Method Article

Optimierung der Epimedii Folium Hammelöl-Verarbeitungstechnologie und Prüfung ihrer Wirkung auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen

DOI:

10.3791/65096

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March 17th, 2023

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1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

In This Article

Summary

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In diesem Protokoll wurde die Hammelöl-Verarbeitungstechnologie von Epimedii folium (EF) durch die Anwendung einer Box-Behnken-experimentellen Design-Response-Oberflächenmethodik optimiert und der Einfluss von rohem und optimiertem wasserextrahiertem EF auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen vorläufig untersucht.

Abstract

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Als Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat Epimedii folium (EF) eine Geschichte in Medizin und Lebensmitteln, die > 2.000 Jahre alt ist. Klinisch wird EF, das mit Hammelöl verarbeitet wird, häufig als Arzneimittel verwendet. In den letzten Jahren haben die Berichte über Sicherheitsrisiken und unerwünschte Reaktionen von Produkten, die EF als Rohstoff verwenden, allmählich zugenommen. Durch die Verarbeitung kann die Sicherheit der TCM effektiv verbessert werden. Nach der TCM-Theorie kann die Verarbeitung von Hammelöl die Toxizität von EF verringern und seine tonisierende Wirkung auf die Nieren verstärken. Es fehlt jedoch an einer systematischen Erforschung und Bewertung der EF-Hammelöl-Verarbeitungstechnologie. In dieser Studie haben wir die experimentelle Design-Response-Oberflächenmethodik von Box-Behnken verwendet, um die Schlüsselparameter der Verarbeitungstechnologie zu optimieren, indem wir den Inhalt mehrerer Komponenten bewertet haben. Die Ergebnisse zeigten, dass die optimale Hammelöl-Verarbeitungstechnologie von EF wie folgt war: Erhitzen des Hammelöls auf 120 °C ± 10 °C, Zugabe des rohen EF, sanftes Braten auf 189 °C ± 10 °C, bis es gleichmäßig glänzt, und dann herausnehmen und abkühlen lassen. Pro 100 kg EF sollten 15 kg Hammelöl verwendet werden. Die Toxizitäten und Teratogenitäten eines wässrigen Extrakts aus Roh- und Hammelöl, das mit EF verarbeitet wurde, wurden in einem Entwicklungsmodell eines Zebrafischembryos verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die rohe Kräutergruppe mit größerer Wahrscheinlichkeit Zebrafischdeformationen verursachte und ihre halbmaximale tödliche EF-Konzentration niedriger war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die optimierte Hammelöl-Verarbeitungstechnologie stabil und zuverlässig war und eine gute Wiederholgenauigkeit aufweist. Bei einer bestimmten Dosis war der wässrige Extrakt von EF toxisch für die Entwicklung von Zebrafischembryonen, und die Toxizität war für das Roharzneimittel stärker als für das verarbeitete Arzneimittel. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hammelölverarbeitung die Toxizität von rohem EF reduzierte. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um die Qualität, Einheitlichkeit und klinische Sicherheit von mit Hammelöl verarbeitetem EF zu verbessern.

Introduction

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Epimedii folium (EF) sind die getrockneten Blätter von Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., oder Epimedium koreanum Nakai. EF kann zur Behandlung von Osteoporose, Wechseljahrssyndrom, Knoten in der Brust, Bluthochdruck, koronarer Herzkrankheit und anderen Krankheiten eingesetzt werden1. Als Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) blickt EF auf eine mehr als 2.000-jährige Geschichte in Medizin und Ernährung zurück. Aufgrund seines niedrigen Preises und seiner bemerkenswerten Wirkung auf die Nieren wird es häufig in Medikamenten und gesunden Lebensmitteln verwendet. EF wird durch Braten mit Hammelöl verarbeitet, ein Prozess, der erstmals in der Lei Gong-Verarbeitungstheorie beschrieben wurde, die von Lei Xiao in der Liu-Song-Periode2 geschrieben wurde. Die Wirksamkeit von rohem EF und gebratenem EF ist sehr unterschiedlich. Rohes EF vertreibt hauptsächlich Rheuma, während das gebratene EF die Nieren erwärmt, um Yang3 zu stärken. Gegenwärtig wird EF häufig als Rohstoff in Arzneimitteln und gesunden Lebensmitteln verwendet. Es gibt 399 gelistete chinesische Patentarzneimittel, neun importierte Naturkost und 455 inländische Naturkost mit EF als Rohstoff4. Dieses medizinische Material hat große Anwendungsaussichten. In den letzten Jahren gab es jedoch vermehrt Berichte über unerwünschte Reaktionen und Leberschäden beim Menschen, die durch gesunde Lebensmittel und chinesische Patentmedikamente verursacht wurden, die EF als Rohstoff verwenden, und verwandte Toxizitätsstudien 5,6,7 haben berichtet, dass EF als Rohstoff potenzielle Sicherheitsrisiken birgt.

Chinesische medizinische Verarbeitung bezieht sich auf pharmazeutische Techniken, die die Toxizität effektiv reduzieren oder beseitigen und die Sicherheit von TCMs verbessern können. Die traditionelle Verarbeitungsmethode von EF ist das Braten mit Hammelöl, das die Toxizität von EF verringert und seine Wirkung verstärkt, die Nieren zu erwärmen und Yang8 zu fördern. Diese Verarbeitungsmethode ist im chinesischen Arzneibuch und in verschiedenen Verarbeitungsspezifikationenenthalten 1. Das Verfahren von EF ist nur wie folgt spezifiziert: Pro 100 kg EF werden 20 kg Fruchtöl (raffiniert) zugegeben, und es wird mild gebrannt, bis es gleichmäßig und glänzendist 1. In den oben genannten Standards gibt es keine strengen Parameter für die EF-Verarbeitungsmethode, sodass die lokalen Verarbeitungsspezifikationen nicht vereinheitlicht wurden, um Konsistenz zu gewährleisten. Daher wäre es sinnvoll, eine systematische Untersuchung des EF-Prozesses durchzuführen. In dieser Arbeit wurde die experimentelle Box-Behnken-Design-Response-Oberflächenmethode verwendet, um die Verarbeitungstechnologie von EF zu optimieren.

Das Box-Behnken-Versuchsdesign ist eine Methode, die typischerweise zur Optimierung der Faktoren in einem Prozess verwendet wird. Die Extraktionsparameter können optimiert werden, indem die funktionale Beziehung zwischen mehreren Regressionsgleichungsanpassungsfaktoren und Effektwerten hergestellt wird. In jüngster Zeit wurde diese Methode häufig verwendet, um die TCM-Extraktion 5,6,7 und die Verarbeitung von 9,10,11 zu untersuchen. Verschiedene Studien haben über TCM-Zubereitungsmethoden berichtet, die die Salzverarbeitung, die Weinverarbeitung und das Braten nach einem Box-Behnken-Design umfassen, wie z. B. für salzverarbeitete Psoraleae fructus 12, weinverarbeitete Cnidii fructus13 und gerösteten Cinnamomi ramulus14. Diese Methode zeichnet sich durch eine reduzierte Testzeit und eine hohe Testgenauigkeit aus und eignet sich für Multi-Faktor- und Multi-Level-Tests. Das Verfahren ist einfacher als das orthogonale Bemessungsprüfverfahren und umfassender als das einheitliche Bemessungsverfahren15. Die erhaltenen Beziehungen können den vorhergesagten Wert eines beliebigen Testpunktes innerhalb des Testbereichs bestimmen, was ein großer Vorteil ist. Mit einem Zebrafischmodell kann getestet werden, ob EF nach der Verarbeitung weniger toxisch ist.

In TCM-Toxizitätsstudien hat das Zebrafischmodell die doppelten Vorteile des hohen Durchsatzes von Zellexperimenten und der Ähnlichkeit mit Nagetierexperimenten16. Dieses Modell zeichnet sich durch seine geringe Größe, hohe Laichrate, kurzen Fortpflanzungszyklus und einfache Zucht aus. Das Modell kann in groß angelegten synchronen Experimenten in Zellkulturplatten verwendet werden, und die Dosierung des experimentellen Arzneimittels ist gering, der experimentelle Zyklus ist kurz, die Kosten sind niedrig und der gesamte experimentelle Prozess ist einfach zu beobachten und zu bedienen17. Zebrafischembryonen sind durchsichtig und entwickeln sich schnell. Daher können die Toxizität und die teratogene Wirkung von Arzneimitteln auf viszerales Gewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien direkt unter dem Mikroskop beobachtet werden18. Die Genhomologie zwischen Zebrafisch und Mensch liegt bei bis zu 85 %18. Der Signaltransduktionsweg des Zebrafisches ähnelt dem des Menschen18. Die biologische Struktur und die physiologische Funktion von Zebrafischen sind denen von Säugetieren sehr ähnlich18. Daher kann ein Zebrafischmodell für Drogentests Versuchstiere liefern, die zuverlässig und vollständig auf den Menschen anwendbar sind19.

In dieser Studie haben wir die Box-Behnken-Design-Response-Oberflächenmethodik verwendet, um die Menge und Temperatur von Hammelöl und die in der EF-Verarbeitungstechnologie verwendete Frittiertemperatur zu optimieren, wobei die Gehalte an Icariin, Epimedin A, Epimedin B, Epimedin C und Baohuosid I als Bewertungsindizes dienten. Das Zebrafischmodell wurde verwendet, um die Wirkung eines EF-Wasserextrakts auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen vor und nach der Verarbeitung vorläufig zu untersuchen und den Abschwächungseffekt der Verarbeitung auf EF zu bewerten.

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Protocol

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Alle tierbezogenen Versuche wurden mit Genehmigung der Versuchsethikkommission des Chongqing Instituts für TCM durchgeführt (Prüftierethik-Zertifikatsnummer: ZJS2022-03).

1. Bestimmung der bioaktiven Bestandteile

HINWEIS: Bei der in dieser Forschung verwendeten Spezies handelte es sich um Epimedium sagittatum, und die Proben wurden im Landkreis Fengdu, Chongqing, gesammelt. Die Probe wurde als trockener oberirdischer Teil von E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Grundsatz. von Forschern des Instituts für Biologische Medizin, Chongqing Institut für Traditionelle Chinesische Medizin.

  1. Bereiten Sie die Kontrollproduktlösung vor, indem Sie die entsprechende Menge jeder Referenzsubstanz, nämlich Icariin, Epimedin A (EA), Epimedin B (EB), Epimedin C (EC) und Baohuosid I (BI), unter Verwendung einer elektronischen Analysenwaage genau wiegen und in Methanol lösen. Bereiten Sie damit eine gemischte Referenzlösung her, die 381,61 μg/ml Icariin, 124,14 μg/ml EA, 110,24 μg/ml EB, 1091,75 μg/ml EC und 184,98 μg/ml BI enthält.
  2. Bereiten Sie die Testproduktlösung vor, indem Sie EF durch ein Sieb Nr. 3 zerkleinern. Geben Sie ca. 0,2 g (unter Verwendung einer elektronischen Analysenwaage) zerkleinertes EF in einen Erlenmeyerkolben mit Stopfen, fügen Sie 20 ml verdünntes Ethanol hinzu und beschallen Sie dann 1 h lang mit einer Leistung von 400 W und einer Frequenz von 50 kHz. Gut schütteln und durch einen 0,22 μm Membranfilter passieren, um die Testlösung zu erhalten.
  3. Führen Sie die Chromatographie wie folgt durch. Verwenden Sie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer C18-Säule mit Abmessungen von 4,6 mm x 250 mm und einem Innendurchmesser von 5 μm. Verwenden Sie Acetonitril als mobile Phase A und Reinstwasser als mobile Phase B. Verwenden Sie die folgenden Gradientenelutionsparameter: 0-30 min, 24% A bis 26% A; 30-31 min, 26% A bis 45% A; 31-45 min, 45 % A bis 47 % A. Verwenden Sie eine Detektionswellenlänge von 220 nm (für den verwendeten Detektor siehe Materialtabelle). Halten Sie die Säulentemperatur bei 30 °C und die Stromgeschwindigkeit bei 1,0 ml/min und verwenden Sie eine Probengröße von 10 μl.
  4. Um den linearen Zusammenhang zu untersuchen, verwenden Sie die gemischte Referenzlösung wie in Schritt 1.1, die 2-mal, 4-mal, 8-mal, 16-mal und 32-mal verdünnt wurde, für Icariin, EA, EB, EC bzw. BI. Verwenden Sie Acetonitril als mobile Phase A und Reinstwasser als mobile Phase B.
  5. Verwenden Sie die folgenden Gradientenelutionsparameter: 0-30 min, 24 % A bis 26 % A; 30-31 min, 26% A bis 45% A; 31-45 min, 45 % A bis 47 % A. Verwenden Sie eine Detektionswellenlänge von 220 nm (für den verwendeten Detektor siehe Materialtabelle). Halten Sie die Säulentemperatur bei 30 °C und die Stromgeschwindigkeit bei 1,0 ml/min und verwenden Sie eine Probengröße von 10 μl. Notieren Sie schließlich die Spitzenbereiche. Zeichnen Sie die lineare Regression mit der Referenzkonzentration (x-Achse, μg/ml) als Abszisse und der Peakfläche (y-Achse) als Ordinate mit professioneller Software auf (siehe Materialtabelle).
  6. Führen Sie den Präzisionstest durch, indem Sie die gemischte Kontrolllösung sechs Mal hintereinander mittels HPLC unter Verwendung der in Schritt 1.3 gezeigten chromatographischen Bedingungen messen. Zeichnen Sie die Detektionszeit und die Peakbereiche jeder chemischen Zusammensetzung auf und berechnen Sie die relativen Standardabweichungen (RSD) der Peakbereiche, um die Präzision (Reproduzierbarkeit) mit der folgenden Formel zu bewerten:
    RSD% = Standardabweichung (SD)/arithmetisches Mittel der berechneten Ergebnisse (X) x 100 %
  7. Um die Reproduzierbarkeitsprüfung durchzuführen, wiegen Sie das EF-Pulver genau und bereiten Sie sechs Teile der Testproduktlösung parallel gemäß der Methode in Schritt 1.2 vor. Die hergestellten Lösungen werden unter den in Schritt 1.3 dargestellten chromatographischen Bedingungen einer HPLC unterzogen. Zeichnen Sie die Retentionszeiten und Peakflächen jeder chemischen Zusammensetzung auf und berechnen Sie die Mengen jeder Verbindung anhand einer Standardkurve (Peakflächen im Vergleich zu Konzentrationen). Berechnen Sie den RSD-Prozentsatz wie oben.
  8. Um den Stabilitätstest durchzuführen, lagern Sie die Testlösungen bei Raumtemperatur und messen Sie ihren Inhalt mit der in Schritt 1.3 beschriebenen HPLC-Methode um 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h und 24 h nach der Vorbereitung, um die Stabilität zu beurteilen. Zeichnen Sie die Retentionszeiten und Peakbereiche jeder chemischen Zusammensetzung auf und berechnen Sie den RSD-Prozentsatz der Peakflächen wie oben.
  9. Zur Durchführung des Probenrückgewinnungstests werden 0,2 g EF-Pulver für sechs Wiederholungen in einen Erlenmeyerkolben mit Stopfen gewogen. Fügen Sie eine geeignete Menge der Referenzlösung hinzu (die der Probe zugesetzte Menge der Referenzsubstanz entspricht 100 % des bekannten Gehalts der Probe) und bereiten Sie die Prüflösung nach dem in Schritt 1.2 beschriebenen Verfahren vor.
  10. Injizieren Sie die Proben in den Chromatographen und analysieren Sie sie gemäß den chromatographischen Bedingungen in Schritt 1.3. Zeichnen Sie die Spitzenbereiche auf und berechnen Sie die durchschnittlichen Erholungs- und RSD%-Werte wie folgt:
    Ausbeuterate mit Spitzen = (Probeninhalt mit Spitzen − Probeninhalt)/Probenmenge x 100 %

2. Optimierung der EF-Hammelöl-Aufbereitungstechnologie unter Verwendung der Box-Behnken-Design-Response-Oberflächenmethodik

  1. Wählen Sie die wichtigsten Parameter in der EF-Verarbeitung, wie z. B. die Menge an Hammelöl (A; 15%-35%), die Hammelöltemperatur (B; 50-120 °C) und die Frittiertemperatur (C; 80-300 °C), als Einflussfaktoren aus. Verwenden Sie die umfassenden Bewertungen von Icariin-, EA-, EB-, EC- und BI-Inhalten als Bewertungsindizes. Der prozentuale Anteil an Hammelöl ist hier der Massenprozentsatz.
  2. Verwenden Sie die Software zur Analyse der Antwortfläche (siehe Materialtabelle), um die Box-Behnken-Experimente zur Antwortfläche zu entwerfen, die quadratische Antwortfläche zu untersuchen und ein Polynommodell zweiter Ordnung zu konstruieren. Wählen Sie den neuen Box-Behnken-Versuchsplan aus, und legen Sie die Option Numerische Faktoren auf 3 fest. Legen Sie die Faktoren A, B und C fest. Klicken Sie auf Weiter. Legen Sie die Option "Antworten" auf 1 fest (was der umfassenden Punktzahl entspricht). Klicken Sie auf Weiter , um das Design abzuschließen. Insgesamt waren 17 Experimente geplant (siehe Tabelle 1).
    HINWEIS: Informationen zu den unabhängigen und abhängigen Variablen sowie zu ihren niedrigen, mittleren und hohen Stufen finden Sie in Tabelle 2.
  3. Verarbeiten Sie die EF gemäß den spezifischen Parametern in Tabelle 1. Wiegen Sie beispielsweise für die Bestellnummer 1 raffiniertes Hammelöl mit 15 % V/V und erhitzen Sie es dann auf 50 °C, um es zu schmelzen. Das rohe EF zum geschmolzenen Hammelfleisch geben, bei schwachem Feuer (190 °C) unter Rühren braten, bis es gleichmäßig glänzt, dann herausnehmen und abkühlen lassen. Durchführung von 17 experimentellen Operationen. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 17 Gruppen von EF-verarbeiteten Produkten erhalten.
    HINWEIS: Hammelöl ist bei Raumtemperatur (25 °C) fest und schmilzt beim Erhitzen zu Flüssigkeit. Als Hilfsstoff kann Hammelöl in flüssigem Zustand verwendet werden.
  4. Bereiten Sie die Testlösungen der verarbeiteten Produkte nach der in Schritt 1.2 beschriebenen Methode vor. Anschließend werden sie mit HPLC gemäß den in Schritt 1.3 beschriebenen chromatographischen Bedingungen analysiert. Zeichnen Sie die Verweilzeiten und Peakbereiche jeder chemischen Zusammensetzung auf und berechnen Sie den Gehalt an Icariin, EA, EB, EC und BI in jeder Testlösung anhand einer externen Standardkurve. Verwenden Sie die folgende Formel zur Berechnung der Gesamtpunktzahl, um die Gesamtpunktzahl der 17 Versuchsgruppen zu berechnen:
    Gesamtpunktzahl = Z/Z max × 0,5 + BI/BImax × 0,5
    wobei Z die Summe der Icariin-, EA-, EB- und EC-Gehalte ist; Zmax ist der Maximalwert der Summe der Icariin-, EA-, EB- und EC-Gehalte in den 17 Versuchsgruppen; BI ist der BI-Inhalt; und BImax ist der Maximalwert des BI-Inhalts in den 17 Versuchsgruppen.
  5. Importieren Sie die umfassenden Auswertungsergebnisse für die 17 Versuchsgruppen in die Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle), um die experimentellen Daten zu analysieren. Wählen Sie unter den Auswertungselementen die Option "Quadratische Prozessreihenfolge" und die Option "Polynommodelltyp" aus.

3. Prüfung der Wirkung der Verarbeitung auf die Embryonalentwicklung von Zebrafischen

  1. Probenvorbereitung
    1. Zerkleinern Sie das Rohöl und die verarbeitete EF durch ein Sieb Nr. 3 (siehe Materialtabelle). Zu 100 g jeder EF-Probe werden 1.000 ml Reinstwasser hinzugefügt. Weichen Sie das EF 0,5 h lang ein, kochen Sie das Wasser zweimal für jeweils 30 Minuten und filtern Sie es dann mit Filterpapier.
    2. Kombinieren Sie die Filtrate und konzentrieren Sie die Probe durch Erhitzen. Fügen Sie Reinstwasser zu einem Endvolumen von 100 ml hinzu, um die verarbeiteten EF (PEF, 1 g/ml) und die rohen EF (CEF, 1 g/ml) Stammlösungen zu erhalten. Messen Sie die Menge des Roharzneimittels in jeder Stammlösung.
    3. Aliquote von 1 ml, 1,5 ml, 2,5 ml, 5 ml und 7,5 ml Stammlösungen in 10-ml-Messkolben geben und dann Reinstwasser in das Volumen geben, um die Testlösungen mit Konzentrationen von 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 500 mg/ml und 750 mg/ml für die Zebrafisch-Embryotoxizitätsstudie herzustellen.
      ANMERKUNG: Die Konzentrationen der Testlösungen wurden unter Bezugnahme auf die einschlägige Literatur 20,21 und durch Durchführung von Vorversuchen hergestellt, um den in der normalen Toxikologie verwendeten10-fachen Konzentrationsgradienten zu erhalten. CEF war eine unverarbeitete Probe, und PEF war eine Probe, die mit der besten in Abschnitt 2 beschriebenen Verarbeitungstechnologie hergestellt wurde.
  2. Zebrafischhaltung und Embryonenbehandlung21
    1. Wildtyp-Zebrafische (siehe Materialtabelle) 2 Tage lang bei kontrollierter Temperatur anpassen, in einem Durchflussaquarium bei pH 7,0-7,4 halten und zweimal täglich füttern.
      HINWEIS: Die Hemmung der Melaninbildung bei Zebrafischen wurde durch die Zugabe von 1-Phenyl-2-thioharnstoff in einer Konzentration von 0,003 % (Masse/Volumen) zum Nährmedium erreicht, wodurch ihr Körper für die morphologische Beobachtung transparent blieb.
    2. Wählen Sie abends erwachsene fruchtbare Wildtyp-Zebrafische aus und trennen Sie sie mit Hilfe von Leitblechen in Paarungskästen. Entfernen Sie die Leitbleche am nächsten Morgen und lassen Sie die Fische 30 Minuten lang laichen. Sammeln Sie die befruchteten Eier alle 15 Minuten mit einer Pipette. Insgesamt wurden 520 gesunde Wildtyp-Embryonen gesammelt. Bewahren Sie die Zebrafischembryonen 24 h lang in einem Inkubator bei 28,5 °C auf.
    3. Ordnen Sie die gesunden Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) nach dem Zufallsprinzip 13 Gruppen zu und weichen Sie zusammen mit einer Kontrollgruppe separat 10 ml jeder der folgenden Lösungen in einer Kulturschale ein: PEF: 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml; CEF: 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml . Behandeln Sie die leere Kontrollgruppe mit dem Medium als Lösung. Jede Gruppe enthielt 40 Embryonen in dieser Studie.
      HINWEIS: Die mittlere Zusammensetzung beträgt 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,45 mMKH2PO4, 1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4 und 4 mM NaHCO3.
    4. Züchten Sie den Zebrafisch in einem Inkubator mit konstanter Temperatur für bis zu 120 hpf. Zählen Sie täglich die Anzahl der toten Larven, beobachten Sie die Hauptorganmorphologie der Larven in jeder Versuchsgruppe unter einem Stereomikroskop (Maßstabsbalken = 500 μm, siehe Materialtabelle) und berechnen Sie die Halbtodkonzentration (LC50) von Zebrafischen bei 72 hpf mit Hilfe einer Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle).

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Results

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Methodische Untersuchungsergebnisse
Es wurde ein linearer Zusammenhang zwischen der Konzentration von Icariin, EA, EB, EC, BI und chromatographischen Peakbereichen beobachtet (siehe Tabelle 3). Die RSD%-Werte (n = 6) der chromatographischen Peakbereiche von Icariin, EA, EB, EC und BI betrugen 0,28 %, 1,22 %, 0,65 %, 1,67 % bzw. 1,06 %, was darauf hindeutet, dass die Präzision der HPLC-Messungen gut war. Die RSD%-Werte (n = 6) der Gehalte an Icariin, EA, EB, EC und BI betrugen 1,59 %, ...

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Discussion

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Unabhängige Variablen und die Bestimmung ihrer Niveaus
Die EF-Verarbeitungstechnologie wird nur in der Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs und in den lokalen Verarbeitungsspezifikationen für chinesische Arzneimittel beschrieben, die von 26 Provinzen, Gemeinden und autonomen Regionen im ganzen Land veröffentlicht wurden1. Die Beschreibung umfasst die folgenden Schritte: Hammelöl nehmen und zum Schmelzen erhitzen, EF-Schnitzel hinzufügen, mit langsamem Feuer unter Rühren br...

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wird unterstützt durch das Basic Scientific Research Business Project der Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (Projektnummer: jbky20200013), das Performance Incentive Guidance Project der Chongqing Scientific Research Institutions (Projektnummer: cstc2021jxjl 130025) und das Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Medica Processing.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrilFisher197164
Baohuosid figure-materials-1 (Bfigure-materials-2 ) Verifizierter Lieferant - Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20042402
Chromatographische SäuleWaters CorporationSymmetry C18
Design ExpertensoftwareStat-Ease Inc., Minneapolis, MNTestversion8.0.6.1
DetektorWaters Corporation2998
DesintegratorHefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.S-FS553
Elektronische AnalysenwaageMettler-Toledo International Inc.
Epimedin A (EA)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-21112118
Epimedin B (EB)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080403
Epimedin C (EC)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080310
EthanolChongqing Chuandong Chemical (Gruppe) Co., Ltd.
Graphpad SoftwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA6.02
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)Waters Corporation2695
IcariinChengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.
MethanolChongqing Chuandong Chemical (Gruppe) Co., Ltd.
Mikroporöse MembranTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.0,22 μm m
HammelölKuoshan Zhiniu Fresh Food Store20211106
Office Excel BürosoftwareMicrosoftOffice Excel 2021
ArzneibuchSieb Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.R40/3
ReinwassermaschineChongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.AT Sro 10A
Qualitatives FilterpapierShanghai Leigu Instrument Co., Ltd.18cm
StereomikroskopCarl Zeiss, Oberkochen, DeutschlandStemi 2000
UltraschallreinigerBranson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.BUG25-12
ZebrafishChina Zebrafish Resource Center (CZRC)Der AB-Stamm
MS205DU201808012109140120171101

References

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