Herstellung von humanen Neurogenin 2-induzierbaren Neuronen in einem dreidimensionalen Suspensionsbioreaktor

Neurologische Erkrankungen sind weltweit die häufigste Ursache für Behinderungen¹. Jeder sechste Mensch ist betroffen, Tendenz steigend. Die damit verbundene finanzielle Belastung für die Gesellschaften und ihre Gesundheitssysteme ist enorm. Eine Evaluierung von 30 europäischen Ländern im Jahr 2010 schätzte die jährlichen Kosten im Zusammenhang mit psychischen und neurologischen Erkrankungen auf 800 Mrd. EUR². Die zunehmende sozioökonomische Belastung erfordert effektive Behandlungsstrategien, und obwohl unser Verständnis der Pathophysiologie von Krankheiten erheblich zugenommen hat, ist die Translation in die Klinik oft unzureichend. Im Allgemeinen werden nur 12 % der Arzneimittel in klinische Studien aufgenommen, von denen mehr als 80 % in späteren Phasen scheitern, hauptsächlich aufgrund von Unwirksamkeit oder unvorhergesehener Toxizität ^3,4. Die Gründe sind vielfältig, aber die eingeschränkte Übertragbarkeit von Tierversuchen in präklinischen Stadien auf Humanversuche ist zunehmend in den Vordergrund gerückt⁵. Humane In-vitro-Zell- und Gewebemodelle können die Lücke der interspeziesübergreifenden Translation schließen, und Fortschritte in der Technologie der human-induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) haben in dieser Hinsicht großes Potenzial. hiPS-Zellen sind in der Grundlagenforschung weit verbreitet und haben wesentliche Eigenschaften mit embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) gemeinsam, wie z. B. eine nahezu unbegrenzte Selbsterneuerungsfähigkeit und die Fähigkeit, sich in alle drei Keimblätter zu differenzieren⁶, während ethische Bedenken im Zusammenhang mit der Zerstörung von Embryonen umgangen werden.

Die Ableitung neuronaler Zellen aus hES-Zellen und später hiPS-Zellen markierte einen Meilenstein in der Hirnforschung. Die ersten Differenzierungsprotokolle basierten auf der Anwendung von Wachstumsfaktoren, die kritische Schritte während der Embryogenese nachahmten, von denen die meisten eine duale SMAD-Hemmung entweder in Suspensions- oder adhärenten Kulturen beinhalteten ^7,8,9. Reife Neuronen wurden erfolgreich generiert, aber einige Nachteile dieser Protokolle behindern immer noch ihren breiten Einsatz in der Arzneimittelentwicklung, wie z. B. die geringe Ausbeute und die hohe Variabilität der erzeugten Neuronen von Charge zu Charge sowie die umfangreiche Arbeitsbelastung im Zusammenhang mit langen Kulturzeiten. Verbesserungen wurden durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren erzielt, die entscheidend an der Neurogenese beteiligt sind, und Mitglieder der Neurogenin (NGN)-Familie, insbesondere NGN2, wurden als effektive Treiber identifiziert¹⁰. Die lentiviral-vermittelte ektopische Expression von NGN2 in hiPS-Zellen beschleunigte die frühen Stadien der neuronalen Differenzierung signifikant und induzierte das neuronale Zellschicksal innerhalb von nur 1 Woche¹¹. Die anschließende terminale Reifung in Kokulturen mit Astrozyten ergab funktionelle Neurone in hoher Reinheit und Menge mit reproduzierbaren Eigenschaften. Die gezielte Genom-Editierung des Safe-Harbor-Locus der Adeno-assoziierten Virusintegrationsstelle 1 (AAVS1) wurde dann angewendet, um hiPSC-Linien mit einer stabilen und Doxycyclin-induzierbaren Expressionskassette für NGN2^12,13 zu erzeugen und so unerwünschte Nebenwirkungen der lentiviralen Verabreichung zu minimieren.

Die robuste und effiziente Differenzierung von Doxycyclin-induzierbaren Neurogenin 2 (iNGN2)-Neuronen birgt ein großes Potenzial für phänotypische Wirkstoffscreenings und Toxizitätsassays mit hohem Durchsatz^10,14,15; In den letzten zehn Jahren wurden erhebliche Fortschritte in der Bioprozesstechnik bei der Implementierung von Bioreaktoren für eine skalierbare Zellexpansion und -differenzierung erzielt^16,17,18,19. Die meisten Differenzierungsprotokolle sind jedoch für adhärente Kulturen optimiert, und die Übersetzung in eine dreidimensionale (3D) Umgebung erfordert oft wesentliche Modifikationen. Kürzlich wurde über den erfolgreichen Einsatz eines Tisch-3D-Bioreaktors mit reduzierten Scherspannungsmerkmalen für die Expansion von hiPSCs und für die reproduzierbare Differenzierung in Hepatozyten, Kardiomyozyten und Neuronen berichtet²⁰. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Charakterisierung von iNGN2-Neuronen unter Verwendung des identischen 3D-Bioreaktors bereitgestellt.

Anmerkungen: Alle Zellmanipulationen sowie Kulturschalen und Medienzubereitungen sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Die Laminar-Flow-Haube sollte vor dem Gebrauch und nach der Verarbeitung gründlich gereinigt werden, indem alle Oberflächen mit 70%igem Ethanol abgewischt werden. Das beschriebene Protokoll ist für neuronale Differenzierungen in einem CERO 3D-Inkubator und Bioreaktor (im Folgenden als Benchtop-Bioreaktor bezeichnet) optimiert. Dieser Tisch-Bioreaktor bietet vier Steckplätze für spezielle Bioreaktorröhrchen mit einem maximalen Fassungsvermögen von jeweils 50 ml. Temperatur und CO_{2 -} Gehalt werden kontinuierlich geregelt und die Anbauparameter (z. B. Drehzahl und Zeit) werden für jedes Rohr unabhängig voneinander geregelt. Alle Aspirationsschritte wurden, sofern nicht anders angegeben, mit einer Aspirationspipette und einer Vakuumpumpe durchgeführt.

1. Kultivierung und Expansion hiPS-Zellen

HINWEIS: In diesem Protokoll wird die technisch hergestellte Doxycyclin-induzierbare NGN2 hiPSC-Linie BIONi010-C-13 verwendet. Das hier bereitgestellte Expansionsprotokoll ist für 6-cm-Petrischalen optimiert, es können jedoch alternative Kulturformate verwendet werden, wenn dies bevorzugt wird.

1. 6 cm Petrischalen mit Basalmembranmatrix bestreichen, verdünnt in kaltem modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12 (-/-) von Dulbecco mit einer Endkonzentration von 0,083 mg/ml/10^cm2. Die beschichteten Schalen bei 37 °C mindestens 30 min inkubieren.
   HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll für die Herstellung der Basalmembranmatrixlösung finden Sie in den Anweisungen des Herstellers. hiPSCs können zur Expansion auf alternativen extrazellulären Matrices kultiviert werden.
2. Auftauen von kryokonservierten hiPSCs gemäß dem EBiSC Cell line User Protocol²¹ in feederfreiem iPSC-Erhaltungsmedium + 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632). Empfohlen wird eine Aussaatdichte von 1 × 10⁶ lebensfähigen Zellen pro 60 mm Schale.
3. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag auf ein zuführfreies iPSC-Erhaltungsmedium ohne ROCK-Inhibitor und führen Sie einen täglichen Medienwechsel durch.
4. Beginnen Sie mit der Passage, wenn die hiPSC-Kulturen eine Konfluenz von 60%-80% erreichen. Suchen Sie nach differenzierten Bereichen und reinigen Sie die Kolonien manuell, wenn die Fläche 5 % überschreitet.
   HINWEIS: Undifferenzierte hiPS-Zellen erscheinen als runde Zellen mit einem prominenten Nukleolus und weniger Zytoplasma. Flache und dicht gepackte Kolonien werden früh nach dem Auftauen oder Passieren gebildet. Beispielhafte Hellfeldbilder von hiPSC-Kulturen sind in Abbildung 1 dargestellt. Weitere Informationen finden Sie im EBiSC Cell line User Protocol²¹. Bereiten Sie für die Durchlässigkeit Schalen mit Membranmatrix im Keller und ein zuführfreies iPSC-Wartungsmedium vor.
5. Saugen Sie das Medium aus hiPSC-Kulturen ab und spülen Sie die Zellen 2x mit 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in 1x Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) ohne Ca 2+ und Mg²⁺ (DPS [-/-], siehe Materialtabelle).
6. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 2 mL 0,5 mM EDTA in 1x DPBS (-/-) in die 6 cm Petrischale. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 3 min im Inkubator.
7. 1,5 ml der EDTA-Lösung aufsaugen und 3-5 Minuten lang inkubieren.
8. Klopfen Sie vorsichtig auf das Geschirr, um die Zellablösung zu erleichtern.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die Ablösung durch visuelle Beurteilung. hiPSC-Kolonien sollten sich nach 5 min ablösen, aber bei höher konfluenten hiPSC-Kulturen kann eine längere Inkubationszeit erforderlich sein. Wenn sich die Völker nicht lösen, erhöhen Sie die Inkubationszeit auf 10 Minuten, überschreiten Sie diesen Zeitraum jedoch nicht.
9. Geben Sie 5 ml des feederfreien iPSC-Erhaltungsmediums in die 6-cm-Petrischalen und resuspendieren Sie die Kolonien vorsichtig 2x mit einer serologischen 10-ml-Pipette oder unter Verwendung von Pipettenspitzen mit breitem Bohrungsdurchmesser. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: hiPSCs sind sehr empfindlich gegenüber mechanischer Beanspruchung; Daher sollte eine mehrfache Resuspendierung vermieden werden. Die endgültige Zellsuspension sollte aus kleinen Koloniefragmenten (50-200 μm) bestehen.
10. Saugen Sie den Überstand aus den beschichteten Kulturschalen ab und bereiten Sie 4 ml zuführfreies iPSC-Erhaltungsmedium pro 6-cm-Schale vor.
11. Kleine Koloniefragmente werden im Splitverhältnis von 1:10 bis 1:40 in die frisch zubereiteten Kulturschalen überführt und bei 37 °C und 5 % CO₂ mit täglichem Medienwechsel kultiviert.
    Anmerkungen: Kleine Kolonien sollten sich innerhalb von 1 oder 2 Stunden nach dem Passieren anheften.

Abbildung 1: Morphologie humaner induzierter pluripotenter Stammzellkulturen (A,B) Qualitativ hochwertige hiPSC-Kulturen unterschiedlicher Konfluenz, die verdichtete hiPSC-Kolonien mit homogener Morphologie und definierten Rändern aufweisen. (C) hiPSC-Kultur mit austretenden Clustern differenzierter Zellen an den Kolonierändern (gestrichelte weiße Linie). Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzung: hiPSC = humane induzierte pluripotente Stammzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Präkultivierung von hiPSCs im Benchtop-Bioreaktorsystem (Tag-2)

HINWEIS: Beginnen Sie mit der Vorkultivierung, wenn die hiPSC-Kulturen eine Konfluenz zwischen 60% und 80% erreichen. Überprüfen Sie die hiPSC-Kolonien auf differenzierte Bereiche. Während dieser Vorkultivierungsphase werden die hiPSCs für 2 Tage in einem feederfreien iPSC-Erhaltungsmedium gehalten.

1. Bereiten Sie die Nährmedien vor, bestehend aus zuführbarem iPSC-Erhaltungsmedium und 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632).
2. Saugen Sie das Medium vollständig von den hiPSCs ab und spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 1x DPBS (-/-) aus.
3. 2,0 ml vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung in die 6 cm Petrischalen geben und die Zellen 3 min bei 37 °C im Inkubator inkubieren.
4. Klopfen Sie vorsichtig auf die Schalen, um die Zellablösung zu erleichtern, oder inkubieren Sie sie 1-2 Minuten länger.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml feederfreiem iPSC-Erhaltungsmedium + ROCK-Inhibitor pro Schale. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren, um eine Zellvereinzelung zu gewährleisten.
6. Bestimmen Sie die Zellzahlen in 100 μl Zellsuspension mit einem automatisierten Zellzähler wie zuvor beschrieben²⁰. Übertragen Sie das entsprechende Volumen für 15 × 10^{6 Zellen} pro Bioreaktorröhrchen in ein 50-ml-Röhrchen.
7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten.
8. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml feederfreiem iPSC-Erhaltungsmedium + ROCK-Inhibitor.
9. Füllen Sie jedes 50-ml-Röhrchen mit 18 ml Medium (Zellkeimdichte von 0,75 × 10⁶ Zellen/ml). Geben Sie die Zellsuspension in die Bioreaktorröhrchen (20 ml pro Röhrchen).
10. Legen Sie die Röhrchen in das Bioreaktorsystem. Stellen Sie folgende Kultivierungsparameter ein: 2 s Umdrehungszeit, 60 U/min, keine Rührpause, 37 °C und 5 % CO₂ für eine unbegrenzte Dauer²⁰.
11. Starten Sie das Kultivierungsprogramm über das Bioreaktor-Display.
12. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag. Lassen Sie die Aggregate in den Bioreaktorrohren für ~5 min absetzen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
    Anmerkungen: Lassen Sie die Aggregate nicht länger als 10 Minuten ruhen, da sie aneinander haften und eine heterogene Aggregatsuspension bilden können. Es wird empfohlen, ~5 ml Nährmedium im Bioreaktorröhrchen zu belassen.
13. Fügen Sie 15 ml frisches, feederfreies iPSC-Erhaltungsmedium ohne ROCK-Inhibitor pro Röhrchen hinzu und setzen Sie die Kultivierung im Tischbioreaktor für 24 Stunden fort.

3. Differenzierung von hiPS-Zellen in frühe Neurone (Tag 0)

1. Bereiten Sie neurobasales Medium (NBM) vor: 50 % DMEM/F-12 mit stabilisiertem L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 50 % neurobasales Medium, 0,5-faches serumfreies Nahrungsergänzungsmittel (50x), 0,5-faches serumfreies Nahrungsergänzungsmittel auf Basis von Bottensteins N-1-Formulierung (100-fach), 0,5-fach stabilisiertes L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 0,5-fache MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x), 500 nM Natriumpyruvat (100 mM), 50 nM 2-Mercaptoethanol (50 mM), 0,025 % Humaninsulinlösung und 5 U/ml Penicillin-Streptomycin.
   HINWEIS: NBM muss bei 4 °C gelagert werden und kann bis zu 2 Wochen verwendet werden.
2. Beginnen Sie mit der neuronalen Differenzierung, indem Sie Doxycyclin (DOX) zu den hiPSC-Kulturen hinzufügen. Lassen Sie dazu die Aggregate in den Bioreaktorrohren absetzen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Zellen ab, lassen Sie ~5 ml im Röhrchen und fügen Sie 35 ml neuronales Induktionsmedium (NIM) hinzu, das aus NBM und 2 μg/ml DOX besteht.
   Anmerkungen: Da DOX lichtempfindlich ist, wird empfohlen, das Licht während der Arbeit auszuschalten.
3. Legen Sie die Röhrchen wieder in den Tischbioreaktor und setzen Sie die Kultivierung fort.
4. Führen Sie 2 Tage lang täglich Medienwechsel durch, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
   HINWEIS: Nach 4 Tagen in Suspensionskultur können die Aggregate dissoziiert und frühe Neuronen kryokonserviert oder direkt für die terminale Reifung neu plattiert werden.

4. Kryokonservierung früher Neuronen (Tag 2)

HINWEIS: Die Kryokonservierung ist nicht erforderlich und für den Differenzierungsprozess nicht kritisch, wird jedoch dringend empfohlen, da große Vorräte an frühen Neuronen hergestellt und für die spätere Reifung und Analyse gelagert werden können.

1. Lassen Sie die Aggregate im Bioreaktorrohr absetzen. Saugen Sie den Überstand wie zuvor beschrieben ab.
2. Übertragen Sie die Aggregate in ein steriles 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen und spülen Sie die Aggregate 2x vorsichtig mit 1x DPBS (-/-). Saugen Sie den Überstand so weit wie möglich vorsichtig ab, ohne die Aggregate zu stören.
3. Fügen Sie je nach Pelletgröße 2-5 ml vorgewärmtes Zelldissoziationsenzym hinzu und inkubieren Sie die Zellen für ca. 10 min bei 37 °C in einem Wasserbad. Resuspendieren Sie die sedimentierten Aggregate vorsichtig alle 2 Minuten, bis die Aggregate dissoziieren.
   HINWEIS: Eine nahezu homogene Zellsuspension sollte nach 7-10 min Inkubation erhalten werden.
4. Fügen Sie das dreifache Volumen des vorgewärmten NBM-Mediums hinzu und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine Zellvereinzelung zu gewährleisten.
5. Bestimmen Sie die Zellnummern und übertragen Sie das entsprechende Volumen für die Kryokonservierung in ein 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Eine Zelldichte von 5-10 × 10^{6 Zellen} /ml Gefriermedium wird empfohlen.
6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 3 min.
7. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in der entsprechenden Menge des Gefriermediums, das 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält.
8. Aliquotieren Sie die Zellsuspension in geeigneten Fläschchen für die Kryokonservierung (1 ml/Fläschchen).
9. Die Durchstechflaschen sofort in einen vorgekühlten, langsam gefrierenden Behälter überführen, der mit 2-Propanol gefüllt ist, und stellen Sie den Behälter über Nacht auf -80 °C. Stellen Sie die Durchstechflaschen am nächsten Tag zur Langzeitlagerung auf -150 °C.
   HINWEIS: Das flüssige 2-Propanol ist leicht entzündlich und kann bei Kontakt Augenschäden verursachen. Von Hitze fernhalten und Schutzhandschuhe sowie eine Brille tragen.

5. Reifung von hiPSC-abgeleiteten Neuronen in Monolayer-Kulturen

1. Bereiten Sie Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichtete Kulturschalen für die langfristige Kultivierung von hiPSC-abgeleiteten Neuronen vor.
   1. Die Poly-L-Ornithin-Stammlösung in 1x DPBS (-/-) auf 0,001 % verdünnen und das Geschirr über Nacht bei 4 °C oder 4 h bei 37 °C bestreichen. Saugen Sie die Poly-L-Ornithin-Lösung ab und waschen Sie die Platten einmal mit 1x DPBS (-/-).
   2. Die Lamininlösung wird in 1x DPBS (-/-) auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml verdünnt und die Schalen über Nacht bei 4 °C oder für 4 h bei 37 °C inkubiert.
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,1-0,15 ml pro cm2 wird für die Beschichtungsverfahren und 0,2 ml pro^cm2 für alle entsprechenden Waschschritte empfohlen. Alternative Beschichtungssubstrate können verwendet werden, aber mögliche Auswirkungen auf die Zellanheftung und -reifung sollten bewertet werden.
2. Tauen Sie die kryokonservierten Zellen auf. Legen Sie dazu das Kryoial in ein Wasserbad (eingestellt auf 37 °C) und schwenken Sie es ca. 1 Minute lang, bis ein kleiner Klumpen gefrorener Zellsuspension übrig bleibt.
3. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig tropfenweise in ein 15-ml-Röhrchen, das mit 10 ml vorgewärmtem NBM vorbereitet wurde. Spülen Sie das Kryoial mit 1 ml NBM und überführen Sie die Zellsuspension in das identische 15-ml-Röhrchen.
4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten.
5. Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 1-2 ml NIM hinzu, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig und bestimmen Sie die Zellnummern.
7. Die verbleibende Lamininlösung wird aus den beschichteten Zellkulturschalen abgesaugt und die Zellen mit einer Aussaatdichte von 1 × 10⁵ Zellen/^cm2 in NIM ausgesät, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
8. Schalten Sie das Medium nach 24 h auf NIM ohne ROCK-Inhibitor um.
9. Führen Sie 4 Tage lang tägliche Medienwechsel durch.
10. Nach dieser ersten Phase der NGN2-Induktion wird das DOX weggelassen und die Zellen in NBM kultiviert, wobei 2x pro Woche die Halbmedien gewechselt werden, bis das gewünschte Reifestadium erreicht ist.
    HINWEIS: Die Co-Kultivierung von iNGN2-Neuronen mit Astrozyten wird empfohlen, um das Überleben, die Anheftung, die Reife und die elektrische Aktivität der Zellen zu erhöhen^13,22.

6. Charakterisierung von Neuronen, die aus hiPSC stammen

HINWEIS: Die Differenzierung in neuronale Derivate kann mit den folgenden Techniken ausgewertet werden.

1. Immunzytochemie und Bildgebung
   1. Saugen Sie das Medium aus den hiPSC-abgeleiteten Neuronen ab und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x DPBS mit^Ca2 + und Mg²⁺ (+/+).
      Anmerkungen: Pipettieren Sie vorsichtig, vorzugsweise an den Rändern der Vertiefung, da sich die Zellen sehr leicht von der Oberfläche lösen können. Für alle Waschschritte wird ein Volumen von 0,2 mL pro^cm2 empfohlen, um eine vollständige Abdeckung der Zellen mit 1x DPBS (+/+) zu gewährleisten.
   2. Fixieren Sie die neuronalen Zellen mit einer Fixierungslösung, die 4 % Paraformaldehyd in DPBS (+/+) enthält, für 15 min bei Raumtemperatur (RT). Empfohlen wird ein Volumen von 0,1 ml pro^cm2 .
      HINWEIS: Paraformaldehyd (4%) in DPBS ist eine gefährliche und hautreizende Lösung mit akuter Toxizität und potenzieller Karzinogenität. Von Hitze fernhalten, Schutzhandschuhe und eine Schutzbrille tragen, Einatmen vermeiden und die Lösung nur in einer belüfteten Umgebung verwenden.
   3. Spülen Sie die Zellen vorsichtig 2x in 1x DPBS (+/+) aus und fahren Sie mit der Färbung fort.
      HINWEIS: Fixierte Zellen können bis zu 1 Monat bis zur Weiterverarbeitung in DPBS (+/+) bei 4 °C gelagert werden.
   4. Saugen Sie das DPBS (+/+) aus Proben ab. Permeabilisieren Sie die Zellen und blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 1x DPBS (+/+) mit 1% BSA und 0,2% Triton-X-100 für 60 min bei RT.
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,2 ml pro^cm2 wird empfohlen.
   5. Entfernen Sie den Überstand und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 4 °C, wobei die entsprechenden Primärantikörper in Färbepuffer (1x DPBS [+/+] enthält 1% BSA) verdünnt werden (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig mit Lösung bedeckt sind.
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,1-0,15 ml pro^cm2 wird empfohlen.
   6. Saugen Sie den Färbepuffer ab und spülen Sie die Zellen 3x in 1x DPBS (+/+).
   7. Die entsprechenden Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) werden in Färbepuffer in einer Endkonzentration von 1:1.000 verdünnt.
   8. Inkubieren Sie die Zellen in verdünnter Antikörperlösung für 1 h bei RT im Dunkeln. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig mit Lösung bedeckt sind.
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,1-0,15 ml pro^cm2 wird empfohlen.
   9. Saugen Sie die sekundäre Antikörperlösung ab und spülen Sie die Zellen 2x in 1x DPBS (+/+).
   10. Die Zellkerne werden mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in DPBS (+/+), für 5 min bei RT gegengefärbt.
       HINWEIS: Ein Arbeitsvolumen von 0,1-0,15 ml pro^cm2 wird empfohlen.
   11. Spülen Sie die Zellen 2x in 1x DPBS (+/+).
   12. Lagern Sie die Zellen bis zur Bildgebung in DPBS (+/+) bei 4 °C.
       HINWEIS: Die Hellfeld-Bildgebung eignet sich, um morphologische Veränderungen und Neuritenauswuchs zu verfolgen. Darüber hinaus kann die stereotype Markerexpression mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden. Während undifferenzierte hiPS-Zellen OCT 3/4 und NANOG exprimieren, können beta-III-Tubulin (TUBB3) und das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 (MAP2) als neuronale Marker für die Visualisierung von Neuriten und Axonen dienen. Das neuritische Netzwerk kann durch die Bestimmung der Neuritenlänge in Hellfeld- oder Fluoreszenzbildern weiter beurteilt werden.
2. Genexpressionsanalysen mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
   1. Saugen Sie das Medium ab und spülen Sie die Zellen einmal in 1x DPBS (-/-).
      HINWEIS: Ein Volumen von 0,2 ml pro^cm2 wird empfohlen.
   2. Fügen Sie kalten RNA-Lysepuffer hinzu und ernten Sie die Zellen durch Kratzen.
   3. Isolieren Sie die RNA mit einem geeigneten säulenbasierten Kit und bestimmen Sie die RNA-Konzentrationen mittels UV-Photospektrometrie.
   4. Generieren Sie cDNA mit 250 ng Gesamt-RNA und einem geeigneten Kit für die reverse Transkription.
   5. Bereiten Sie molekulare Beacon-qPCR-Reaktionen vor, die 2,5 ng cDNA in doppelter Ausführung enthalten. Verwenden Sie eine geeignete Mastermischung und entsprechende Primer-Assays²⁰ (siehe Materialtabelle).
   6. Führen Sie die qPCR durch, indem Sie 45 Zyklen mit Primer-Annealing bei 60 °C für 20 s anwenden.
   7. Normalisieren Sie die relativen Genexpressionsniveaus auf den Mittelwert der Housekeeping-Gene GAPDH, HPRT1 und GUSB. Wenden Sie die ΔΔCt-Methode²³ an, wobei undifferenzierte hiPSCs als Kalibrator verwendet werden.

In den ersten Schritten werden adhärente Kulturen von hiPS-Zellen abgelöst, singularisiert und in Suspension überführt (Abbildung 2). Aggregate bilden sich innerhalb von 24 h und wachsen kontinuierlich an Größe. Nach 2 Tagen Transgen-Induktion können frühe Neuronen für nachfolgende Experimente kryokonserviert werden.

Die anhaltende Proliferation während der ersten Tage in der Suspension führt zu einer Zunahme der Zellzahl, die nach 2 Tagen Induktion ihren Höhepunkt erreicht (Abbildung 3A,B). Mit der Vermehrung beginnen die Aggregate zu wachsen. Im Vergleich zu Tag 0 nimmt der Durchmesser an Tag 2 um 50 % zu und hat sich an Tag 5 fast verdoppelt (Abbildung 3D). Obwohl ein zunehmender Durchmesser die Nährstoffversorgung innerhalb der Aggregate einschränkt, wird die Lebensfähigkeit der Zellen weder am Tag 2 noch am Tag 5 der Differenzierung beeinträchtigt (Abbildung 3C). Eine längere Kultivierung über mehr als 4 Tage in Suspension verbessert jedoch die Zellausbeute nicht weiter, da die Aggregate zunehmend resistent gegen enzymatische Singularisierung werden (Abbildung 3B).

Nach der Kryokonservierung werden die Tag-2-Zellen aufgetaut und zur terminalen Reifung auf Poly-L-Ornithin (PLO)-lamininbeschichtete Schalen plattiert. Im Allgemeinen heften sich die Zellen nach dem Auftauen sehr gut an und beginnen früh, die Neuriten zu verlängern. Das zeitliche Genexpressionsprofil sowie die immunzytochemische Färbung der neuronalen Marker TUBB3 und MAP2 bestätigen die neuronale Zellidentität (Abbildung 4A,B). Zusätzlich zu den steigenden Spiegeln von TUBB3 und MAP2 sind neuronale Kulturen mit Mikrotubuli-assoziierten Protein-Tau-Transkripten (MAPT) angereichert, die für ein neuronales Protein kodieren, das an der Axonstabilisierung beteiligt ist, und zeigen eine gleichzeitige Abnahme der Expression des pluripotenzregulierenden Transkriptionsfaktors POU5F1. Darüber hinaus bildet sich innerhalb der ersten Woche nach dem Auftauen ein dichtes neuritisches Netzwerk (Abbildung 4C). Diese morphologischen Veränderungen deuten in Verbindung mit dem Transkriptionsprofil auf eine zunehmende Reifung der neuronalen Kulturen hin.

Abbildung 2: Generierung von hiPSC-abgeleiteten iNGN2-Neuronen unter Verwendung eines Benchtop-Bioreaktors. (A) Schematische Übersicht über das Differenzierungsparadigma, wobei die wichtigsten Schritte der Zellkultur hervorgehoben werden. (B-F) Hellfeldbilder visualisieren (B) hiPSCs und (C,D) die Bildung von Aggregaten im Benchtop-Bioreaktor. (E,F) iNGN2-Neurone verlängern Neuriten und erfahren während der Differenzierung morphologische Veränderungen. Maßstabsleiste = 100 μm. Abkürzungen: BMM = Basalmembranmatrix; iPSC-MM = iPSC-Erhaltungsmedium; PLO = Poly-L-Ornithin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Zellausbeute und Viabilität während der Aggregatbildung und des Wachstums. (A) Hellfeldbilder zeigen die Bildung von Aggregaten innerhalb von 2 Tagen nach der Kultivierung im Tischbioreaktor sowie die Zunahme der Aggregatgröße im Laufe der Zeit. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Quantifizierung der Zellausbeute und (C) Viabilität über den Differenzierungsverlauf. Balkendiagramme stellen den Mittelwert + SD aus vier unabhängigen Experimenten dar. (D) Der Durchmesser, der die Größe der Zuschlagstoffe angibt, wurde halbautomatisch mit der Open-Source-Software ImageJ (Version 1.53) bestimmt. Zuerst wurden Hellfeldbilder in Binärbilder umgewandelt und dann mit dem Werkzeug "Partikel analysieren" weiter bewertet, wobei die folgenden Parameter angewendet wurden: Größe > 2.500 μm2, Kreisförmigkeit 0,45-1, Kanten ausschließen und Löcher einschließen. Horizontale Linien zeigen den Mittelwert ± SD von fünf unabhängigen Differenzierungen an. Einzelne Punkte stellen den Mittelwert einzelner Differenzierungsexperimente mit mindestens 20 Aggregaten pro Zeitpunkt dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Charakterisierung von hiPSC-abgeleiteten iNGN2-Neuronen. Zeitliches Genexpressionsprofil für die neuronalen Gene TUBB3, MAP2 und MAPT sowie das pluripotente Stammzell-assoziierte Gen POU5F1. Die relativen Expressionsniveaus wurden auf die Referenzgene GAPDH, HPRT1 und GUSB normalisiert. Als Kalibrator wurden undifferenzierte hiPSCs (Tag-2) gewählt. Die geometrischen Symbole geben den Mittelwert ± SD von vier unabhängigen Differenzierungen an. (B) Repräsentative Bilder von iNGN2-Neuronen an Tag 7 nach dem Auftauen (Tag-2 + 7), gefärbt auf Beta-III-Tubulin (TUBB3, magenta) und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2, cyan). Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsbalken = 100 μm. (C) Auswertung des neuritischen Netzwerks in Hellfeldaufnahmen neuronaler Kulturen nach dem Auftauen. Die Gesamtlänge der Neuriten wurde in einem Bereich von 930,82 × 698,11μm2 mit ImageJ (Version 1.53) bestimmt. Nach dem Einstellen der Helligkeit und des Kontrasts wurden die Bilder in 8-Bit-Bilder umgewandelt und die Farben invertiert. Die Neuriten wurden anschließend skelettiert und dann mit den ImageJ-Plugins "Skeletonize" bzw. "Analyze Skeleton" analysiert. Die Gesamtlänge der Neuriten wurde durch die Anzahl der Soma in der interessierenden Region dividiert, um die durchschnittliche Neuritenlänge/Zelle zu erhalten. Balkendiagramme stellen den Mittelwert + SD aus drei unabhängigen Experimenten dar. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.