Name: Herstellung von humanen Neurogenin 2-induzierbaren Neuronen in einem dreidimensionalen Suspensionsbioreaktor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Neuronen aus humanen iPSCs in einem 3D-Suspensionsbioreaktor. Diese Methode ermöglicht hohe Zellausbeute, schnelle neuronale Differenzierung und skalierbare Anwendungen für die Neurowissenschaft.

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Das EBiSC2-Projekt wurde im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 821362 vom Gemeinsamen Unternehmen Innovative Medicines Initiative 2 gefördert. Das Gemeinsame Unternehmen wird durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union und die EFPIA unterstützt. Wir danken Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters und Vanessa M. Nalewaja für ihre Unterstützung bei immunzytochemischen und Genexpressionsanalysen sowie Heike Arthen für ihre hervorragende technische Unterstützung. Darüber hinaus danken wir Stephanie Bur für die Etablierung des Bioreaktorprogramms. Abbildung 2A wurde mit BioRender.com erstellt.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Es wurde bereits gezeigt, dass die ektopische Expression des neuronalen Transkriptionsfaktors NGN2 frühe Stadien der neuronalen Differenzierung beschleunigt und die neuronale Linienbindung in hiPS-Zellen innerhalb von 1 Woche nach der Kultivierung induziert12,13,20. Diese Arbeit beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung von geneditierten BIONi010-C-13 hiPSCs in iNGN2-Neuronen unter Verwendung eines Benchtop-Bioreaktors.
Der CERO 3D-Bioreaktor ist ein Bioreaktor mit geringem Volumen und vier Schlitzen für Spezialröhrchen mit einem maximalen Fassungsvermögen von jeweils 50 ml. Die Temperatur und der CO2 -Gehalt werden kontinuierlich kontrolliert und die Anbauparameter (z. B. Drehzahl und Zeit) werden für jede Röhre unabhängig voneinander geregelt, so dass der Anwender mehrere Differenzierungsansätze parallel ausführen kann. Integrierte Wellenbrecher an der Rohrinnenwand ermöglichen eine Störung des Mediums bei geringer Scherspannung und halten 3D-Aggregate bei kontrollierter Rotation in Schwebe. Ein eingeschränkter Zugang zu Nährstoffen sowie erzwungene 3D-Zell-Zell- und Zell-extrazelluläre Matrix-Interaktionen (EZM) können die zelluläre Differenzierung und das zelluläre Verhalten erheblich beeinflussen24,25,26,27.
Die Kultivierung von Zellen als 3D-Aggregate in Suspension erhöht diese Zellinteraktionen und ahmt dadurch die In-vivo-Umgebung von Geweben oder Organen besser nach28. Die gleichzeitige Störung des Mediums reguliert die Größe der Aggregate durch mechanische Reibung, verbessert den Gasaustausch und verringert den Gradienten von Nährstoffen und Abfällen im Rohr, während die physiologisch relevanten Gradienten innerhalb der Aggregate erhalten bleiben 29,30,31,32,33,34. Obwohl der Mediumwechsel manuell durchgeführt wird, reduziert der Tischbioreaktor die Arbeits- und Betriebskosten im Vergleich zu statischen Kulturkolben. Der Bioreaktor bietet auch mehrere Vorteile gegenüber vollautomatischen Rührkessel-Bioreaktoren, da das laufradlose Design die hydrodynamische Scherspannung an der Aggregatoberfläche reduziert, wodurch nicht nur das Überleben der Zellen verbessert, sondern auch die Auswirkungen der Scherspannung auf empfindliche iPS-Zellen, Zelldifferenzierung und Funktion begrenztwerden 35,36,37,38.
Vertikale Radbioreaktoren, bei denen die Zellen durch ein großes vertikales Laufrad bewegt werden, sowie Schaukelbioreaktoren mit aufgeblasenen Kulturbeuteln, die an einer motorisierten Plattform befestigt sind, stellen alternative 3D-Aufhängungsplattformen dar. Obwohl die Kultivierung von hiPS-Zellen exzessiv getestet wurde 17,18,19,39,40, ist wenig über ihre Anwendbarkeit in neuronalen Differenzierungsansätzen bekannt, und die Berichte beschränken sich auf die erfolgreiche Expansion von neuronalen Vorläuferzellen von Säugetieren und Menschen in Rührkessel-Bioreaktoren 41,42,43,44, wobei sich eine seltene Anzahl von Studien auf Folgendes konzentriert Reifung44,45. Generell bieten automatisierte 3D-Aufhängungsplattformen den Vorteil eines vollautomatischen und computergesteuerten Medienwechsels, wodurch Schwankungen in der Handhabung reduziert und das Kontaminationsrisiko minimiert wird. Darüber hinaus können Nährstoffparameter wie Laktat und Glukosekonzentration kontinuierlich überwacht werden. Die Etablierung dieser Systeme erfordert jedoch oft eine erhebliche Anfangsinvestition, Laborfläche und die Schulung von qualifiziertem Personal. Der Tischbioreaktor stellt eine kompakte und einfach zu bedienende Alternative für die Kultivierung von Zellen in Suspension dar, bietet jedoch keine gleichzeitige Überwachung der Nährstoffe.
Wie in den meisten Protokollen, die für die Kultivierung von Zellen in 3D-Suspensionsplattformen verwendet werden, stellt die anfängliche Bildung von Aggregaten einen kritischen Schritt dar. hiPSCs werden als adhärente Monoschichten kultiviert und anschließend als Einzelzellsuspensionen in eine 3D-Umgebung überführt. Um den Zellverlust in diesem Stadium zu minimieren, müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Das Design der Röhrchen mit den integrierten Wellenbrechern bedeutet, dass ein minimales Kulturvolumen von 10 ml pro Röhrchen erforderlich ist, um eine optimale Störung des Mediums zu gewährleisten. Das kritische Volumen sollte daher langfristig nicht unterschritten werden. Darüber hinaus wird eine Startaussaatdichte von 7,5 Millionen Zellen pro 10 ml Kulturvolumen und eine Rotationsgeschwindigkeit von 60 U/min dringend empfohlen, um kurzfristig stabile Aggregate zu bilden, obwohl je nach Zelllinie Anpassungen erforderlich sein können.
Nach dem Überführen von hiPS-Zellen in Suspension sollten innerhalb von 24 Stunden Aggregate gebildet werden. Der erste Mediumwechsel ist kritisch, da die Aggregate klein sind und sich möglicherweise nicht richtig absetzen. Die Zeit für die Sedimentation von Aggregaten kann verlängert werden, sollte jedoch nicht mehr als 10 Minuten überschreiten, da Aggregate zu verklumpen und heterogen wachsen können. Während der Aspiration sollte ein minimales Kulturvolumen von 5 ml im Röhrchen verbleiben und Störungen des Mediums vermieden werden. Dennoch ist in der Anfangsphase mit einem Verlust von Zellen und Aggregaten zu rechnen. Die Zellzahlen deuten auf eine konstante Zellausbeute über die ersten 2 Tage in Kultur hin, was darauf hindeutet, dass die hohe proliferative Kapazität der hiPS-Zellen den anfänglichen Zellverlust kompensiert. Einmal in der Suspension, führt die schonende Kultivierung und Störung zu homogen großen Aggregaten, die mit der Zeit zu wachsen beginnen.
Die neuronale Differenzierung erfolgte nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll, das auf der Doxycyclin-induzierten NGN2-Überexpression13 basiert, und die einzelnen Schritte wurden für eine 3D-Kultivierung optimiert. Der neuronale Transkriptionsfaktor NGN2 ist ein gut beschriebener Treiber bei der neuronalen Differenzierung und beschleunigt die neuronale Induktion signifikant11,13,46. Während die konventionelle Musterbildung mit definierten Wachstumsfaktoren mehrere Wochen bis Monate dauert 7,8,9, induziert die NGN2-Expression das neuronale Zellschicksal innerhalb von Tagen. Neben der verkürzten Kultivierungszeit ist das Protokoll weder von teuren Wachstumsfaktoren noch von Beschichtungsmatrizes für die initiale Suspensionskultur abhängig, wodurch die Kultivierungskosten zusätzlich gesenkt werden.
Darüber hinaus ergab ein direkter Vergleich der NGN2-getriebenen Erzeugung unreifer Neurone in adhärenten und Suspensionskulturen eine 1,36-fache Zunahme der Zellen nach 4 Tagen in Kultur mit dem Benchtop-Bioreaktor20, während das für die Erzeugung von 1 Million Zellen benötigte Volumen des Mediums voraussichtlich halbiert wird. Der Einsatz des Benchtop-Bioreaktors für die Erzeugung von iNGN2-Neuronen könnte daher von Vorteil sein, da eine höhere Anzahl von Zellen mit geringerer Handhabungszeit und geringeren Kosten hergestellt werden kann. In Übereinstimmung mit früheren Berichten wurde schon früh ein Engagement für neuronale Abstammungslinien beobachtet. Nach 2 Tagen NGN2-Induktion zeigte sich eine tiefgreifende Expression klassischer neuronaler Marker wie TUBB3, MAP2 und MAPT, was die Anwendbarkeit des Benchtop-Bioreaktors für die neuronale Induktion unterstützt. Nach diesem Protokoll können innerhalb von 4 Tagen nach der Kultivierung etwa 6,2 Millionen unreife iNGN2-Neuronen aus 1 Million hiPS-Zellen gewonnen werden. Die Ausbringungskapazität kann jedoch von Charge zu Charge variieren und hängt vom Volumen der Suspensionskultur bei der Aussaat ab.
Um den Ertrag weiter zu steigern, wurde die Anbauzeit um weitere 3 Tage verlängert; Obwohl die Aggregate größer wurden, wurden sie auch sehr kompakt und konnten für die Kryokonservierung oder Neubeschichtung nicht richtig dissoziiert werden. Trotz Fortschritten bei 3D-Kulturansätzen sind adhärente 2D-Neurokulturen immer noch der Goldstandard für funktionelle Analysen wie Mikroelektroden-Arrays oder Kalzium-Bildgebung. Die Zellsingularisierung ist somit eine wichtige Voraussetzung für eine homogen verteilte neuronale Monolage und ein neuritisches Netzwerk. Eine stärkere mechanische Ablösung der Zellen oder scharfe Dissoziationsreagenzien können verwendet werden, um eine Singularisierung zu gewährleisten, jedoch mit potenziellen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, Physiologie und Wiederanheftungsfähigkeit der Zellen47,48. Im Hinblick auf den Bedarf an Einzelzellen für weitere Analysen und Reifung wurden die Aggregate nach 4 Tagen in Suspension dissoziiert und die (Tag 2) iNGN2-Neuronen kryokonserviert. Die Differenzierung und Charakterisierung von iNGN2-Neuronen nach dem Auftauen bestätigte eine zunehmende Reife der neuronalen Kulturen und die Bildung eines dichten neuritischen Netzwerks.
Das bereitgestellte Protokoll liefert eine hohe Anzahl von iNGN2-Neuronen. Es müssen jedoch einige Einschränkungen berücksichtigt werden. Wie bei den meisten Suspensionskulturplattformen ist der Transfer von hiPS-Zellen aus einer 2D-adhärenten Kultur in eine 3D-Umgebung kritisch und oft mit einem tiefgreifenden Zellverlust verbunden. Weitere signifikante Zell- und Aggregatverluste sind bei Medienwechseln zu erwarten. Im Vergleich zu automatisierten Plattformen erhöht sich die Handhabungszeit und das Kontaminationsrisiko mit dem Benchtop-Bioreaktor, da der Mediumwechsel manuell durchgeführt werden muss. Abgesehen von der fehlenden Automatisierung bietet der Benchtop-Bioreaktor keine Möglichkeit, die Nährstoffe zu überwachen, und die maximale Kapazität von 50 ml pro Röhrchen schränkt das Upscaling-Potenzial des Protokolls ein. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass, obwohl NGN2 die Bindung neuronaler Linien beschleunigt, die Dauer der terminalen Reifung nicht verkürzt wird und immer noch eine Langzeitkultur über mehrere Wochen erforderlich ist. Angesichts der Bedeutung der astrozytären Unterstützung für die neuronale Funktion, Bindung und das Überleben 49,50,51 sollten Kokulturansätze in Betracht gezogen werden, die für eine langfristige Kultivierung sogar unerlässlich sein können.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein 2D-Differenzierungsprotokoll erfolgreich in eine 3D-Umgebung für die schnelle und reproduzierbare Generierung von iNGN2-Neuronen durch die Implementierung eines Benchtop-Bioreaktors übersetzt werden konnte. Das beschriebene Protokoll liefert große Mengen an qualitativ hochwertigen, aus iPS-Zellen gewonnenen Neuronen, die als Ausgangspunkt für komplexe Modelltests, Hochdurchsatz-Drogenscreenings und groß angelegte Toxizitätstests dienen können.

Neurologische Erkrankungen sind weltweit die häufigste Ursache für Behinderungen1. Jeder sechste Mensch ist betroffen, Tendenz steigend. Die damit verbundene finanzielle Belastung für die Gesellschaften und ihre Gesundheitssysteme ist enorm. Eine Evaluierung von 30 europäischen Ländern im Jahr 2010 schätzte die jährlichen Kosten im Zusammenhang mit psychischen und neurologischen Erkrankungen auf 800 Mrd. EUR2. Die zunehmende sozioökonomische Belastung erfordert effektive Behandlungsstrategien, und obwohl unser Verständnis der Pathophysiologie von Krankheiten erheblich zugenommen hat, ist die Translation in die Klinik oft unzureichend. Im Allgemeinen werden nur 12 % der Arzneimittel in klinische Studien aufgenommen, von denen mehr als 80 % in späteren Phasen scheitern, hauptsächlich aufgrund von Unwirksamkeit oder unvorhergesehener Toxizität 3,4. Die Gründe sind vielfältig, aber die eingeschränkte Übertragbarkeit von Tierversuchen in präklinischen Stadien auf Humanversuche ist zunehmend in den Vordergrund gerückt5. Humane In-vitro-Zell- und Gewebemodelle können die Lücke der interspeziesübergreifenden Translation schließen, und Fortschritte in der Technologie der human-induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) haben in dieser Hinsicht großes Potenzial. hiPS-Zellen sind in der Grundlagenforschung weit verbreitet und haben wesentliche Eigenschaften mit embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) gemeinsam, wie z. B. eine nahezu unbegrenzte Selbsterneuerungsfähigkeit und die Fähigkeit, sich in alle drei Keimblätter zu differenzieren6, während ethische Bedenken im Zusammenhang mit der Zerstörung von Embryonen umgangen werden.
Die Ableitung neuronaler Zellen aus hES-Zellen und später hiPS-Zellen markierte einen Meilenstein in der Hirnforschung. Die ersten Differenzierungsprotokolle basierten auf der Anwendung von Wachstumsfaktoren, die kritische Schritte während der Embryogenese nachahmten, von denen die meisten eine duale SMAD-Hemmung entweder in Suspensions- oder adhärenten Kulturen beinhalteten 7,8,9. Reife Neuronen wurden erfolgreich generiert, aber einige Nachteile dieser Protokolle behindern immer noch ihren breiten Einsatz in der Arzneimittelentwicklung, wie z. B. die geringe Ausbeute und die hohe Variabilität der erzeugten Neuronen von Charge zu Charge sowie die umfangreiche Arbeitsbelastung im Zusammenhang mit langen Kulturzeiten. Verbesserungen wurden durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren erzielt, die entscheidend an der Neurogenese beteiligt sind, und Mitglieder der Neurogenin (NGN)-Familie, insbesondere NGN2, wurden als effektive Treiber identifiziert10. Die lentiviral-vermittelte ektopische Expression von NGN2 in hiPS-Zellen beschleunigte die frühen Stadien der neuronalen Differenzierung signifikant und induzierte das neuronale Zellschicksal innerhalb von nur 1 Woche11. Die anschließende terminale Reifung in Kokulturen mit Astrozyten ergab funktionelle Neurone in hoher Reinheit und Menge mit reproduzierbaren Eigenschaften. Die gezielte Genom-Editierung des Safe-Harbor-Locus der Adeno-assoziierten Virusintegrationsstelle 1 (AAVS1) wurde dann angewendet, um hiPSC-Linien mit einer stabilen und Doxycyclin-induzierbaren Expressionskassette für NGN212,13 zu erzeugen und so unerwünschte Nebenwirkungen der lentiviralen Verabreichung zu minimieren.
Die robuste und effiziente Differenzierung von Doxycyclin-induzierbaren Neurogenin 2 (iNGN2)-Neuronen birgt ein großes Potenzial für phänotypische Wirkstoffscreenings und Toxizitätsassays mit hohem Durchsatz10,14,15; In den letzten zehn Jahren wurden erhebliche Fortschritte in der Bioprozesstechnik bei der Implementierung von Bioreaktoren für eine skalierbare Zellexpansion und -differenzierung erzielt16,17,18,19. Die meisten Differenzierungsprotokolle sind jedoch für adhärente Kulturen optimiert, und die Übersetzung in eine dreidimensionale (3D) Umgebung erfordert oft wesentliche Modifikationen. Kürzlich wurde über den erfolgreichen Einsatz eines Tisch-3D-Bioreaktors mit reduzierten Scherspannungsmerkmalen für die Expansion von hiPSCs und für die reproduzierbare Differenzierung in Hepatozyten, Kardiomyozyten und Neuronen berichtet20. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Charakterisierung von iNGN2-Neuronen unter Verwendung des identischen 3D-Bioreaktors bereitgestellt.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol 50 mM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11528926</tr><tr><td>60 mm Nunclon Delta Surface</td><td>Nunc</td><td>734-2040</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Beta III Tubulin Antikörper [TU-20] (Verdünnung 1:1.000)</td><td>Abcam&nbsp; &nbsp;</td><td>ab7751&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Angewandte Biosysteme&nbsp; Reverse-Transkriptionskit für cDNA mit hoher Kapazität</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td></td><td></td>10400745</tr><tr><td>B-27 Zuschlag (50x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530536</td><td>serumfreies Supplement (50x)</td></tr><tr><td>BIONi010-C-13 hiPSC-Linie</td><td>Europäische Bank für induzierte pluripotente Stammzellen (EBiSC), BIONEER als Einleger</td><td>SAMEA103988285</td><td>Bioneer ist Einleger in EBiSC und Eigentümer der hiPSC-Linie.</td></tr><tr><td>Biorender&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biorender.com</tr><tr>Thermo Fisher Scientific<td>in BSA-Zellkulturqualität</td><td> &nbsp;</td><td></td><td></td>12330023</tr><tr><td>CERO 3D Inkubator & Bioreaktor</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800000</td><td></td></tr><tr><td>CEROtubes Zellkulturröhrchen 50 mL</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800005</td><td></td></tr><tr><td>Citavi 6</td><td>Swiss Academic Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10 Stemcell</td><td></td><td>7930</td><td>Gefriermedium mit 10% DMSO</td></tr><tr><td>Cytofix Fixierlösung</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>554655</td><td>Fixierlösung mit 4 % Paraformaldehyd&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12333553</tr><tr><td>Doxycyclinhydrochlorid (DOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3447</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ohne Calcium und Magnesium (DPBS -/-)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS mit Calcium und Magnesium (DPBS +/+)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11580456</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-/-)</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scient&nbsp; &nbsp;</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-038</td><td>stabilisiertes L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid</td></tr><tr><td>ImageJ 1,51v&nbsp;</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulinlösung human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278l</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Monoklonaler Antikörper (Verdünnung 1: 300)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>13-1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Wachstumsfaktor reduziert, phenolrotfrei&nbsp;</td><td>Corning Life Science&nbsp;</td><td>356231</td><td>Basalmembranmatrix</td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11140035</tr><tr><td>MicroAmp Optisches Klebefolien-Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10095714</tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell</td><td>85850</td><td>Feeder-freies iPSC-Erhaltungsmedium</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>serumfreies Supplement auf Basis von Bottenstein s N-1 Formulierung</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>11570556</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2</td><td>Nikon Instruments Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter-NC200</td><td>ChemoMetec A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herkunft 2021</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Perm/Wash Puffer&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>Primer Assay TUBB3(Hs00801390_s1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer Assay GAPDH (Hs99999905_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer Assay GUSB (Hs99999908_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer Assay HPRT1 (Hs99999909_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer-Assay MAP2 (Hs00258900_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer-Assay MAPT (Hs00902194_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer-Assay POU5F1 (Hs04260367_gH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin 0,01%</td><td>Merck</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>säulenbasiertes RNA-Isolationskit</td></tr><tr><td>RLT-Puffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>12539059</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>11599686</td><td>Zelldissoziationsenzym</td></tr><tr><td>TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>11380912</td><td>qPCR-Mastermix</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Via1-Kassette</td><td>ChemoMetec A/S</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Bohrung Thermo</td><td>Fisher Wissenschaftliche</td><td>10088880</td><td></td></tr><tr><td>X20 OPTISCHE 96WELL SCHNELLE KLARE REAKTIONSPLATTEN&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206343</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid, Rho-Kinase-Inhibitor (ROCK-Inhibitor)</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von humanen neurogenin 2-induzierbaren neuronen in einem dreidimensionalen suspensionsbioreaktor

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

Die Ableitung neuronaler Stammzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) markierte einen Meilenstein in der Hirnforschung. Seit ihrem ersten Aufkommen wurden die Protokolle kontinuierlich optimiert und sind heute in der Forschung und Arzneimittelentwicklung weit verbreitet. Die sehr lange Laufzeit dieser konventionellen Differenzierungs- und Reifungsprotokolle und die steigende Nachfrage nach qualitativ hochwertigen hiPS-Zellen und ihren neuronalen Derivaten erhöhen jedoch die Notwendigkeit der Übernahme, Optimierung und Standardisierung dieser Protokolle für die Großserienproduktion. In dieser Arbeit wird ein schnelles und effizientes Protokoll zur Differenzierung von genetisch veränderten, Doxycyclin-induzierbaren Neurogenin 2 (iNGN2)-exprimierenden hiPSCs in Neuronen unter Verwendung eines dreidimensionalen (3D) Suspensionsbioreaktors vorgestellt.
Kurz gesagt, Einzelzellsuspensionen von iNGN2-hiPSCs konnten innerhalb von 24 Stunden Aggregate bilden, und die neuronale Linienbindung wurde durch die Zugabe von Doxycyclin induziert. Die Aggregate wurden nach 2 Tagen Induktion dissoziiert und die Zellen wurden entweder kryokonserviert oder für die terminale Reifung neu plattiert. Die generierten iNGN2-Neurone exprimierten schon früh klassische neuronale Marker und bildeten innerhalb von 1 Woche nach dem Replating komplexe neuritische Netzwerke, was auf eine zunehmende Reife der neuronalen Kulturen hinweist. Zusammenfassend wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die schnelle Generierung von hiPSC-abgeleiteten Neuronen in einer 3D-Umgebung bereitgestellt, das ein großes Potenzial als Ausgangspunkt für die Modellierung von Krankheiten, phänotypische Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings und groß angelegte Toxizitätstests birgt.

In den ersten Schritten werden adhärente Kulturen von hiPS-Zellen abgelöst, singularisiert und in Suspension überführt (Abbildung 2). Aggregate bilden sich innerhalb von 24 h und wachsen kontinuierlich an Größe. Nach 2 Tagen Transgen-Induktion können frühe Neuronen für nachfolgende Experimente kryokonserviert werden.
Die anhaltende Proliferation während der ersten Tage in der Suspension führt zu einer Zunahme der Zellzahl, die nach 2 Tagen Induktion ihren Höhepunkt erreicht (Abbildung 3A,B). Mit der Vermehrung beginnen die Aggregate zu wachsen. Im Vergleich zu Tag 0 nimmt der Durchmesser an Tag 2 um 50 % zu und hat sich an Tag 5 fast verdoppelt (Abbildung 3D). Obwohl ein zunehmender Durchmesser die Nährstoffversorgung innerhalb der Aggregate einschränkt, wird die Lebensfähigkeit der Zellen weder am Tag 2 noch am Tag 5 der Differenzierung beeinträchtigt (Abbildung 3C). Eine längere Kultivierung über mehr als 4 Tage in Suspension verbessert jedoch die Zellausbeute nicht weiter, da die Aggregate zunehmend resistent gegen enzymatische Singularisierung werden (Abbildung 3B).
Nach der Kryokonservierung werden die Tag-2-Zellen aufgetaut und zur terminalen Reifung auf Poly-L-Ornithin (PLO)-lamininbeschichtete Schalen plattiert. Im Allgemeinen heften sich die Zellen nach dem Auftauen sehr gut an und beginnen früh, die Neuriten zu verlängern. Das zeitliche Genexpressionsprofil sowie die immunzytochemische Färbung der neuronalen Marker TUBB3 und MAP2 bestätigen die neuronale Zellidentität (Abbildung 4A,B). Zusätzlich zu den steigenden Spiegeln von TUBB3 und MAP2 sind neuronale Kulturen mit Mikrotubuli-assoziierten Protein-Tau-Transkripten (MAPT) angereichert, die für ein neuronales Protein kodieren, das an der Axonstabilisierung beteiligt ist, und zeigen eine gleichzeitige Abnahme der Expression des pluripotenzregulierenden Transkriptionsfaktors POU5F1. Darüber hinaus bildet sich innerhalb der ersten Woche nach dem Auftauen ein dichtes neuritisches Netzwerk (Abbildung 4C). Diese morphologischen Veränderungen deuten in Verbindung mit dem Transkriptionsprofil auf eine zunehmende Reifung der neuronalen Kulturen hin.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig02.jpg"> Abbildung 2: Generierung von hiPSC-abgeleiteten iNGN2-Neuronen unter Verwendung eines Benchtop-Bioreaktors. (A) Schematische Übersicht über das Differenzierungsparadigma, wobei die wichtigsten Schritte der Zellkultur hervorgehoben werden. (B-F) Hellfeldbilder visualisieren (B) hiPSCs und (C,D) die Bildung von Aggregaten im Benchtop-Bioreaktor. (E,F) iNGN2-Neurone verlängern Neuriten und erfahren während der Differenzierung morphologische Veränderungen. Maßstabsleiste = 100 μm. Abkürzungen: BMM = Basalmembranmatrix; iPSC-MM = iPSC-Erhaltungsmedium; PLO = Poly-L-Ornithin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig03.jpg"> Abbildung 3: Zellausbeute und Viabilität während der Aggregatbildung und des Wachstums. (A) Hellfeldbilder zeigen die Bildung von Aggregaten innerhalb von 2 Tagen nach der Kultivierung im Tischbioreaktor sowie die Zunahme der Aggregatgröße im Laufe der Zeit. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Quantifizierung der Zellausbeute und (C) Viabilität über den Differenzierungsverlauf. Balkendiagramme stellen den Mittelwert + SD aus vier unabhängigen Experimenten dar. (D) Der Durchmesser, der die Größe der Zuschlagstoffe angibt, wurde halbautomatisch mit der Open-Source-Software ImageJ (Version 1.53) bestimmt. Zuerst wurden Hellfeldbilder in Binärbilder umgewandelt und dann mit dem Werkzeug "Partikel analysieren" weiter bewertet, wobei die folgenden Parameter angewendet wurden: Größe &gt; 2.500 μm2, Kreisförmigkeit 0,45-1, Kanten ausschließen und Löcher einschließen. Horizontale Linien zeigen den Mittelwert ± SD von fünf unabhängigen Differenzierungen an. Einzelne Punkte stellen den Mittelwert einzelner Differenzierungsexperimente mit mindestens 20 Aggregaten pro Zeitpunkt dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig04.jpg"> Abbildung 4: Charakterisierung von hiPSC-abgeleiteten iNGN2-Neuronen. Zeitliches Genexpressionsprofil für die neuronalen Gene TUBB3, MAP2 und MAPT sowie das pluripotente Stammzell-assoziierte Gen POU5F1. Die relativen Expressionsniveaus wurden auf die Referenzgene GAPDH, HPRT1 und GUSB normalisiert. Als Kalibrator wurden undifferenzierte hiPSCs (Tag-2) gewählt. Die geometrischen Symbole geben den Mittelwert ± SD von vier unabhängigen Differenzierungen an. (B) Repräsentative Bilder von iNGN2-Neuronen an Tag 7 nach dem Auftauen (Tag-2 + 7), gefärbt auf Beta-III-Tubulin (TUBB3, magenta) und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2, cyan). Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsbalken = 100 μm. (C) Auswertung des neuritischen Netzwerks in Hellfeldaufnahmen neuronaler Kulturen nach dem Auftauen. Die Gesamtlänge der Neuriten wurde in einem Bereich von 930,82 × 698,11μm2 mit ImageJ (Version 1.53) bestimmt. Nach dem Einstellen der Helligkeit und des Kontrasts wurden die Bilder in 8-Bit-Bilder umgewandelt und die Farben invertiert. Die Neuriten wurden anschließend skelettiert und dann mit den ImageJ-Plugins "Skeletonize" bzw. "Analyze Skeleton" analysiert. Die Gesamtlänge der Neuriten wurde durch die Anzahl der Soma in der interessierenden Region dividiert, um die durchschnittliche Neuritenlänge/Zelle zu erhalten. Balkendiagramme stellen den Mittelwert + SD aus drei unabhängigen Experimenten dar. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Neuronen in einem 3D-Suspensionsbioreaktor.

Herstellung von humanen Neurogenin 2-induzierbaren Neuronen in einem dreidimensionalen Suspensionsbioreaktor

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...

Die Verwendung von Bioreaktoren zur Translation von induzierten pluripotenten Stammzellen oder IPSC-Kulturprotokollen von 2D nach 3D ermöglicht die Erzeugung von Zellen in hoher Stückzahl für großtechnische Anwendungen wie Hochdurchsatz-Screenings. Dieses schnelle neuronale Differenzierungsprotokoll in einer physiologischen 3D-Umgebung verbessert die Interaktionen der Starterzellen und sorgt für eine hohe Zellausbeute über einen kürzeren Zeitraum mit einer geringen Variation von Charge zu = Charge, wodurch Kosten und Zeit reduziert werden. Die Europäische Bank für induzierte pluripotente Stammzellen wendet ähnliche Ansätze für die schnelle und kostengünstige Erzeugung differenzierter Zellen über mehrere Abstammungslinien hinweg an, einschließlich anderer Gehirnzellen und Kardiomyozyten.Beginnen Sie mit der Vorkultivierung, wenn die humaninduzierte pluripotente Stammzelle oder die humane iPSC-Kultur zu 60 bis 80 % konfluent ist. Saugen Sie das Medium vollständig von den humanen iPS-Zellen ab und spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 1X DPBS aus. Geben Sie zwei Milliliter vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung in die sechs Zentimeter große Petrischale und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Inkubator.Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Schalen, um die Zellablösung zu erleichtern, oder inkubieren Sie ein bis zwei Minuten länger, wenn sich die Zellen nicht ablösen. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in jeder Schale, indem Sie fünf Milliliter feederfreies IPSC-Erhaltungsmedium mit ROCK-Inhibitor hinzufügen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter- oder 50-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren, um eine Zellvereinzelung zu gewährleisten.Bestimmen Sie die Zellzahlen in 100 Mikrolitern Zellsuspension mit einem automatisierten Zellzähler und übertragen Sie das gewünschte Volumen der Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 300 g. Als nächstes wird der Überstand abgesaugt und die Zellen in zwei Millilitern feederfreiem IPSC-Erhaltungsmedium mit ROCK-Inhibitor resuspendiert.Füllen Sie jede 50-Milliliter-Tube mit 18 Millilitern des Mediums. Geben Sie dann 20 Milliliter Zellsuspension in jedes Bioreaktorröhrchen. Legen Sie die Röhrchen in das Bioreaktorsystem und stellen Sie die Kultivierungsparameter für eine unbegrenzte Dauer ein.Starten Sie das Vorkultivierungsprogramm über das Display des Bioreaktors. Um das Medium am nächsten Tag zu wechseln, lassen Sie das Aggregat etwa fünf Minuten lang in den Bioreaktorrohren absetzen, bevor Sie den Überstand vorsichtig ansaugen. Fügen Sie 15 Milliliter frisches, feederfreies IPSC-Pflegemedium ohne ROCK-Inhibitor pro Röhrchen hinzu und setzen Sie die Kultivierung im Laborbioreaktor für 24 Stunden fort.Um mit der neuronalen Differenzierung zu beginnen, lassen Sie das Aggregat in den Bioreaktorröhren absetzen und saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Zellen ab, so dass etwa fünf Milliliter Überstand im Röhrchen verbleiben. Fügen Sie dann 35 Milliliter neuronales Induktionsmedium hinzu, das aus neurobasalem Medium und zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin besteht. Legen Sie die Röhrchen wieder in den Tischbioreaktor und setzen Sie die Kultivierung fort.Führen Sie zwei Tage lang täglich Medienwechsel durch, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie den Überstand wie zuvor gezeigt abgesaugt haben, überführen Sie die Aggregate in ein steriles 15-Milliliter- oder 50-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie die Aggregate zweimal vorsichtig mit DPBS aus. Saugen Sie den Überstand so weit wie möglich vorsichtig ab, ohne die Aggregate zu stören.Geben Sie dann je nach Pelletgröße zwei bis fünf Milliliter vorgewärmtes Zelldissoziationsenzym in das Pellet und inkubieren Sie die Zellen etwa 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Wasserbad. Resuspendieren Sie die sedimentierten Aggregate vorsichtig alle zwei Minuten, bis die Aggregate dissoziieren. Fügen Sie vorgewärmtes neurobasales Medium hinzu, das das Dreifache des Volumens des zuvor hinzugefügten Zelldissoziationsenzyms hat, und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine Zellsingularisierung zu gewährleisten.Bestimmen Sie die Zellnummern und übertragen Sie das entsprechende Volumen der Zellsuspension für die Kryokonservierung in ein 15-Milliliter- oder 50-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen bei 300 g drei Minuten lang zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig im entsprechenden Volumen des Gefriermediums, das 10 % Dimethylsulfoxid enthält.Aliquotieren Sie die Zellsuspension in geeigneten Fläschchen für die Kryokonservierung. Die Durchstechflaschen sofort in einen vorgekühlten, langsam gefrierenden Behälter mit 2-Propanol überführen und den Behälter über Nacht bei minus 80 Grad Celsius abstellen. Stellen Sie die Fläschchen am nächsten Tag bei minus 150 Grad Celsius zur Langzeitlagerung auf.Nachdem die adhärenten Kulturen humaner iPS-Zellen abgelöst, vereinzelt und in Suspension überführt worden waren, bildeten sich innerhalb von 24 Stunden Aggregate, die weiter wuchsen. Nach zwei Tagen Transgen-Induktion konnten frühe Neuronen für die spätere Reifung kryokonserviert werden. Es wurde eine anhaltende Proliferation der humanen iPS-Zellen während der ersten Tage in Suspension beobachtet, und die Anzahl der Zellkulturen erreichte nach zwei Tagen Induktion ihren Höhepunkt.Eine längere Kultivierung über mehr als vier Tage in Suspension verbesserte jedoch nicht die Zellausbeute, da die Aggregate zunehmend resistent gegen enzymatische Singularisierung wurden. Darüber hinaus stieg der Gesamtdurchmesser im Vergleich zum Tag Null am zweiten Tag um 50 % und verdoppelte sich am fünften Tag fast. Obwohl die Zunahme des Durchmessers die Nährstoffversorgung der Aggregate einschränkt, war die Lebensfähigkeit der Zellen am zweiten oder fünften Tag der Differenzierung nicht beeinträchtigt.Das zeitliche Genexpressionsprofil sowie die immunchemische Färbung der neuronalen Marker beta-drei-Tubulin und Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP2) bestätigten die neuronale Zellidentität der kryokonservierten Zellen am zweiten Tag. Zusätzlich wurden neuronale Kulturen mit Mikrotubuli-assoziierten Protein-Tau-Transkripten (MAPT) angereichert und zeigten eine gleichzeitige Abnahme der Expression des pluripotenzregulierenden Transkriptionsfaktors POU5F1. Innerhalb der ersten Woche nach dem Auftauen bildete sich ein dichtes neuritisches Netzwerk, das ebenfalls auf eine zunehmende Reifung der neuronalen Kulturen hindeutete. Dieses Protokoll legt den Grundstein für die Translation in großtechnische und vollautomatische Bioreaktoren, die eine weitere signifikante Steigerung der Zellaustragskapazität für zukünftige großtechnische Anwendungen zeigen.Nach dem Nachweis mit Neurogenin 2 wurde die Verwendung von linear bestimmenden Transkriptionsfaktoren zur Beschleunigung der Differenzierung auf viele verschiedene Zelltypen und Krankheiten angewendet, um die iPSC-Modellierung zu erleichtern.

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Research

Forschung

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Neuroscience

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