Herstellung von humanen Neurogenin 2-induzierbaren Neuronen in einem dreidimensionalen Suspensionsbioreaktor

Die Verwendung von Bioreaktoren zur Translation von induzierten pluripotenten Stammzellen oder IPSC-Kulturprotokollen von 2D nach 3D ermöglicht die Erzeugung von Zellen in hoher Stückzahl für großtechnische Anwendungen wie Hochdurchsatz-Screenings. Dieses schnelle neuronale Differenzierungsprotokoll in einer physiologischen 3D-Umgebung verbessert die Interaktionen der Starterzellen und sorgt für eine hohe Zellausbeute über einen kürzeren Zeitraum mit einer geringen Variation von Charge zu = Charge, wodurch Kosten und Zeit reduziert werden. Die Europäische Bank für induzierte pluripotente Stammzellen wendet ähnliche Ansätze für die schnelle und kostengünstige Erzeugung differenzierter Zellen über mehrere Abstammungslinien hinweg an, einschließlich anderer Gehirnzellen und Kardiomyozyten.

Beginnen Sie mit der Vorkultivierung, wenn die humaninduzierte pluripotente Stammzelle oder die humane iPSC-Kultur zu 60 bis 80 % konfluent ist. Saugen Sie das Medium vollständig von den humanen iPS-Zellen ab und spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 1X DPBS aus. Geben Sie zwei Milliliter vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung in die sechs Zentimeter große Petrischale und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Inkubator.

Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Schalen, um die Zellablösung zu erleichtern, oder inkubieren Sie ein bis zwei Minuten länger, wenn sich die Zellen nicht ablösen. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in jeder Schale, indem Sie fünf Milliliter feederfreies IPSC-Erhaltungsmedium mit ROCK-Inhibitor hinzufügen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter- oder 50-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren, um eine Zellvereinzelung zu gewährleisten.

Bestimmen Sie die Zellzahlen in 100 Mikrolitern Zellsuspension mit einem automatisierten Zellzähler und übertragen Sie das gewünschte Volumen der Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 300 g. Als nächstes wird der Überstand abgesaugt und die Zellen in zwei Millilitern feederfreiem IPSC-Erhaltungsmedium mit ROCK-Inhibitor resuspendiert.

Füllen Sie jede 50-Milliliter-Tube mit 18 Millilitern des Mediums. Geben Sie dann 20 Milliliter Zellsuspension in jedes Bioreaktorröhrchen. Legen Sie die Röhrchen in das Bioreaktorsystem und stellen Sie die Kultivierungsparameter für eine unbegrenzte Dauer ein.

Starten Sie das Vorkultivierungsprogramm über das Display des Bioreaktors. Um das Medium am nächsten Tag zu wechseln, lassen Sie das Aggregat etwa fünf Minuten lang in den Bioreaktorrohren absetzen, bevor Sie den Überstand vorsichtig ansaugen. Fügen Sie 15 Milliliter frisches, feederfreies IPSC-Pflegemedium ohne ROCK-Inhibitor pro Röhrchen hinzu und setzen Sie die Kultivierung im Laborbioreaktor für 24 Stunden fort.

Um mit der neuronalen Differenzierung zu beginnen, lassen Sie das Aggregat in den Bioreaktorröhren absetzen und saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Zellen ab, so dass etwa fünf Milliliter Überstand im Röhrchen verbleiben. Fügen Sie dann 35 Milliliter neuronales Induktionsmedium hinzu, das aus neurobasalem Medium und zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin besteht. Legen Sie die Röhrchen wieder in den Tischbioreaktor und setzen Sie die Kultivierung fort.

Führen Sie zwei Tage lang täglich Medienwechsel durch, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie den Überstand wie zuvor gezeigt abgesaugt haben, überführen Sie die Aggregate in ein steriles 15-Milliliter- oder 50-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie die Aggregate zweimal vorsichtig mit DPBS aus. Saugen Sie den Überstand so weit wie möglich vorsichtig ab, ohne die Aggregate zu stören.

Geben Sie dann je nach Pelletgröße zwei bis fünf Milliliter vorgewärmtes Zelldissoziationsenzym in das Pellet und inkubieren Sie die Zellen etwa 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Wasserbad. Resuspendieren Sie die sedimentierten Aggregate vorsichtig alle zwei Minuten, bis die Aggregate dissoziieren. Fügen Sie vorgewärmtes neurobasales Medium hinzu, das das Dreifache des Volumens des zuvor hinzugefügten Zelldissoziationsenzyms hat, und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine Zellsingularisierung zu gewährleisten.

Bestimmen Sie die Zellnummern und übertragen Sie das entsprechende Volumen der Zellsuspension für die Kryokonservierung in ein 15-Milliliter- oder 50-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen bei 300 g drei Minuten lang zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig im entsprechenden Volumen des Gefriermediums, das 10 % Dimethylsulfoxid enthält.

Aliquotieren Sie die Zellsuspension in geeigneten Fläschchen für die Kryokonservierung. Die Durchstechflaschen sofort in einen vorgekühlten, langsam gefrierenden Behälter mit 2-Propanol überführen und den Behälter über Nacht bei minus 80 Grad Celsius abstellen. Stellen Sie die Fläschchen am nächsten Tag bei minus 150 Grad Celsius zur Langzeitlagerung auf.

Nachdem die adhärenten Kulturen humaner iPS-Zellen abgelöst, vereinzelt und in Suspension überführt worden waren, bildeten sich innerhalb von 24 Stunden Aggregate, die weiter wuchsen. Nach zwei Tagen Transgen-Induktion konnten frühe Neuronen für die spätere Reifung kryokonserviert werden. Es wurde eine anhaltende Proliferation der humanen iPS-Zellen während der ersten Tage in Suspension beobachtet, und die Anzahl der Zellkulturen erreichte nach zwei Tagen Induktion ihren Höhepunkt.

Eine längere Kultivierung über mehr als vier Tage in Suspension verbesserte jedoch nicht die Zellausbeute, da die Aggregate zunehmend resistent gegen enzymatische Singularisierung wurden. Darüber hinaus stieg der Gesamtdurchmesser im Vergleich zum Tag Null am zweiten Tag um 50 % und verdoppelte sich am fünften Tag fast. Obwohl die Zunahme des Durchmessers die Nährstoffversorgung der Aggregate einschränkt, war die Lebensfähigkeit der Zellen am zweiten oder fünften Tag der Differenzierung nicht beeinträchtigt.

Das zeitliche Genexpressionsprofil sowie die immunchemische Färbung der neuronalen Marker beta-drei-Tubulin und Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP2) bestätigten die neuronale Zellidentität der kryokonservierten Zellen am zweiten Tag. Zusätzlich wurden neuronale Kulturen mit Mikrotubuli-assoziierten Protein-Tau-Transkripten (MAPT) angereichert und zeigten eine gleichzeitige Abnahme der Expression des pluripotenzregulierenden Transkriptionsfaktors POU5F1. Innerhalb der ersten Woche nach dem Auftauen bildete sich ein dichtes neuritisches Netzwerk, das ebenfalls auf eine zunehmende Reifung der neuronalen Kulturen hindeutete. Dieses Protokoll legt den Grundstein für die Translation in großtechnische und vollautomatische Bioreaktoren, die eine weitere signifikante Steigerung der Zellaustragskapazität für zukünftige großtechnische Anwendungen zeigen.

Nach dem Nachweis mit Neurogenin 2 wurde die Verwendung von linear bestimmenden Transkriptionsfaktoren zur Beschleunigung der Differenzierung auf viele verschiedene Zelltypen und Krankheiten angewendet, um die iPSC-Modellierung zu erleichtern.