Method Article

Aufklärung des Metabolismus von 2,4-Dibromphenol in Pflanzen

DOI:

10.3791/65089

⸱

February 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Microbial Control Technology for Industrial Pollution in Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology, 2International Joint Research Center for Persistent Toxic Substances (IJRC-PTS), College of Environment, Zhejiang University of Technology, 3Research and Teaching Center of Agriculture, Zhejiang Open University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Identifizierung von 2,4-Dibromphenol-Metaboliten in Pflanzen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nutzpflanzen können in großem Umfang organischen Schadstoffen ausgesetzt sein, da der Boden eine wichtige Senke für Schadstoffe ist, die in die Umwelt gelangen. Dies führt zu einer potenziellen Exposition des Menschen durch den Verzehr von Lebensmitteln, die mit Schadstoffen angereichert sind. Die Aufklärung der Aufnahme und des Stoffwechsels von Xenobiotika in Nutzpflanzen ist für die Bewertung des ernährungsbedingten Expositionsrisikos beim Menschen von entscheidender Bedeutung. Für solche Experimente erfordert die Verwendung intakter Pflanzen jedoch Langzeitexperimente und komplexe Probenvorbereitungsprotokolle, die von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden können. Pflanzenkalluskulturen in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) können eine Lösung für die genaue und zeitsparende Identifizierung von Metaboliten von Xenobiotika in Pflanzen darstellen, da sie Störungen durch die mikrobielle oder pilzliche Mikroumgebung vermeiden, die Behandlungsdauer verkürzen und den Matrixeffekt intakter Pflanzen vereinfachen können. 2,4-Dibromphenol, ein typisches Flammschutzmittel und endokriner Disruptor, wurde aufgrund seines weit verbreiteten Vorkommens im Boden und seines Aufnahmepotenzials durch Pflanzen als Modellsubstanz ausgewählt. Hierin wurde Pflanzenkallus aus Asepsissamen erzeugt und einem sterilen 2,4-Dibromphenol-haltigen Nährmedium ausgesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 120 h Inkubation acht Metaboliten von 2,4-Dibromphenol im Kallusgewebe der Pflanzen identifiziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass 2,4-Dibromphenol in den pflanzlichen Kallusgeweben schnell metabolisiert wurde. Somit ist die Pflanzenkalluskulturplattform eine effektive Methode, um die Aufnahme und den Metabolismus von Xenobiotika in Pflanzen zu bewerten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immer mehr organische Schadstoffe werden aufgrund anthropogener Aktivitäten in die Umwelt abgegeben 1,2, und der Boden gilt als wichtige Senke für diese Schadstoffe 3,4. Die Schadstoffe im Boden können von Pflanzen aufgenommen und möglicherweise auf Organismen auf höherer trophischer Ebene entlang der Nahrungsketten übertragen werden, indem sie durch den Verzehr von Pflanzen direkt in den menschlichen Körper gelangen, was zu einer unbeabsichtigten Exposition führt 5,6. Pflanzen nutzen verschiedene Wege, um Xenobiotika zur Entgiftung zu verstoffwechseln7; Die Aufklärung des Stoffwechsels von Xenobiotika ist wichtig, da sie den tatsächlichen Verbleib von Schadstoffen in Pflanzen steuert. Da die Metaboliten über die Blätter (in die Atmosphäre) oder die Wurzeln ausgeschieden werden können, bietet die Bestimmung der Metaboliten in den sehr frühen Expositionsphasen die Möglichkeit, eine größere Anzahl von Metaboliten zu testen8. Studien mit intakten Pflanzen erfordern jedoch Langzeitexperimente und komplexe Probenvorbereitungsprotokolle, die von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden können.

Pflanzliche Kalluskulturen sind daher eine gute Alternative, um den Stoffwechsel von Xenobiotika in planta zu untersuchen, da sie die Behandlungszeit stark verkürzen können. Diese Kulturen schließen mikrobielle Interferenz und photochemischen Abbau aus, vereinfachen den Matrixeffekt intakter Pflanzen, standardisieren die Kultivierungsbedingungen und erfordern weniger experimentellen Aufwand. Pflanzliche Kalluskulturen wurden erfolgreich als alternativer Ansatz in Stoffwechselstudien von Triclosan9, Nonylphenol10 und Tebuconazol8 eingesetzt. Diese Studien zeigten, dass die Stoffwechselmuster in Kalluskulturen denen in intakten Pflanzen ähnelten. Diese Studie schlägt eine Methode zur effizienten und genauen Identifizierung von Metaboliten von Xenobiotika in Pflanzen ohne komplexe und zeitaufwändige Protokolle vor. Hier verwenden wir pflanzliche Kalluskulturen in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie für die Analyse von Metaboliten mit Signalen niedriger Intensität11,12.

Zu diesem Zweck wurden Kallussuspensionen aus Karotten (Daucus carota var. sativus) 120 μg/l 2,4-Dibromphenol für 120 h in einem Schüttler bei 130 U/min und 26 °C ausgesetzt. 2,4-Dibromphenol wurde aufgrund seiner störenden endokrinen Aktivität13 und seines weit verbreiteten Vorkommens im Boden14 ausgewählt. Die Metaboliten wurden extrahiert und mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert. Das hier vorgeschlagene Protokoll kann den In-planta-Metabolismus anderer Arten von organischen Verbindungen, die ionisiert werden können, untersuchen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Differenzierung der Karottenschwiele

HINWEIS: Autoklavieren Sie alle hier verwendeten Geräte und führen Sie alle Vorgänge in einer UV-sterilisierten, ultrareinen Werkbank durch.

  1. Vernalisieren Sie die Samen, indem Sie die gleichmäßigen Karottensamen (Daucus carota var. sativus) 16 h lang bei 4 °C in deionisiertes Wasser tauchen.
  2. Sterilisieren Sie die vernalisierten Samen 20 Minuten lang mit 75%igem Ethanol und spülen Sie sie dann dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser unter aseptischen Bedingungen ab.
  3. Die Samen werden 20 Minuten lang mit 20 %H2O2sterilisiert und sechsmal unter aseptischen Bedingungen mit sterilisiertem deionisiertem Wasser gewaschen.
  4. Die Samen werden aseptisch gekeimt, indem sie auf hormonfreiem MS-Medium (pH 5,8, autoklaviert bei 121 °C für 20 Minuten) mit 1 % Agargel ausgesät und 15 Tage lang bei 26 °C mit einer Photoperiode von 16 Stunden (350 μmol/m2s) inkubiert werden.
  5. Erhalten Sie die Explantate, indem Sie das Hypokotyl und das Keimblatt der Sämlinge in kleine Stücke (0,5 cm) schneiden.
  6. Die Explantaten werden unter aseptischen Bedingungen in Petrischalen (zwei bis vier Explantate pro Schale) umgewandelt, die 15-20 ml aseptisches MS-Medium enthalten, das mit Auximon (2,4-Dichlorphenoxyessigsäure; 1 mg/l) und Phytokinin (6-Benzylaminopurin; 0,5 mg/l) ergänzt ist.
  7. Inkubieren Sie die Explantate im Dunkeln bei 26 °C für 3-4 Wochen, um die Hornhaut zu induzieren.
  8. Trennen Sie das Kallusgewebe (ca. 1 cm Durchmesser), das sich aus den ursprünglichen Explantaten gebildet hat, mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette.
    HINWEIS: Das neu gebildete Kallusgewebe hat eine weiße bis cremegelbe Farbe und haftet lose an den ursprünglichen Explantaten an.

2. 2,4-Dibromphenol-Behandlung

  1. 1 μg 2,4-Dibromphenol wird in 10 ml aseptischem flüssigem MS-Medium gelöst (die Endkonzentration von 2,4-Dibromphenol beträgt 100 ppb, pH 5,6-7,0).
  2. 3 g der frischen Karottenkallus (Schritt 1.8) werden unter aseptischen Bedingungen in Glaskolben gegeben, die die zubereitete 2,4-Dibromphenollösung (aus Schritt 2.1) enthalten. Betrachten Sie dies als die 2,4-Dibromphenol-Behandlung.
    HINWEIS: Die Glaskolben wurden autoklaviert und mit Paraffinfolie versiegelt.
  3. Eine Mediumkontrolle, die nur die 2,4-Dibromphenollösung enthält (hergestellt in Schritt 2.1), ist zur Beurteilung des abiotischen Abbaus von 2,4-Dibromphenol einzuschließen.
  4. Fügen Sie eine Blindkontrolle bei, die nur die Karotten-Hornhaut enthält (keine 2,4-Dibromphenol-Lösung), um sie auf eine mögliche Kontamination zu überprüfen.
    1. Bereiten Sie die Blindkontrolle mit Karotten vor, indem Sie 3 g frisch gesammelte Karottenkallus nur in 10 ml steriles MS-Medium geben.
  5. Die 2,4-Dibromphenol-Behandlung und die Medium- und Blindkontrollen werden bei 130 U/min und 26 °C im Dunkeln in einem Inkubator für 120 h inkubiert.
  6. Die Glaskolben werden nach 120 Stunden Inkubation aus dem Inkubator entnommen, um die Proben aus der 2,4-Dibromphenol-Behandlung und -Kontrolle zu entnehmen.
    HINWEIS: Alle Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt.

3. Probenvorbereitung

  1. Trennen Sie die Hornhaut vorsichtig vom MS-Medium durch Filtration mit Glasfaserfiltern (0,45 μm) für die 2,4-Dibromphenol-Behandlung und die Kontrollen. Sammeln Sie die Hornhaut nach dreimaligem Waschen mit Reinstwasser.
  2. Die gesammelte Hornhaut wird mit flüssigem Stickstoff gefriergetrocknet und anschließend mit einem Hochdurchsatz-Gewebeschleifer bei 70 Hz für 3 min homogenisiert.
  3. Spicken Sie die homogenisierte Hornhaut, indem Sie 50 μl 25 mg/l Surrogat 4-n-NP-d4 mit einer Glasmikrospritze hinzufügen und anschließend 1 Minute lang vortexen.
  4. Die Proben werden 30 min lang mit 5 ml Methanol/Wasser (1:1, v/v) in einem mit Eiswasser gefüllten Ultraschallgerät (150 W, 40 kHz) beschallt, um 2,4-Dibromphenol und die Metaboliten zu extrahieren.
  5. Die Suspensionen werden bei 8.000 x g bei 4 °C für 10 min zentrifugiert und die Überstände durch Pipettieren gesammelt.
    1. Wiederholen Sie die Extraktionsvorgänge für die Hornhautprobe dreimal und kombinieren Sie die Extrakte.
  6. Leiten Sie die Extrakte durch hydrophile lipophile balancierte Festphasenextraktionskartuschen (HLB SPE) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min.
    HINWEIS: Die HLB SPE-Kartuschen wurden nacheinander mit 6 ml Methanol und 6 ml Wasser vorbehandelt, um Interferenzen zu beseitigen.
  7. Eluieren Sie die Analyten, indem Sie 6 ml Methanol durch die HLB SPE-Kartuschen leiten. Anschließend werden die erhaltenen Eluenten unter einem sanften Stickstoffgasstrom für die instrumentelle Analyse auf 1 ml konzentriert.
  8. Injizieren Sie 10 μl der resultierenden Eluenten in die UPLC-Q-TOF-MS für die Analyse von 2,4-Dibromphenol und ihren Metaboliten15.
    1. Filtern Sie alle Proben vor der instrumentellen Analyse mit einer 0,22 μm Nylonmembran.

4. Instrumentelle Analyse

ANMERKUNG: Die Analysen von 2,4-Dibromphenol und seinen Metaboliten wurden an einem Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographen (UPLC) in Kombination mit einem micrOTOF-QII-Massenspektrometer durchgeführt, das mit einer Elektrospray-Ionisation (ESI) ausgestattet ist und im positiven und negativen Ionenmodus arbeitet.

  1. Öffnen Sie die Klappe der Säulenheizung und installieren Sie die UPLC-Säule, indem Sie den Säuleneinlass mit dem Einspritzventil und den Säulenauslass mit dem Einlass des Massenspektrometers verbinden.
    HINWEIS: Eine C18-Säule (50 mm x 2,1 mm; 1,7 μm Partikelgröße) wurde für die Trennung der Analyten bei 40 °C verwendet.
  2. Verbinden Sie die mobile Phase A (Reinstwasser) und die mobile Phase B (Methanol in Chromatographiequalität) mit dem Gerät, indem Sie das Ende der Lösungsmittelröhrchen A und B in die entsprechenden Lösungsmittelflaschen einführen.
    1. Filtern Sie alle mobilen Phasen (jeweils 500 ml) durch einen 0,22-μm-Filter und beschallen Sie sie länger als 30 Minuten.
  3. Klicken Sie im Softwarefenster auf Instrument | Einlassmethode , um die Bedingungen für das Flüssigkeitschromatogramm zu bearbeiten.
    1. Stellen Sie die Gradientenbedingungen der mobilen Phase B wie folgt ein: eine Flussrate von 1,0 ml/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5 % bis 50 %; 3,5-6,5 min, 50% bis 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, 100% bis 5%.
    2. Stellen Sie die Injektionsrate der Proben in die UPLC-Q-TOF-MS auf 0,2 ml/min ein.
      HINWEIS: Die Injektion der Probe wird mit einem vollautomatischen Probenehmer programmiert.
  4. Wählen Sie im Softwarefenster MS-Methode und stellen Sie dann die Parameter von Q-TOF-MS ein: eine Durchflussrate des Trocknungsgases (N2) von 8 l/min, eine Temperatur von 300-350 °C; einer Kapillarspannung von 4.500 V; einer Kollisionsenergie von 5-45 V; und einem vollen Scanbereich von 40-800 Da.
  5. Platzieren Sie die Probenfläschchen an den entsprechenden Stellen der Probenschalen anhand der Seriennummer und setzen Sie die Probenschalen wieder in die Probenkammer ein.
    HINWEIS: Halten Sie die Probenschalen flach und stellen Sie sicher, dass die Tür der Probenkammer geschlossen ist.
  6. Wählen Sie im Softwarefenster Datei | Neu beim Erstellen einer Datenbank. Benennen Sie die Datenbank.
  7. Laden Sie das oben erstellte Beispielprogramm, indem Sie MS File | Inlet-Datei | Volumen injizieren.
  8. Speichern Sie die Datenbank im Beispielordner des Projekts, indem Sie auf Datei | Speichern.
  9. Wählen Sie Ausführen | Beginnen Sie im Hauptfenster der Software, wählen Sie dann Beispieldaten erfassen aus, und klicken Sie im Fenster der Ausführung der Beispielliste starten, um Daten zu sammeln, auf OK .
    HINWEIS: Das Echtzeit-Chromatogramm kann angezeigt werden, indem Sie auf Chromatogramm | Echtzeit-Aktualisierung während des Datenerfassungsprozesses.
  10. Verarbeiten Sie die Daten in der Software, indem Sie die Zieldatenzeile auswählen und auf das Fenster Chromatogramm klicken, um das MS-Scan-Chromatogramm anzuzeigen.
  11. Klicken Sie im Fenster Chromatogramm auf Anzeige | TIC | ScanWaveDS | Ablaufverfolgung hinzufügen | OK , um die Massenspektren des Tochterscans zu erhalten.
  12. Identifizieren Sie die Metaboliten, indem Sie die Chromatogramme der 2,4-Dibromphenol-Behandlung mit denen der Kontrollen vergleichen.
  13. Aufklärung der Metabolitenkandidaten anhand der Retentionszeit, der Masse und der Fragmentierungsmuster16,17.
    ANMERKUNG: Der Fehler der Massengenauigkeit zwischen den experimentellen m/z-Werten der Mutterionen der Metabolitenkandidaten und den entsprechenden theoretischen m/z sollte weniger als 10 ppm betragen.

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Results

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Die Schritte des Protokolls sind in Abbildung 1 dargestellt. Dem Protokoll folgend, verglichen wir das Chromatogramm des Karotten-Kallusextrakts aus der 2,4-Dibromphenol-Behandlung mit den Kontrollen und fanden acht verschiedene Peaks, die in der 2,4-Dibromphenol-Behandlung vorhanden sind, aber in den Kontrollen fehlten (Abbildung 2). Dies deutet darauf hin, dass insgesamt acht Metaboliten von 2,4-Dibromphenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 und M187) ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Biotransformation von Xenobiotika in Pflanzen effizient zu identifizieren. Der kritische Schritt dieses Protokolls ist die Kultivierung der Pflanzenkallus. Der schwierigste Teil ist die Differenzierung und Pflege des Pflanzenkallus, da der Pflanzenkallus leicht infiziert wird und sich zu Pflanzengewebe entwickelt. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle verwendeten Geräte autoklaviert sind und alle Vorgänge unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Die Differenz...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (21976160) und dem Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-DichlorphenoxyessigsäureWAKO1 mg/L
20% H2O2Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.10011218-500ML
4-n-NP, >99%Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4Pointe-Claire
6-BenzylaminopurinWAKO0,5 mg/L
75% EthanolSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.1269101-500ML
7890A-5975  GaschromatographieAgilent
ACQULTY ultra-performance  FlüssigkeitschromatographieWasser
BraunglasfläschchenWasser
Inkubator für künstliches KlimaNingbo DongNan Lab Equipment Co.,LTDRDN-1000A-4
AutoklavenSTIKMJ-Serie
C18 SäuleACQUITY UPLC BEH
ZentrifugeThermo Fisher
DB-5MS KapillarsäuleAgilent
DichlormethanSigma-Aldrich40071190-4L
GefriertrocknerSCIENTZ 
Tissueschleifer mit hohem DurchsatzSCIENTZ 
MethanolSigma-Aldrich
MicrOTOF-QII MassenspektrometerBruker Daltonics
Milli-Q SystemMilliporeMS1922801-4L
Murashige & Skoog mediumHOPEBIOHB8469-7
N-HexanSigma-AldrichH109658-4L
Stickstoff-Blasinstrument AOSHENGMD200-2
NP Isomere, >99%Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB KartuschenWasser60 mg/3 mL
Research plusEppendorf100-1000 µ L
Samen der Zwergfinger-Karotte (Daucus carota var. sativus) Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Schütteln  InkubatorenShanghai bluepard instruments Co., ltd.THZ-98AB
FestphasenextraktorAUTO SCIENCE
UltraschallgerätZKIUC-6
UV-sterilisierte UltrareinheitswerkbankAIRTECH

References

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