Methodenartikel

Herstellung von humanen Neurogenin 2-induzierbaren Neuronen in einem dreidimensionalen Suspensionsbioreaktor

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DOI:

10.3791/65085

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17. März 2023

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1Fraunhofer Project Center for Stem Cell Process Engineering, Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 2Bioneer A/S, 3Fraunhofer UK Research Ltd, Technology and Innovation Centre, 4Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 5Department of Molecular and Cellular Biotechnology, Saarland University, 6Facultad de Ciencias del Mar, Universidad Católica del Norte

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Neuronen in einem 3D-Suspensionsbioreaktor.

Zusammenfassung

Die Ableitung neuronaler Stammzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) markierte einen Meilenstein in der Hirnforschung. Seit ihrem ersten Aufkommen wurden die Protokolle kontinuierlich optimiert und sind heute in der Forschung und Arzneimittelentwicklung weit verbreitet. Die sehr lange Laufzeit dieser konventionellen Differenzierungs- und Reifungsprotokolle und die steigende Nachfrage nach qualitativ hochwertigen hiPS-Zellen und ihren neuronalen Derivaten erhöhen jedoch die Notwendigkeit der Übernahme, Optimierung und Standardisierung dieser Protokolle für die Großserienproduktion. In dieser Arbeit wird ein schnelles und effizientes Protokoll zur Differenzierung von genetisch veränderten, Doxycyclin-induzierbaren Neurogenin 2 (iNGN2)-exprimierenden hiPSCs in Neuronen unter Verwendung eines dreidimensionalen (3D) Suspensionsbioreaktors vorgestellt.

Kurz gesagt, Einzelzellsuspensionen von iNGN2-hiPSCs konnten innerhalb von 24 Stunden Aggregate bilden, und die neuronale Linienbindung wurde durch die Zugabe von Doxycyclin induziert. Die Aggregate wurden nach 2 Tagen Induktion dissoziiert und die Zellen wurden entweder kryokonserviert oder für die terminale Reifung neu plattiert. Die generierten iNGN2-Neurone exprimierten schon früh klassische neuronale Marker und bildeten innerhalb von 1 Woche nach dem Replating komplexe neuritische Netzwerke, was auf eine zunehmende Reife der neuronalen Kulturen hinweist. Zusammenfassend wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die schnelle Generierung von hiPSC-abgeleiteten Neuronen in einer 3D-Umgebung bereitgestellt, das ein großes Potenzial als Ausgangspunkt für die Modellierung von Krankheiten, phänotypische Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings und groß angelegte Toxizitätstests birgt.

Einleitung

Neurologische Erkrankungen sind weltweit die häufigste Ursache für Behinderungen1. Jeder sechste Mensch ist betroffen, Tendenz steigend. Die damit verbundene finanzielle Belastung für die Gesellschaften und ihre Gesundheitssysteme ist enorm. Eine Evaluierung von 30 europäischen Ländern im Jahr 2010 schätzte die jährlichen Kosten im Zusammenhang mit psychischen und neurologischen Erkrankungen auf 800 Mrd. EUR2. Die zunehmende sozioökonomische Belastung erfordert effektive Behandlungsstrategien, und obwohl unser Verständnis der Pathophysiologie von Krankheiten erheblich zugenommen hat, ist die Translation in die Klinik oft unzureichend. Im Allgemeinen werden nur 12 % der Arzneimittel in klinische Studien aufgenommen, von denen mehr als 80 % in späteren Phasen scheitern, hauptsächlich aufgrund von Unwirksamkeit oder unvorhergesehener Toxizität 3,4. Die Gründe sind vielfältig, aber die eingeschränkte Übertragbarkeit von Tierversuchen in präklinischen Stadien auf Humanversuche ist zunehmend in den Vordergrund gerückt5. Humane In-vitro-Zell- und Gewebemodelle können die Lücke der interspeziesübergreifenden Translation schließen, und Fortschritte in der Technologie der human-induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) haben in dieser Hinsicht großes Potenzial. hiPS-Zellen sind in der Grundlagenforschung weit verbreitet und haben wesentliche Eigenschaften mit embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) gemeinsam, wie z. B. eine nahezu unbegrenzte Selbsterneuerungsfähigkeit und die Fähigkeit, sich in alle drei Keimblätter zu differenzieren6, während ethische Bedenken im Zusammenhang mit der Zerstörung von Embryonen umgangen werden.

Die Ableitung neuronaler Zellen aus hES-Zellen und später hiPS-Zellen markierte einen Meilenstein in der Hirnforschung. Die ersten Differenzierungsprotokolle basierten auf der Anwendung von Wachstumsfaktoren, die kritische Schritte während der Embryogenese nachahmten, von denen die meisten eine duale SMAD-Hemmung entweder in Suspensions- oder adhärenten Kulturen beinhalteten 7,8,9. Reife Neuronen wurden erfolgreich generiert, aber einige Nachteile dieser Protokolle behindern immer noch ihren breiten Einsatz in der Arzneimittelentwicklung, wie z. B. die geringe Ausbeute und die hohe Variabilität der erzeugten Neuronen von Charge zu Charge sowie die umfangreiche Arbeitsbelastung im Zusammenhang mit langen Kulturzeiten. Verbesserungen wurden durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren erzielt, die entscheidend an der Neurogenese beteiligt sind, und Mitglieder der Neurogenin (NGN)-Familie, insbesondere NGN2, wurden als effektive Treiber identifiziert10. Die lentiviral-vermittelte ektopische Expression von NGN2 in hiPS-Zellen beschleunigte die frühen Stadien der neuronalen Differenzierung signifikant und induzierte das neuronale Zellschicksal innerhalb von nur 1 Woche11. Die anschließende terminale Reifung in Kokulturen mit Astrozyten ergab funktionelle Neurone in hoher Reinheit und Menge mit reproduzierbaren Eigenschaften. Die gezielte Genom-Editierung des Safe-Harbor-Locus der Adeno-assoziierten Virusintegrationsstelle 1 (AAVS1) wurde dann angewendet, um hiPSC-Linien mit einer stabilen und Doxycyclin-induzierbaren Expressionskassette für NGN212,13 zu erzeugen und so unerwünschte Nebenwirkungen der lentiviralen Verabreichung zu minimieren.

Die robuste und effiziente Differenzierung von Doxycyclin-induzierbaren Neurogenin 2 (iNGN2)-Neuronen birgt ein großes Potenzial für phänotypische Wirkstoffscreenings und Toxizitätsassays mit hohem Durchsatz10,14,15; In den letzten zehn Jahren wurden erhebliche Fortschritte in der Bioprozesstechnik bei der Implementierung von Bioreaktoren für eine skalierbare Zellexpansion und -differenzierung erzielt16,17,18,19. Die meisten Differenzierungsprotokolle sind jedoch für adhärente Kulturen optimiert, und die Übersetzung in eine dreidimensionale (3D) Umgebung erfordert oft wesentliche Modifikationen. Kürzlich wurde über den erfolgreichen Einsatz eines Tisch-3D-Bioreaktors mit reduzierten Scherspannungsmerkmalen für die Expansion von hiPSCs und für die reproduzierbare Differenzierung in Hepatozyten, Kardiomyozyten und Neuronen berichtet20. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Charakterisierung von iNGN2-Neuronen unter Verwendung des identischen 3D-Bioreaktors bereitgestellt.

Protokoll

Anmerkungen: Alle Zellmanipulationen sowie Kulturschalen und Medienzubereitungen sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Die Laminar-Flow-Haube sollte vor dem Gebrauch und nach der Verarbeitung gründlich gereinigt werden, indem alle Oberflächen mit 70%igem Ethanol abgewischt werden. Das beschriebene Protokoll ist für neuronale Differenzierungen in einem CERO 3D-Inkubator und Bioreaktor (im Folgenden als Benchtop-Bioreaktor bezeichnet) optimiert. Dieser Tisch-Bioreaktor bietet vier Steckplätze für spezielle Bioreaktorröhrchen mit einem maximalen Fassungsvermögen von jeweils 50 ml. Temperatur und CO2 - Gehalt werden kontinuierlich geregelt und die Anbauparameter (z. B. Drehzahl und Zeit) werden für jedes Rohr unabhängig voneinander geregelt. Alle Aspirationsschritte wurden, sofern nicht anders angegeben, mit einer Aspirationspipette und einer Vakuumpumpe durchgeführt.

1. Kultivierung und Expansion hiPS-Zellen

HINWEIS: In diesem Protokoll wird die technisch hergestellte Doxycyclin-induzierbare NGN2 hiPSC-Linie BIONi010-C-13 verwendet. Das hier bereitgestellte Expansionsprotokoll ist für 6-cm-Petrischalen optimiert, es können jedoch alternative Kulturformate verwendet werden, wenn dies bevorzugt wird.

  1. 6 cm Petrischalen mit Basalmembranmatrix bestreichen, verdünnt in kaltem modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12 (-/-) von Dulbecco mit einer Endkonzentration von 0,083 mg/ml/10cm2. Die beschichteten Schalen bei 37 °C mindestens 30 min inkubieren.
    HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll für die Herstellung der Basalmembranmatrixlösung finden Sie in den Anweisungen des Herstellers. hiPSCs können zur Expansion auf alternativen extrazellulären Matrices kultiviert werden.
  2. Auftauen von kryokonservierten hiPSCs gemäß dem EBiSC Cell line User Protocol21 in feederfreiem iPSC-Erhaltungsmedium + 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632). Empfohlen wird eine Aussaatdichte von 1 × 106 lebensfähigen Zellen pro 60 mm Schale.
  3. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag auf ein zuführfreies iPSC-Erhaltungsmedium ohne ROCK-Inhibitor und führen Sie einen täglichen Medienwechsel durch.
  4. Beginnen Sie mit der Passage, wenn die hiPSC-Kulturen eine Konfluenz von 60%-80% erreichen. Suchen Sie nach differenzierten Bereichen und reinigen Sie die Kolonien manuell, wenn die Fläche 5 % überschreitet.
    HINWEIS: Undifferenzierte hiPS-Zellen erscheinen als runde Zellen mit einem prominenten Nukleolus und weniger Zytoplasma. Flache und dicht gepackte Kolonien werden früh nach dem Auftauen oder Passieren gebildet. Beispielhafte Hellfeldbilder von hiPSC-Kulturen sind in Abbildung 1 dargestellt. Weitere Informationen finden Sie im EBiSC Cell line User Protocol21. Bereiten Sie für die Durchlässigkeit Schalen mit Membranmatrix im Keller und ein zuführfreies iPSC-Wartungsmedium vor.
  5. Saugen Sie das Medium aus hiPSC-Kulturen ab und spülen Sie die Zellen 2x mit 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in 1x Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) ohne Ca 2+ und Mg2+ (DPS [-/-], siehe Materialtabelle).
  6. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 2 mL 0,5 mM EDTA in 1x DPBS (-/-) in die 6 cm Petrischale. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 3 min im Inkubator.
  7. 1,5 ml der EDTA-Lösung aufsaugen und 3-5 Minuten lang inkubieren.
  8. Klopfen Sie vorsichtig auf das Geschirr, um die Zellablösung zu erleichtern.
    HINWEIS: Überprüfen Sie die Ablösung durch visuelle Beurteilung. hiPSC-Kolonien sollten sich nach 5 min ablösen, aber bei höher konfluenten hiPSC-Kulturen kann eine längere Inkubationszeit erforderlich sein. Wenn sich die Völker nicht lösen, erhöhen Sie die Inkubationszeit auf 10 Minuten, überschreiten Sie diesen Zeitraum jedoch nicht.
  9. Geben Sie 5 ml des feederfreien iPSC-Erhaltungsmediums in die 6-cm-Petrischalen und resuspendieren Sie die Kolonien vorsichtig 2x mit einer serologischen 10-ml-Pipette oder unter Verwendung von Pipettenspitzen mit breitem Bohrungsdurchmesser. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: hiPSCs sind sehr empfindlich gegenüber mechanischer Beanspruchung; Daher sollte eine mehrfache Resuspendierung vermieden werden. Die endgültige Zellsuspension sollte aus kleinen Koloniefragmenten (50-200 μm) bestehen.
  10. Saugen Sie den Überstand aus den beschichteten Kulturschalen ab und bereiten Sie 4 ml zuführfreies iPSC-Erhaltungsmedium pro 6-cm-Schale vor.
  11. Kleine Koloniefragmente werden im Splitverhältnis von 1:10 bis 1:40 in die frisch zubereiteten Kulturschalen überführt und bei 37 °C und 5 % CO2 mit täglichem Medienwechsel kultiviert.
    Anmerkungen: Kleine Kolonien sollten sich innerhalb von 1 oder 2 Stunden nach dem Passieren anheften.

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Abbildung 1: Morphologie humaner induzierter pluripotenter Stammzellkulturen (A,B) Qualitativ hochwertige hiPSC-Kulturen unterschiedlicher Konfluenz, die verdichtete hiPSC-Kolonien mit homogener Morphologie und definierten Rändern aufweisen. (C) hiPSC-Kultur mit austretenden Clustern differenzierter Zellen an den Kolonierändern (gestrichelte weiße Linie). Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzung: hiPSC = humane induzierte pluripotente Stammzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Präkultivierung von hiPSCs im Benchtop-Bioreaktorsystem (Tag-2)

HINWEIS: Beginnen Sie mit der Vorkultivierung, wenn die hiPSC-Kulturen eine Konfluenz zwischen 60% und 80% erreichen. Überprüfen Sie die hiPSC-Kolonien auf differenzierte Bereiche. Während dieser Vorkultivierungsphase werden die hiPSCs für 2 Tage in einem feederfreien iPSC-Erhaltungsmedium gehalten.

  1. Bereiten Sie die Nährmedien vor, bestehend aus zuführbarem iPSC-Erhaltungsmedium und 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632).
  2. Saugen Sie das Medium vollständig von den hiPSCs ab und spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 1x DPBS (-/-) aus.
  3. 2,0 ml vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung in die 6 cm Petrischalen geben und die Zellen 3 min bei 37 °C im Inkubator inkubieren.
  4. Klopfen Sie vorsichtig auf die Schalen, um die Zellablösung zu erleichtern, oder inkubieren Sie sie 1-2 Minuten länger.
  5. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml feederfreiem iPSC-Erhaltungsmedium + ROCK-Inhibitor pro Schale. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren, um eine Zellvereinzelung zu gewährleisten.
  6. Bestimmen Sie die Zellzahlen in 100 μl Zellsuspension mit einem automatisierten Zellzähler wie zuvor beschrieben20. Übertragen Sie das entsprechende Volumen für 15 × 106 Zellen pro Bioreaktorröhrchen in ein 50-ml-Röhrchen.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten.
  8. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml feederfreiem iPSC-Erhaltungsmedium + ROCK-Inhibitor.
  9. Füllen Sie jedes 50-ml-Röhrchen mit 18 ml Medium (Zellkeimdichte von 0,75 × 106 Zellen/ml). Geben Sie die Zellsuspension in die Bioreaktorröhrchen (20 ml pro Röhrchen).
  10. Legen Sie die Röhrchen in das Bioreaktorsystem. Stellen Sie folgende Kultivierungsparameter ein: 2 s Umdrehungszeit, 60 U/min, keine Rührpause, 37 °C und 5 % CO2 für eine unbegrenzte Dauer20.
  11. Starten Sie das Kultivierungsprogramm über das Bioreaktor-Display.
  12. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag. Lassen Sie die Aggregate in den Bioreaktorrohren für ~5 min absetzen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
    Anmerkungen: Lassen Sie die Aggregate nicht länger als 10 Minuten ruhen, da sie aneinander haften und eine heterogene Aggregatsuspension bilden können. Es wird empfohlen, ~5 ml Nährmedium im Bioreaktorröhrchen zu belassen.
  13. Fügen Sie 15 ml frisches, feederfreies iPSC-Erhaltungsmedium ohne ROCK-Inhibitor pro Röhrchen hinzu und setzen Sie die Kultivierung im Tischbioreaktor für 24 Stunden fort.

3. Differenzierung von hiPS-Zellen in frühe Neurone (Tag 0)

  1. Bereiten Sie neurobasales Medium (NBM) vor: 50 % DMEM/F-12 mit stabilisiertem L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 50 % neurobasales Medium, 0,5-faches serumfreies Nahrungsergänzungsmittel (50x), 0,5-faches serumfreies Nahrungsergänzungsmittel auf Basis von Bottensteins N-1-Formulierung (100-fach), 0,5-fach stabilisiertes L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 0,5-fache MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x), 500 nM Natriumpyruvat (100 mM), 50 nM 2-Mercaptoethanol (50 mM), 0,025 % Humaninsulinlösung und 5 U/ml Penicillin-Streptomycin.
    HINWEIS: NBM muss bei 4 °C gelagert werden und kann bis zu 2 Wochen verwendet werden.
  2. Beginnen Sie mit der neuronalen Differenzierung, indem Sie Doxycyclin (DOX) zu den hiPSC-Kulturen hinzufügen. Lassen Sie dazu die Aggregate in den Bioreaktorrohren absetzen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Zellen ab, lassen Sie ~5 ml im Röhrchen und fügen Sie 35 ml neuronales Induktionsmedium (NIM) hinzu, das aus NBM und 2 μg/ml DOX besteht.
    Anmerkungen: Da DOX lichtempfindlich ist, wird empfohlen, das Licht während der Arbeit auszuschalten.
  3. Legen Sie die Röhrchen wieder in den Tischbioreaktor und setzen Sie die Kultivierung fort.
  4. Führen Sie 2 Tage lang täglich Medienwechsel durch, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
    HINWEIS: Nach 4 Tagen in Suspensionskultur können die Aggregate dissoziiert und frühe Neuronen kryokonserviert oder direkt für die terminale Reifung neu plattiert werden.

4. Kryokonservierung früher Neuronen (Tag 2)

HINWEIS: Die Kryokonservierung ist nicht erforderlich und für den Differenzierungsprozess nicht kritisch, wird jedoch dringend empfohlen, da große Vorräte an frühen Neuronen hergestellt und für die spätere Reifung und Analyse gelagert werden können.

  1. Lassen Sie die Aggregate im Bioreaktorrohr absetzen. Saugen Sie den Überstand wie zuvor beschrieben ab.
  2. Übertragen Sie die Aggregate in ein steriles 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen und spülen Sie die Aggregate 2x vorsichtig mit 1x DPBS (-/-). Saugen Sie den Überstand so weit wie möglich vorsichtig ab, ohne die Aggregate zu stören.
  3. Fügen Sie je nach Pelletgröße 2-5 ml vorgewärmtes Zelldissoziationsenzym hinzu und inkubieren Sie die Zellen für ca. 10 min bei 37 °C in einem Wasserbad. Resuspendieren Sie die sedimentierten Aggregate vorsichtig alle 2 Minuten, bis die Aggregate dissoziieren.
    HINWEIS: Eine nahezu homogene Zellsuspension sollte nach 7-10 min Inkubation erhalten werden.
  4. Fügen Sie das dreifache Volumen des vorgewärmten NBM-Mediums hinzu und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine Zellvereinzelung zu gewährleisten.
  5. Bestimmen Sie die Zellnummern und übertragen Sie das entsprechende Volumen für die Kryokonservierung in ein 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Eine Zelldichte von 5-10 × 106 Zellen /ml Gefriermedium wird empfohlen.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 3 min.
  7. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in der entsprechenden Menge des Gefriermediums, das 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält.
  8. Aliquotieren Sie die Zellsuspension in geeigneten Fläschchen für die Kryokonservierung (1 ml/Fläschchen).
  9. Die Durchstechflaschen sofort in einen vorgekühlten, langsam gefrierenden Behälter überführen, der mit 2-Propanol gefüllt ist, und stellen Sie den Behälter über Nacht auf -80 °C. Stellen Sie die Durchstechflaschen am nächsten Tag zur Langzeitlagerung auf -150 °C.
    HINWEIS: Das flüssige 2-Propanol ist leicht entzündlich und kann bei Kontakt Augenschäden verursachen. Von Hitze fernhalten und Schutzhandschuhe sowie eine Brille tragen.

5. Reifung von hiPSC-abgeleiteten Neuronen in Monolayer-Kulturen

  1. Bereiten Sie Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichtete Kulturschalen für die langfristige Kultivierung von hiPSC-abgeleiteten Neuronen vor.
    1. Die Poly-L-Ornithin-Stammlösung in 1x DPBS (-/-) auf 0,001 % verdünnen und das Geschirr über Nacht bei 4 °C oder 4 h bei 37 °C bestreichen. Saugen Sie die Poly-L-Ornithin-Lösung ab und waschen Sie die Platten einmal mit 1x DPBS (-/-).
    2. Die Lamininlösung wird in 1x DPBS (-/-) auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml verdünnt und die Schalen über Nacht bei 4 °C oder für 4 h bei 37 °C inkubiert.
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,1-0,15 ml pro cm2 wird für die Beschichtungsverfahren und 0,2 ml procm2 für alle entsprechenden Waschschritte empfohlen. Alternative Beschichtungssubstrate können verwendet werden, aber mögliche Auswirkungen auf die Zellanheftung und -reifung sollten bewertet werden.
  2. Tauen Sie die kryokonservierten Zellen auf. Legen Sie dazu das Kryoial in ein Wasserbad (eingestellt auf 37 °C) und schwenken Sie es ca. 1 Minute lang, bis ein kleiner Klumpen gefrorener Zellsuspension übrig bleibt.
  3. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig tropfenweise in ein 15-ml-Röhrchen, das mit 10 ml vorgewärmtem NBM vorbereitet wurde. Spülen Sie das Kryoial mit 1 ml NBM und überführen Sie die Zellsuspension in das identische 15-ml-Röhrchen.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten.
  5. Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 1-2 ml NIM hinzu, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
  6. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig und bestimmen Sie die Zellnummern.
  7. Die verbleibende Lamininlösung wird aus den beschichteten Zellkulturschalen abgesaugt und die Zellen mit einer Aussaatdichte von 1 × 105 Zellen/cm2 in NIM ausgesät, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
  8. Schalten Sie das Medium nach 24 h auf NIM ohne ROCK-Inhibitor um.
  9. Führen Sie 4 Tage lang tägliche Medienwechsel durch.
  10. Nach dieser ersten Phase der NGN2-Induktion wird das DOX weggelassen und die Zellen in NBM kultiviert, wobei 2x pro Woche die Halbmedien gewechselt werden, bis das gewünschte Reifestadium erreicht ist.
    HINWEIS: Die Co-Kultivierung von iNGN2-Neuronen mit Astrozyten wird empfohlen, um das Überleben, die Anheftung, die Reife und die elektrische Aktivität der Zellen zu erhöhen13,22.

6. Charakterisierung von Neuronen, die aus hiPSC stammen

HINWEIS: Die Differenzierung in neuronale Derivate kann mit den folgenden Techniken ausgewertet werden.

  1. Immunzytochemie und Bildgebung
    1. Saugen Sie das Medium aus den hiPSC-abgeleiteten Neuronen ab und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x DPBS mitCa2 + und Mg2+ (+/+).
      Anmerkungen: Pipettieren Sie vorsichtig, vorzugsweise an den Rändern der Vertiefung, da sich die Zellen sehr leicht von der Oberfläche lösen können. Für alle Waschschritte wird ein Volumen von 0,2 mL procm2 empfohlen, um eine vollständige Abdeckung der Zellen mit 1x DPBS (+/+) zu gewährleisten.
    2. Fixieren Sie die neuronalen Zellen mit einer Fixierungslösung, die 4 % Paraformaldehyd in DPBS (+/+) enthält, für 15 min bei Raumtemperatur (RT). Empfohlen wird ein Volumen von 0,1 ml procm2 .
      HINWEIS: Paraformaldehyd (4%) in DPBS ist eine gefährliche und hautreizende Lösung mit akuter Toxizität und potenzieller Karzinogenität. Von Hitze fernhalten, Schutzhandschuhe und eine Schutzbrille tragen, Einatmen vermeiden und die Lösung nur in einer belüfteten Umgebung verwenden.
    3. Spülen Sie die Zellen vorsichtig 2x in 1x DPBS (+/+) aus und fahren Sie mit der Färbung fort.
      HINWEIS: Fixierte Zellen können bis zu 1 Monat bis zur Weiterverarbeitung in DPBS (+/+) bei 4 °C gelagert werden.
    4. Saugen Sie das DPBS (+/+) aus Proben ab. Permeabilisieren Sie die Zellen und blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 1x DPBS (+/+) mit 1% BSA und 0,2% Triton-X-100 für 60 min bei RT.
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,2 ml procm2 wird empfohlen.
    5. Entfernen Sie den Überstand und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 4 °C, wobei die entsprechenden Primärantikörper in Färbepuffer (1x DPBS [+/+] enthält 1% BSA) verdünnt werden (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig mit Lösung bedeckt sind.
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,1-0,15 ml procm2 wird empfohlen.
    6. Saugen Sie den Färbepuffer ab und spülen Sie die Zellen 3x in 1x DPBS (+/+).
    7. Die entsprechenden Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) werden in Färbepuffer in einer Endkonzentration von 1:1.000 verdünnt.
    8. Inkubieren Sie die Zellen in verdünnter Antikörperlösung für 1 h bei RT im Dunkeln. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig mit Lösung bedeckt sind.
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,1-0,15 ml procm2 wird empfohlen.
    9. Saugen Sie die sekundäre Antikörperlösung ab und spülen Sie die Zellen 2x in 1x DPBS (+/+).
    10. Die Zellkerne werden mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in DPBS (+/+), für 5 min bei RT gegengefärbt.
      HINWEIS: Ein Arbeitsvolumen von 0,1-0,15 ml procm2 wird empfohlen.
    11. Spülen Sie die Zellen 2x in 1x DPBS (+/+).
    12. Lagern Sie die Zellen bis zur Bildgebung in DPBS (+/+) bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Hellfeld-Bildgebung eignet sich, um morphologische Veränderungen und Neuritenauswuchs zu verfolgen. Darüber hinaus kann die stereotype Markerexpression mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden. Während undifferenzierte hiPS-Zellen OCT 3/4 und NANOG exprimieren, können beta-III-Tubulin (TUBB3) und das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 (MAP2) als neuronale Marker für die Visualisierung von Neuriten und Axonen dienen. Das neuritische Netzwerk kann durch die Bestimmung der Neuritenlänge in Hellfeld- oder Fluoreszenzbildern weiter beurteilt werden.
  2. Genexpressionsanalysen mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
    1. Saugen Sie das Medium ab und spülen Sie die Zellen einmal in 1x DPBS (-/-).
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,2 ml procm2 wird empfohlen.
    2. Fügen Sie kalten RNA-Lysepuffer hinzu und ernten Sie die Zellen durch Kratzen.
    3. Isolieren Sie die RNA mit einem geeigneten säulenbasierten Kit und bestimmen Sie die RNA-Konzentrationen mittels UV-Photospektrometrie.
    4. Generieren Sie cDNA mit 250 ng Gesamt-RNA und einem geeigneten Kit für die reverse Transkription.
    5. Bereiten Sie molekulare Beacon-qPCR-Reaktionen vor, die 2,5 ng cDNA in doppelter Ausführung enthalten. Verwenden Sie eine geeignete Mastermischung und entsprechende Primer-Assays20 (siehe Materialtabelle).
    6. Führen Sie die qPCR durch, indem Sie 45 Zyklen mit Primer-Annealing bei 60 °C für 20 s anwenden.
    7. Normalisieren Sie die relativen Genexpressionsniveaus auf den Mittelwert der Housekeeping-Gene GAPDH, HPRT1 und GUSB. Wenden Sie die ΔΔCt-Methode23 an, wobei undifferenzierte hiPSCs als Kalibrator verwendet werden.

Ergebnisse

In den ersten Schritten werden adhärente Kulturen von hiPS-Zellen abgelöst, singularisiert und in Suspension überführt (Abbildung 2). Aggregate bilden sich innerhalb von 24 h und wachsen kontinuierlich an Größe. Nach 2 Tagen Transgen-Induktion können frühe Neuronen für nachfolgende Experimente kryokonserviert werden.

Die anhaltende Proliferation während der ersten Tage in der Suspension führt zu einer Zunahme der Zellzahl, die nach 2 Tagen Induktion ihren Höhepunkt erreicht (Abbildung 3A,B). Mit der Vermehrung beginnen die Aggregate zu wachsen. Im Vergleich zu Tag 0 nimmt der Durchmesser an Tag 2 um 50 % zu und hat sich an Tag 5 fast verdoppelt (Abbildung 3D). Obwohl ein zunehmender Durchmesser die Nährstoffversorgung innerhalb der Aggregate einschränkt, wird die Lebensfähigkeit der Zellen weder am Tag 2 noch am Tag 5 der Differenzierung beeinträchtigt (Abbildung 3C). Eine längere Kultivierung über mehr als 4 Tage in Suspension verbessert jedoch die Zellausbeute nicht weiter, da die Aggregate zunehmend resistent gegen enzymatische Singularisierung werden (Abbildung 3B).

Nach der Kryokonservierung werden die Tag-2-Zellen aufgetaut und zur terminalen Reifung auf Poly-L-Ornithin (PLO)-lamininbeschichtete Schalen plattiert. Im Allgemeinen heften sich die Zellen nach dem Auftauen sehr gut an und beginnen früh, die Neuriten zu verlängern. Das zeitliche Genexpressionsprofil sowie die immunzytochemische Färbung der neuronalen Marker TUBB3 und MAP2 bestätigen die neuronale Zellidentität (Abbildung 4A,B). Zusätzlich zu den steigenden Spiegeln von TUBB3 und MAP2 sind neuronale Kulturen mit Mikrotubuli-assoziierten Protein-Tau-Transkripten (MAPT) angereichert, die für ein neuronales Protein kodieren, das an der Axonstabilisierung beteiligt ist, und zeigen eine gleichzeitige Abnahme der Expression des pluripotenzregulierenden Transkriptionsfaktors POU5F1. Darüber hinaus bildet sich innerhalb der ersten Woche nach dem Auftauen ein dichtes neuritisches Netzwerk (Abbildung 4C). Diese morphologischen Veränderungen deuten in Verbindung mit dem Transkriptionsprofil auf eine zunehmende Reifung der neuronalen Kulturen hin.

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Abbildung 2: Generierung von hiPSC-abgeleiteten iNGN2-Neuronen unter Verwendung eines Benchtop-Bioreaktors. (A) Schematische Übersicht über das Differenzierungsparadigma, wobei die wichtigsten Schritte der Zellkultur hervorgehoben werden. (B-F) Hellfeldbilder visualisieren (B) hiPSCs und (C,D) die Bildung von Aggregaten im Benchtop-Bioreaktor. (E,F) iNGN2-Neurone verlängern Neuriten und erfahren während der Differenzierung morphologische Veränderungen. Maßstabsleiste = 100 μm. Abkürzungen: BMM = Basalmembranmatrix; iPSC-MM = iPSC-Erhaltungsmedium; PLO = Poly-L-Ornithin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 3: Zellausbeute und Viabilität während der Aggregatbildung und des Wachstums. (A) Hellfeldbilder zeigen die Bildung von Aggregaten innerhalb von 2 Tagen nach der Kultivierung im Tischbioreaktor sowie die Zunahme der Aggregatgröße im Laufe der Zeit. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Quantifizierung der Zellausbeute und (C) Viabilität über den Differenzierungsverlauf. Balkendiagramme stellen den Mittelwert + SD aus vier unabhängigen Experimenten dar. (D) Der Durchmesser, der die Größe der Zuschlagstoffe angibt, wurde halbautomatisch mit der Open-Source-Software ImageJ (Version 1.53) bestimmt. Zuerst wurden Hellfeldbilder in Binärbilder umgewandelt und dann mit dem Werkzeug "Partikel analysieren" weiter bewertet, wobei die folgenden Parameter angewendet wurden: Größe > 2.500 μm2, Kreisförmigkeit 0,45-1, Kanten ausschließen und Löcher einschließen. Horizontale Linien zeigen den Mittelwert ± SD von fünf unabhängigen Differenzierungen an. Einzelne Punkte stellen den Mittelwert einzelner Differenzierungsexperimente mit mindestens 20 Aggregaten pro Zeitpunkt dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 4: Charakterisierung von hiPSC-abgeleiteten iNGN2-Neuronen. Zeitliches Genexpressionsprofil für die neuronalen Gene TUBB3, MAP2 und MAPT sowie das pluripotente Stammzell-assoziierte Gen POU5F1. Die relativen Expressionsniveaus wurden auf die Referenzgene GAPDH, HPRT1 und GUSB normalisiert. Als Kalibrator wurden undifferenzierte hiPSCs (Tag-2) gewählt. Die geometrischen Symbole geben den Mittelwert ± SD von vier unabhängigen Differenzierungen an. (B) Repräsentative Bilder von iNGN2-Neuronen an Tag 7 nach dem Auftauen (Tag-2 + 7), gefärbt auf Beta-III-Tubulin (TUBB3, magenta) und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2, cyan). Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsbalken = 100 μm. (C) Auswertung des neuritischen Netzwerks in Hellfeldaufnahmen neuronaler Kulturen nach dem Auftauen. Die Gesamtlänge der Neuriten wurde in einem Bereich von 930,82 × 698,11μm2 mit ImageJ (Version 1.53) bestimmt. Nach dem Einstellen der Helligkeit und des Kontrasts wurden die Bilder in 8-Bit-Bilder umgewandelt und die Farben invertiert. Die Neuriten wurden anschließend skelettiert und dann mit den ImageJ-Plugins "Skeletonize" bzw. "Analyze Skeleton" analysiert. Die Gesamtlänge der Neuriten wurde durch die Anzahl der Soma in der interessierenden Region dividiert, um die durchschnittliche Neuritenlänge/Zelle zu erhalten. Balkendiagramme stellen den Mittelwert + SD aus drei unabhängigen Experimenten dar. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

Es wurde bereits gezeigt, dass die ektopische Expression des neuronalen Transkriptionsfaktors NGN2 frühe Stadien der neuronalen Differenzierung beschleunigt und die neuronale Linienbindung in hiPS-Zellen innerhalb von 1 Woche nach der Kultivierung induziert12,13,20. Diese Arbeit beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung von geneditierten BIONi010-C-13 hiPSCs in iNGN2-Neuronen unter Verwendung eines Benchtop-Bioreaktors.

Der CERO 3D-Bioreaktor ist ein Bioreaktor mit geringem Volumen und vier Schlitzen für Spezialröhrchen mit einem maximalen Fassungsvermögen von jeweils 50 ml. Die Temperatur und der CO2 -Gehalt werden kontinuierlich kontrolliert und die Anbauparameter (z. B. Drehzahl und Zeit) werden für jede Röhre unabhängig voneinander geregelt, so dass der Anwender mehrere Differenzierungsansätze parallel ausführen kann. Integrierte Wellenbrecher an der Rohrinnenwand ermöglichen eine Störung des Mediums bei geringer Scherspannung und halten 3D-Aggregate bei kontrollierter Rotation in Schwebe. Ein eingeschränkter Zugang zu Nährstoffen sowie erzwungene 3D-Zell-Zell- und Zell-extrazelluläre Matrix-Interaktionen (EZM) können die zelluläre Differenzierung und das zelluläre Verhalten erheblich beeinflussen24,25,26,27.

Die Kultivierung von Zellen als 3D-Aggregate in Suspension erhöht diese Zellinteraktionen und ahmt dadurch die In-vivo-Umgebung von Geweben oder Organen besser nach28. Die gleichzeitige Störung des Mediums reguliert die Größe der Aggregate durch mechanische Reibung, verbessert den Gasaustausch und verringert den Gradienten von Nährstoffen und Abfällen im Rohr, während die physiologisch relevanten Gradienten innerhalb der Aggregate erhalten bleiben 29,30,31,32,33,34. Obwohl der Mediumwechsel manuell durchgeführt wird, reduziert der Tischbioreaktor die Arbeits- und Betriebskosten im Vergleich zu statischen Kulturkolben. Der Bioreaktor bietet auch mehrere Vorteile gegenüber vollautomatischen Rührkessel-Bioreaktoren, da das laufradlose Design die hydrodynamische Scherspannung an der Aggregatoberfläche reduziert, wodurch nicht nur das Überleben der Zellen verbessert, sondern auch die Auswirkungen der Scherspannung auf empfindliche iPS-Zellen, Zelldifferenzierung und Funktion begrenztwerden 35,36,37,38.

Vertikale Radbioreaktoren, bei denen die Zellen durch ein großes vertikales Laufrad bewegt werden, sowie Schaukelbioreaktoren mit aufgeblasenen Kulturbeuteln, die an einer motorisierten Plattform befestigt sind, stellen alternative 3D-Aufhängungsplattformen dar. Obwohl die Kultivierung von hiPS-Zellen exzessiv getestet wurde 17,18,19,39,40, ist wenig über ihre Anwendbarkeit in neuronalen Differenzierungsansätzen bekannt, und die Berichte beschränken sich auf die erfolgreiche Expansion von neuronalen Vorläuferzellen von Säugetieren und Menschen in Rührkessel-Bioreaktoren 41,42,43,44, wobei sich eine seltene Anzahl von Studien auf Folgendes konzentriert Reifung44,45. Generell bieten automatisierte 3D-Aufhängungsplattformen den Vorteil eines vollautomatischen und computergesteuerten Medienwechsels, wodurch Schwankungen in der Handhabung reduziert und das Kontaminationsrisiko minimiert wird. Darüber hinaus können Nährstoffparameter wie Laktat und Glukosekonzentration kontinuierlich überwacht werden. Die Etablierung dieser Systeme erfordert jedoch oft eine erhebliche Anfangsinvestition, Laborfläche und die Schulung von qualifiziertem Personal. Der Tischbioreaktor stellt eine kompakte und einfach zu bedienende Alternative für die Kultivierung von Zellen in Suspension dar, bietet jedoch keine gleichzeitige Überwachung der Nährstoffe.

Wie in den meisten Protokollen, die für die Kultivierung von Zellen in 3D-Suspensionsplattformen verwendet werden, stellt die anfängliche Bildung von Aggregaten einen kritischen Schritt dar. hiPSCs werden als adhärente Monoschichten kultiviert und anschließend als Einzelzellsuspensionen in eine 3D-Umgebung überführt. Um den Zellverlust in diesem Stadium zu minimieren, müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Das Design der Röhrchen mit den integrierten Wellenbrechern bedeutet, dass ein minimales Kulturvolumen von 10 ml pro Röhrchen erforderlich ist, um eine optimale Störung des Mediums zu gewährleisten. Das kritische Volumen sollte daher langfristig nicht unterschritten werden. Darüber hinaus wird eine Startaussaatdichte von 7,5 Millionen Zellen pro 10 ml Kulturvolumen und eine Rotationsgeschwindigkeit von 60 U/min dringend empfohlen, um kurzfristig stabile Aggregate zu bilden, obwohl je nach Zelllinie Anpassungen erforderlich sein können.

Nach dem Überführen von hiPS-Zellen in Suspension sollten innerhalb von 24 Stunden Aggregate gebildet werden. Der erste Mediumwechsel ist kritisch, da die Aggregate klein sind und sich möglicherweise nicht richtig absetzen. Die Zeit für die Sedimentation von Aggregaten kann verlängert werden, sollte jedoch nicht mehr als 10 Minuten überschreiten, da Aggregate zu verklumpen und heterogen wachsen können. Während der Aspiration sollte ein minimales Kulturvolumen von 5 ml im Röhrchen verbleiben und Störungen des Mediums vermieden werden. Dennoch ist in der Anfangsphase mit einem Verlust von Zellen und Aggregaten zu rechnen. Die Zellzahlen deuten auf eine konstante Zellausbeute über die ersten 2 Tage in Kultur hin, was darauf hindeutet, dass die hohe proliferative Kapazität der hiPS-Zellen den anfänglichen Zellverlust kompensiert. Einmal in der Suspension, führt die schonende Kultivierung und Störung zu homogen großen Aggregaten, die mit der Zeit zu wachsen beginnen.

Die neuronale Differenzierung erfolgte nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll, das auf der Doxycyclin-induzierten NGN2-Überexpression13 basiert, und die einzelnen Schritte wurden für eine 3D-Kultivierung optimiert. Der neuronale Transkriptionsfaktor NGN2 ist ein gut beschriebener Treiber bei der neuronalen Differenzierung und beschleunigt die neuronale Induktion signifikant11,13,46. Während die konventionelle Musterbildung mit definierten Wachstumsfaktoren mehrere Wochen bis Monate dauert 7,8,9, induziert die NGN2-Expression das neuronale Zellschicksal innerhalb von Tagen. Neben der verkürzten Kultivierungszeit ist das Protokoll weder von teuren Wachstumsfaktoren noch von Beschichtungsmatrizes für die initiale Suspensionskultur abhängig, wodurch die Kultivierungskosten zusätzlich gesenkt werden.

Darüber hinaus ergab ein direkter Vergleich der NGN2-getriebenen Erzeugung unreifer Neurone in adhärenten und Suspensionskulturen eine 1,36-fache Zunahme der Zellen nach 4 Tagen in Kultur mit dem Benchtop-Bioreaktor20, während das für die Erzeugung von 1 Million Zellen benötigte Volumen des Mediums voraussichtlich halbiert wird. Der Einsatz des Benchtop-Bioreaktors für die Erzeugung von iNGN2-Neuronen könnte daher von Vorteil sein, da eine höhere Anzahl von Zellen mit geringerer Handhabungszeit und geringeren Kosten hergestellt werden kann. In Übereinstimmung mit früheren Berichten wurde schon früh ein Engagement für neuronale Abstammungslinien beobachtet. Nach 2 Tagen NGN2-Induktion zeigte sich eine tiefgreifende Expression klassischer neuronaler Marker wie TUBB3, MAP2 und MAPT, was die Anwendbarkeit des Benchtop-Bioreaktors für die neuronale Induktion unterstützt. Nach diesem Protokoll können innerhalb von 4 Tagen nach der Kultivierung etwa 6,2 Millionen unreife iNGN2-Neuronen aus 1 Million hiPS-Zellen gewonnen werden. Die Ausbringungskapazität kann jedoch von Charge zu Charge variieren und hängt vom Volumen der Suspensionskultur bei der Aussaat ab.

Um den Ertrag weiter zu steigern, wurde die Anbauzeit um weitere 3 Tage verlängert; Obwohl die Aggregate größer wurden, wurden sie auch sehr kompakt und konnten für die Kryokonservierung oder Neubeschichtung nicht richtig dissoziiert werden. Trotz Fortschritten bei 3D-Kulturansätzen sind adhärente 2D-Neurokulturen immer noch der Goldstandard für funktionelle Analysen wie Mikroelektroden-Arrays oder Kalzium-Bildgebung. Die Zellsingularisierung ist somit eine wichtige Voraussetzung für eine homogen verteilte neuronale Monolage und ein neuritisches Netzwerk. Eine stärkere mechanische Ablösung der Zellen oder scharfe Dissoziationsreagenzien können verwendet werden, um eine Singularisierung zu gewährleisten, jedoch mit potenziellen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, Physiologie und Wiederanheftungsfähigkeit der Zellen47,48. Im Hinblick auf den Bedarf an Einzelzellen für weitere Analysen und Reifung wurden die Aggregate nach 4 Tagen in Suspension dissoziiert und die (Tag 2) iNGN2-Neuronen kryokonserviert. Die Differenzierung und Charakterisierung von iNGN2-Neuronen nach dem Auftauen bestätigte eine zunehmende Reife der neuronalen Kulturen und die Bildung eines dichten neuritischen Netzwerks.

Das bereitgestellte Protokoll liefert eine hohe Anzahl von iNGN2-Neuronen. Es müssen jedoch einige Einschränkungen berücksichtigt werden. Wie bei den meisten Suspensionskulturplattformen ist der Transfer von hiPS-Zellen aus einer 2D-adhärenten Kultur in eine 3D-Umgebung kritisch und oft mit einem tiefgreifenden Zellverlust verbunden. Weitere signifikante Zell- und Aggregatverluste sind bei Medienwechseln zu erwarten. Im Vergleich zu automatisierten Plattformen erhöht sich die Handhabungszeit und das Kontaminationsrisiko mit dem Benchtop-Bioreaktor, da der Mediumwechsel manuell durchgeführt werden muss. Abgesehen von der fehlenden Automatisierung bietet der Benchtop-Bioreaktor keine Möglichkeit, die Nährstoffe zu überwachen, und die maximale Kapazität von 50 ml pro Röhrchen schränkt das Upscaling-Potenzial des Protokolls ein. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass, obwohl NGN2 die Bindung neuronaler Linien beschleunigt, die Dauer der terminalen Reifung nicht verkürzt wird und immer noch eine Langzeitkultur über mehrere Wochen erforderlich ist. Angesichts der Bedeutung der astrozytären Unterstützung für die neuronale Funktion, Bindung und das Überleben 49,50,51 sollten Kokulturansätze in Betracht gezogen werden, die für eine langfristige Kultivierung sogar unerlässlich sein können.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein 2D-Differenzierungsprotokoll erfolgreich in eine 3D-Umgebung für die schnelle und reproduzierbare Generierung von iNGN2-Neuronen durch die Implementierung eines Benchtop-Bioreaktors übersetzt werden konnte. Das beschriebene Protokoll liefert große Mengen an qualitativ hochwertigen, aus iPS-Zellen gewonnenen Neuronen, die als Ausgangspunkt für komplexe Modelltests, Hochdurchsatz-Drogenscreenings und groß angelegte Toxizitätstests dienen können.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Das EBiSC2-Projekt wurde im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 821362 vom Gemeinsamen Unternehmen Innovative Medicines Initiative 2 gefördert. Das Gemeinsame Unternehmen wird durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union und die EFPIA unterstützt. Wir danken Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters und Vanessa M. Nalewaja für ihre Unterstützung bei immunzytochemischen und Genexpressionsanalysen sowie Heike Arthen für ihre hervorragende technische Unterstützung. Darüber hinaus danken wir Stephanie Bur für die Etablierung des Bioreaktorprogramms. Abbildung 2A wurde mit BioRender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Mercaptoethanol 50 mMGibco 
60 mm Nunclon Delta SurfaceNunc734-2040
Anti-Beta III Tubulin Antikörper [TU-20] (Verdünnung 1:1.000)Abcam   ab7751 
Angewandte Biosysteme  Reverse-Transkriptionskit für cDNA mit hoher KapazitätThermo Fisher Scientific  
B-27 Zuschlag (50x) Gibco11530536serumfreies Supplement (50x)
BIONi010-C-13 hiPSC-LinieEuropäische Bank für induzierte pluripotente Stammzellen (EBiSC), BIONEER als EinlegerSAMEA103988285Bioneer ist Einleger in EBiSC und Eigentümer der hiPSC-Linie.
Biorender 
in BSA-Zellkulturqualität  
CERO 3D Inkubator & BioreaktorOLS OMNI Life Science2800000
CEROtubes Zellkulturröhrchen 50 mLOLS OMNI Life Science2800005
Citavi 6Swiss Academic Software
CryoStor CS10 Stemcell7930Gefriermedium mit 10% DMSO
Cytofix FixierlösungBD Biosciences 554655Fixierlösung mit 4 % Paraformaldehyd 
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) Thermo Fisher Scientific   
Doxycyclinhydrochlorid (DOX)Sigma-AldrichD3447
DPBS ohne Calcium und Magnesium (DPBS -/-) Gibco14190250
DPBS mit Calcium und Magnesium (DPBS +/+) Gibco11580456
DMEM/F12 (-/-)Gibco21331-020
DMEM/F-12, GlutaMAX SupplementGibco31331-028
EVOS XL Core Cell Imaging SystemThermo Fisher Scientific
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scient   A21424
GlutaMAX Ergänzung Gibco 35050-038stabilisiertes L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid
ImageJ 1,51v National Institute of Health
Insulinlösung humanSigma-AldrichI9278l
LamininMerckL2020
MACSQuant AnalyzerMiltenyi
MAP2 Monoklonaler Antikörper (Verdünnung 1: 300)Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Wachstumsfaktor reduziert, phenolrotfrei Corning Life Science 356231Basalmembranmatrix
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)Gibco 
MicroAmp Optisches Klebefolien-Kit Thermo Fisher Scientific   
mTeSR1Stemcell85850Feeder-freies iPSC-Erhaltungsmedium
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048serumfreies Supplement auf Basis von Bottenstein s N-1 Formulierung
Neurobasales MediumGibco11570556
Nikon Eclipse TS2Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200ChemoMetec A/S
Herkunft 2021OriginLab
Penicillin-StreptomycinGibco11548876
Perm/Wash Puffer BD Biowissenschaften 
Primer Assay TUBB3(Hs00801390_s1)Thermo Fisher Scientific11620099
Primer Assay GAPDH (Hs99999905_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Primer Assay GUSB (Hs99999908_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Primer Assay HPRT1 (Hs99999909_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Primer-Assay MAP2 (Hs00258900_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Primer-Assay MAPT (Hs00902194_m1)Thermo Fisher Scientific11620099
Primer-Assay POU5F1 (Hs04260367_gH)Thermo Fisher Scientific11620099
Poly-L-Ornithin 0,01%MerckP4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-KitQiagen74034säulenbasiertes RNA-Isolationskit
RLT-PufferQiagen79216Zelllysepuffer
Natriumpyruvat (100 mM)Gibco12539059
StemPro AccutaseGibco11599686Zelldissoziationsenzym
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIXThermo Fisher Scientific  11380912qPCR-Mastermix
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787
TrypLE Select EnzymGibco12563-011Trypsin-EDTA-Lösung
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher ScientificAM9260G
Via1-KassetteChemoMetec A/S941-0012
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung ThermoFisher Wissenschaftliche10088880
X20 OPTISCHE 96WELL SCHNELLE KLARE REAKTIONSPLATTEN Thermo Fisher Scientific15206343
Y-27632 Dihydrochlorid, Rho-Kinase-Inhibitor (ROCK-Inhibitor)Abcamab120129
1152892610400745Biorender.comThermo Fisher Scientific12330023123335531114003510095714554723

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Neurogenin-2-Neuronendreidimensionaler Bioreaktorinduzierte pluripotente Stammzellenneuronale DifferenzierungSuspensionskulturDoxycyclin-Induktionneurales InduktionsmediumZellaggregatbildungKryokonservierungsprotokollneuronale Markerexpression
Herstellung von humanen Neurogenin 2-induzierbaren Neuronen in einem dreidimensionalen Suspensionsbioreaktor
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