127 leicht Blasen bilden, sollte eine Blasenfalle in das Perfusionssystem eingesetzt werden, um eine Gasembolisation der Herzkranzgefäße zu vermeiden.
    7. Verdünnen Sie 10 μl RH237-Stammlösung mit 50 ml Perfusat, um die Endkonzentration bei 0,402 μM zu erreichen, und führen Sie eine 10-minütige Beladung durch.
    8. Machen Sie am Ende der Dual-Dye-Beladung eine Reihe von Fotos, um sicherzustellen, dass sowohl die Spannungs- als auch die Kalziumsignale für die Analyse geeignet sind (keine Wechselwirkung zwischen zwei Signalen).
  3. Optische Kartierung und Arrhythmie-Induktion
    ANMERKUNG: Die optische Kartierung beginnt nach Beendigung der Kontraktion und einer entsprechenden Farbstoffbeladung, und das Herz wird nacheinander perfundiert, wie in den oben unter 2.1 (4) beschriebenen Schritten beschrieben.
    1. Schalten Sie die beiden LEDs für die Anregungslichter ein und stellen Sie ihre Intensität in einem geeigneten Bereich ein (stark genug für Beleuchtung und relativ einfaches Filmen, aber nicht zu robust für Überbelichtung).
    2. Legen Sie das Herz unter das Erkennungsgerät, stellen Sie sicher, dass es von zwei LEDs ausreichend beleuchtet wird, und stellen Sie den Lichtfleckdurchmesser auf 2 cm ein.
    3. Stellen Sie den Arbeitsabstand von der Linse zum Herzen auf 10 cm ein, was eine Abtastrate von fast 500 Hz und eine räumliche Auflösung von 120 x 120 μm pro Pixel ergibt.
    4. Öffnen Sie die Signalabtastsoftware, um die Kamera digital zu steuern und gleichzeitig Spannungs- und Kalziumsignale zu erfassen.
    5. Starten Sie den Myopacer-Feldstimulator und stellen Sie das Stimulationsmuster auf Transistor-Transistor-Logik (TTL), 2 ms Stimulationsdauer für jeden Impuls und 0,3 V als Anfangsintensität ein.
    6. Verwenden Sie 30 aufeinanderfolgende 10 Hz S1-Stimuli, um die diastolische Spannungsschwelle des Herzens zu testen, die von der EKG-Aufzeichnungssoftware gesteuert wird. Erhöhen Sie die Spannungsamplitude schrittweise, bis eine 1:1-Erfassung erreicht ist (überprüfen Sie die QRS-Welle des EKG-Monitors, die Signale des Aktionspotentials (AP) und der Kalziumtransienten (CaT).
    7. Nach der Bestimmung der Spannungsschwelle wird das Herz mit einer Intensität von 2x der diastolischen Spannungsschwelle mit einem Paar Platinelektroden beschleunigt, die am Epikardial der linken Herzkammerspitze (ELVA) befestigt sind.
    8. Implementieren Sie das S1S1-Protokoll zur Messung von Kalzium- oder Aktionspotentialalternativen und Restitutionseigenschaften. Takten Sie das Herz nacheinander mit einer grundlegenden Zykluslänge von 100 ms und verringern Sie die Zykluslänge in jeder folgenden Sequenz um 10 ms, bis 50 ms erreicht sind. Jede Episode enthält 30 aufeinanderfolgende Stimuli mit einer Pulsbreite von 2 ms. Beginnen Sie gleichzeitig mit dem optischen Mapping vor der Stimulation (die Abtastzeit umfasst ~10 Sinusrhythmen und Stimulationsdauer).
    9. Um die ventrikuläre effektive Refraktärperiode (ERP) unter Verwendung des S1S2-Stimulusprotokolls zu messen, beginnen Sie mit einer S1S1-Schrittzykluslänge von 100 ms, wobei ein S2 mit 60 ms gekoppelt ist, mit einer 2-ms-Schrittdekrementierung, bis S2 den ektopischen QRS-Komplex nicht mehr erfassen kann.
    10. Bei der Induktion von Arrhythmien führen Sie eine kontinuierliche 50-Hz-Burst-Stimulation (50 kontinuierliche elektrische Stimulationen mit einer Pulsbreite von 2 ms) durch und führen Sie die gleiche Stimulationsepisode nach einem Ruheintervall von 2 s durch.
    11. Beobachten Sie die EKG-Aufzeichnungen während der kontinuierlichen Hochfrequenz-Stimulationsphase sorgfältig, damit die gleichzeitigen optischen Mapping-Aufzeichnungen sofort beginnen können, wenn eine interessante arrhythmische EKG-Welle erzeugt wird (da die meisten Herzrhythmusstörungen durch elektrische Stimulation induziert werden, werden die optischen Signale 2-3 s vor der Burst-Stimulation abgetastet, falls wichtige kardiale Ereignisse verloren gehen).
    12. Bild mit EMCCD-Kamera (Abtastrate: 500 Hz, Pixelgröße: 64 x 64).
  4. Datenanalyse
    1. Bildbelastung und Signalverarbeitung
      1. Klicken Sie auf Ordner auswählen und Bilder laden, um die Bilder in die Bilderfassungssoftware zu laden, um eine halbautomatische Analyse von Massenvideodaten gemäß dem zuvor beschriebenen Setup und Protokollzu ermöglichen 15,16.
      2. Geben Sie die richtigen Sampling-Parameter ein (z. B. Pixelgröße und Framerate).
      3. Legen Sie den Bildschwellenwert durch manuelle Eingabe fest und wählen Sie die Region of Interest (ROI) aus.
      4. Implementieren Sie einen 3 x 3-Pixel-Gauß-Raumfilter, einen Savitzky-Goaly-Filter und eine Basislinienkorrektur mit Zylinder.
      5. Drücken Sie auf Prozessbilder, um die Baseline zu entfernen und die elektrophysiologischen Parameter wie APD80 und CaTD50 zu berechnen.
    2. Analyse elektrophysiologischer Parameter
      1. Stellen Sie die Initiierungszeit der APD am Peak und den Endpunkt bei 80% Repolarisation (APD80) für die Berechnung von APD80 ein. In ähnlicher Weise wird die CaTD-Startzeit als Peak und der Endpunkt als 80%ige Relaxation definiert.
      2. Die Messung der Leitungsgeschwindigkeit (CV) hängt von der Pixelgröße und der Aktionspotential-Leitungszeit zwischen zwei oder mehr Pixeln ab. Berechnen Sie die durchschnittliche Geschwindigkeit aus allen ausgewählten Pixeln - dies ist die mittlere Leitungsgeschwindigkeit des ausgewählten Bereichs. Generieren Sie gleichzeitig entsprechende isochrone Karten für eine klare Sicht auf die Leitungsrichtung.
        HINWEIS: O'Shea et al.15 berichteten ausführlich über die CV-Messung.
      3. Für die Analyse von Alternanen und Arrhythmien werden Calcium-Alternane als eine kontinuierliche große und kleine Peakamplitude definiert, die abwechselnd auftreten. Verwenden Sie das Spitzenamplitudenverhältnis, um den Schweregrad von frequenzabhängigen Alternanen (1-A2/A1) zu bewerten. Wenden Sie Phasenkarten an, um komplexe Arrhythmien wie ventrikuläre Tachykardie (VT) zu analysieren. Achten Sie darauf, dass die Rotoren in einem bestimmten Bereich deutlich erscheinen, wenn sich die Rotoren verschieben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die optische Kartierung war in den letzten zehn Jahren ein beliebter Ansatz zur Untersuchung komplexer Herzrhythmusstörungen. Der optische Mapping-Aufbau besteht aus einer EMCCD-Kamera, die eine Abtastrate von bis zu 1.000 Hz und eine räumliche Auflösung von 74 x 74 μm für jedes Pixel bietet. Es ermöglicht ein relativ hohes Signal-Rausch-Verhältnis bei der Signalabtastung (Abbildung 1). Sobald das Langendorff-perfundierte Herz einen stabilen Zustand erreicht hat und die Farbstoffbeladung abg...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Basierend auf unserer Erfahrung sind die Schlüssel zu einer erfolgreichen optischen Dual-Dye-Kartierung eines Mausherzens eine gut vorbereitete Lösung und ein gut vorbereitetes Herz, die Farbstoffbeladung, das Erreichen des besten Signal-Rausch-Verhältnisses und die Reduzierung des Bewegungsartefakts.

Herstellung der Lösung
Die Krebslösung ist für ein erfolgreiches Herzexperiment unerlässlich. MgCl2- undCaCl2-Stammlösungen (1 mol/L) werden im Voraus unter Berücks...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu deklarieren.

Danksagungen

Diese Studie wird von der National Natural Science Foundation of China (81700308 zu XO und 31871181 zu ML und 82270334 zu XT), dem Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 bis XO, 23ZYZYTS0433 und 2022YFS0607 bis XT und 2022NSFSC1602 bis TC) und dem State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 bis XO) unterstützt. MRC (G10031871181 bis ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE in Oxford (ML) Stipendien.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 μ m SpritzenfilterFabrik für medizinische Geräte von Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/AZur Filterlösung
15 mL ZentrifugenröhrchenGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur-PipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SpritzeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μ L PCR-RöhrchenSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Alitieren Sie die Stammlösungen  um wiederholtes Einfrieren und Auftauen
50 mL Zentrifugenröhrchenzu vermeiden Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China4 μg; C für die Nachsorge Herzisolierung
585/40 nm FilterChromaTechnology N/AFilter für Calciumsignal
630 nm LangpassfilterChroma TechnologyG15604AJFilter für Spannungssignal
Avertin (2,2,2-Tribromethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Vereinigtes KönigreichT48402-100GZur Minimierung von Leiden und Schmerzreflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, Vereinigte StaatenSLBV5564Anregungs-Kontraktions-Entkoppler zur Beseitigung von Bewegungsartefakten während des Mappings
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte StaatenSLBK1794VFür die Lösung von Tyrode
Maßgeschneidertes ThermostatbadMappingLab, Vereinigtes KönigreichTBC-2.1Zur Aufrechterhaltung der Temperatur der Perfusionslösung
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Lösungsmittel für Farbstoffe
Dumont PinzettenFabrik für medizinische Geräte von Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap SoftwareUniversität BirminghamN/AQuantifizierung elektrischer Parameter
EMCCD-KameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, Vereinigte StaatenA18G150001Erfassen Sie Bilder für optische Signale
ET525/36 Sputter-beschichteter FilterChroma-Technologie319106Anregungsfilter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte StaatenSLBT4811VFür Tyrode-Lösung
Heparin-NatriumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)Zur Vorbeugung von Blutgerinnseln in der Koronararterie
  Iris-ZangeFabrik für medizinische Geräte von Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, Vereinigte StaatenHY-B0468 / CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte StaatenSLBS5003Für die Lösung von Tyrode
MacroLEDCairn Research, Faversham, Vereinigtes Königreich7355/7356Das Anregungslicht von Fluoreszenzsonden
MacroLED-LichtquelleCairn Research, Faversham, Vereinigtes Königreich7352Steuerung der LEDs
Mayo-Scherefür medizinische Geräte von Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN / AOptische Signale zur Abtastung
von MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte StaatenBCBS6841VFür die Tyrode-Lösung
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, Vereinigtes KönigreichM5337Verbinden Sie den elektrischen Stimulator und die Spike2-Software
MyoPacer EP FeldstimulatorIon Optix Co, Milton, MA, Vereinigte StaatenS006152Elektrischer Stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte StaatenSLBS2340VFür die Lösung von Tyrode
NaH2PO4  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte StaatenBCBW9042Für die Tyrode-Lösung
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte StaatenSLBX3605Für die Tyrode-Lösung
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229Für EKG-Verstärker
OmapScope5MappingLab, Vereinigtes KönigreichN/ACalcium-Alternans und Arrhythmie-Analyse
Ophthalmische SchereHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, Vereinigtes Königreich6970Teilen Sie das Emissionslicht zur Detektion von Ca2+ und Vm  gleichzeitig
Peristalische PumpeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, BT100-2JZum Pumpen der Lösung
PetrischaleBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, Vereinigte Staaten1899021Zur Erhöhung der Beladung mit Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Vereinigte Staaten1971387Spannungsempfindlicher Farbstoff
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, Vereinigte Staaten1890519Kalziumindikator
KieselgelschlauchLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Verbinden Sie sich mit der Peristaltikpumpe
SeidennahtYuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, China20172650032Zur Fixierung der Aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, Vereinigtes KönigreichN/AZum Aufzeichnen und Analysieren von EKG-Daten
Stimulation ElektrodeMappingLab, Vereinigtes KönigreichSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461Für Lichtquelle
T565lpxrChroma Technology321343Für Lichtquelle
von CFT011500 Lagern Sie die Lösung von Tyrode bei Fabrik

Referenzen

  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
  3. Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).
  4. Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).
  5. Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
  6. Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
  7. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  8. Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
  9. Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).
  10. Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
  11. Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
  12. Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
  13. Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
  14. Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
  15. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).
  16. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).
  17. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  18. Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).
  19. Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
  20. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
  21. Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  22. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  23. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).
  24. He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314(2021).
  25. Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
  26. Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).
  27. Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
  28. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
  29. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  30. Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
  31. Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).
  32. He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).
  33. Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
  34. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  35. Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Dual Farbstoff ImagingRyR2 Knock in M useLangendorff PerfusionCalcium TransientenMembranpotenzialAktionspotenzialdauerIsoproterenol ChallengeHerzarrhythmie Modelle
Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.