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Methodenartikel

Schutz von H9c2-Myokardzellen vor oxidativem Stress durch Crocetin über den PINK1/Parkin-Signalweg vermittelte Mitophagie

2.2K Aufrufe

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DOI:

10.3791/65105

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26. Mai 2023

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1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Basierend auf in vitro Experimenten enthüllte diese Studie den Mechanismus von Crocetin bei der Reparatur von oxidativen Stressschäden von Kardiomyozyten durch Beeinflussung der Mitophagie, bei der der PINK1/Parkin-Signalweg eine wichtige Rolle spielt.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, die oxidative stressschützende Wirkung von Crocetin auf H2O2-vermittelte H9c2-Myokardzellen durch in vitro Experimente zu untersuchen und weiter zu untersuchen, ob sein Mechanismus mit dem Einfluss der Mitophagie zusammenhängt. Diese Studie zielte auch darauf ab, die therapeutische Wirkung von Distelsäure auf oxidativen Stress in Kardiomyozyten zu demonstrieren und zu untersuchen, ob ihr Mechanismus mit der Wirkung der Mitophagie zusammenhängt. In dieser Arbeit wurde ein H2O2-basiertes Modell für oxidativen Stress konstruiert und der Grad der oxidativen Stressschädigung von Kardiomyozyten durch Detektion der Konzentrationen von Laktatdehydrogenase (LDH), Kreatinkinase (CK), Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT) und Glutathionperoxidase (GSH Px) bewertet. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-detektierende Fluoreszenzfarbstoffe DCFH-DA, JC-1 und TUNEL-Farbstoffe wurden verwendet, um mitochondriale Schäden und Apoptose zu beurteilen. Der autophagische Fluss wurde durch Transfizierung des Ad-mCherry-GFP-LC3B-Adenovirus gemessen. Mitophagie-verwandte Proteine wurden dann mittels Western Blot und Immunfluoreszenz nachgewiesen. Crocetin (0,1-10 μM) könnte jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen signifikant verbessern und die Apoptose und die durchH2O2verursachten Schäden durch oxidativen Stress reduzieren. In Zellen mit übermäßiger autophagischer Aktivierung könnte Crocetin auch den Autophagiefluss und die Expression der Mitophagie-verwandten Proteine PINK1 und Parkin reduzieren und den Transfer von Parkin in die Mitochondrien umkehren. Crocetin konnte H2O2-vermittelte oxidative Stressschäden und die Apoptose von H9c2-Zellen reduzieren, und sein Mechanismus war eng mit der Mitophagie verbunden.

Einleitung

Der akute Myokardinfarkt (AMI) ist eine lebensbedrohliche Myokardnekrose, die durch eine schwere und anhaltende Ischämie und Hypoxie der Koronararterien verursacht wird 1,2. Die perkutane Koronarintervention (PCI) ist eine der ersten Therapiestrategien bei AMI und schützt die Kardiomyozyten in der Regel vor ischämischen Schäden 3,4. Dem distalen Myokard fehlt es an Blut- und Sauerstoffversorgung, wenn es nicht umgehend und effektiv nach AMI behandelt wird, was zu ischämischen Nekrosen und weiteren kardiovaskulären Komplikationen führt 5,6. Die Förderung der Erholung von Kardiomyozyten und die Minimierung irreversibler Myokardschäden nach verpasster PCI-Chirurgie war ein Forschungsschwerpunkt. Nach AMI befinden sich die Kardiomyozyten in einem Zustand der Ischämie und Hypoxie, was zu einer Hemmung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung, einer Reduktion von NAD+ zu NADPH und einer verstärkten Einzelelektronenreduktion führt7. Infolgedessen erzeugt die unvollständige Reduktionsreaktion von Sauerstoff einen Überschuss an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und führt schließlich zu einer Schädigung der Kardiomyozyten durch oxidativen Stress8. Eine übermäßige Anhäufung von ROS löst eine Lipidperoxidation aus, die die Struktur und Funktion der mitochondrialen Membranen weiter stört. Das Ergebnis ist eine kontinuierliche Öffnung der Übergangsporen der mitochondrialen Permeabilität und eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials, was Apoptose und Nekrose induziert.

ACE-Hemmer (Angiotensin-Converting-Enzyme), Angiotensin-Rezeptor-Blocker (ARBs), die Inhibitoren von β-Adrenozeptoren, Aldosteron-Antagonisten und andere Standardmedikamente bei AMI können dazu beitragen, die Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt zu verbessern und das Auftreten bösartiger Ereignisse wie Arrhythmien und linksventrikuläres Remodeling zu verhindern9. Das Überleben und die Prognose nach einem Infarkt werden jedoch stark von der Infarktgröße beeinflusst, und es wurden keine zufriedenstellenden Ergebnisse zur Verringerung der Apoptose von Kardiomyozyten erzielt10,11. Daher ist die Entwicklung von Medikamenten zur Förderung der Erholung von Kardiomyozyten nach einem Myokardinfarkt zu einem dringenden Thema geworden.

Die traditionelle Medizin ist seit vielen Jahren eine Inspirationsquelle für die moderne pharmazeutische Forschung12,13,14,15. Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat eine lange Geschichte in der Behandlung von AMI, und eine Reihe von randomisierten kontrollierten Studien in den letzten Jahren hat bestätigt, dass TCM tatsächlich die Prognose von Patienten verbessern kann16,17. Nach der TCM-Theorie wird AMI durch Blutstauungverursacht 18,19, daher werden zur Behandlung von AMI in der akuten Phase20 in der Regel durchblutungsfördernde Medikamente eingesetzt. Unter ihnen wird angenommen, dass Safran eine starke Wirkung auf die Blutaktivierung und -stase hat und häufig bei der Akutbehandlung von AMI eingesetzt wird. Crocetin, ein Hauptbestandteil von Safran, könnte eine Schlüsselrolle beim Schutz von Kardiomyozyten spielen21.

In dieser Studie wurden H9c2-Myokardzellen durchH2O2induziert, um eine myokardiale Ischämie/Reperfusion zu simulieren, die eine Kardiomyozytenschädigung der AMI verursacht, und Crocetin wurde als Intervention verwendet, um seine schützende Wirkung gegen oxidativen Stress induzierte Myokardschädigung zu untersuchen. Der Mechanismus, den Crocetin vor Kardiomyozyten schützt, wurde durch Mitophagie weiter erforscht. Noch wichtiger ist, dass dieser Artikel eine Referenz für den technischen Ansatz zur Untersuchung der Mitophagie bietet und den gesamten experimentellen Ablauf im Detail beschreibt.

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Protokoll

Die Experimente wurden im Labor für Physiologie der Pekinger Universität für Chinesische Medizin, China, durchgeführt. Alle Studienmethoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Universität Peking durchgeführt.

1. Zellkultur

  1. Fügen Sie 10 % fötales Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin dem modifizierten Basismedium Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco (mit 4,5 g/l D-Glucose, 4 g/l L-Glutamin und 110 mg/l Natriumpyruvat; siehe Materialtabelle) hinzu, um ein DMEM-Komplettmedium herzustellen.
  2. Tauen Sie die mit flüssigem Stickstoff gefrorenen H9c2-Myokardzellen (siehe Materialtabelle) in warmem Wasser bei 37 °C unter schnellem und gleichmäßigem Rühren auf, bis das Eis schmilzt.
  3. Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und fügen Sie das vierfache Volumen des DMEM-Komplettmediums hinzu. Bei 358 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
  4. Verdünnen Sie die erhaltene Zellsuspension mit Nährmedium, blasen Sie vorsichtig und beimpfen Sie die Zellen in einem Kulturkolben. Kultivierung im Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.

2. Bestimmung der Zellviabilität

  1. Crocetin (siehe Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid (DMSO) in Konzentrationen von 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM und 200 mM lösen.
  2. Dissoziieren Sie die H9c2-Myokardzellen mit Trypsin und neutralisieren Sie dann das Gemisch mit DMEM-Komplettmedium.
  3. Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 179 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und mischen Sie die Zellen durch leichtes Blasen in DMEM-Komplettmedium.
  4. Zählen Sie die Zellen mit einer Blutzellzählplatte22 (siehe Materialtabelle) und verdünnen Sie sie auf 5 × 104 Zellen/ml mit DMEM-Vollmedium.
  5. Teilen Sie die Zellen in neun gleiche Portionen. Fügen Sie der Kontrollgruppe DMSO (verdünnt im Verhältnis 1:1.000 mit DMEM-Komplettmedium) hinzu und fügen Sie den übrigen Gruppen verschiedene Konzentrationen von Crocetin im Verhältnis 1:1.000 hinzu.
  6. Säen Sie die Zellen in 96-Well-Platten mit 100 μl pro Well. Verwerfen Sie den Überstand nach einer Inkubationszeit von 24 h und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
  7. Nach Zugabe von 100 μl DMEM-Basalmedium werden die Zellen 4 h lang inkubiert und 20 μl MTS zugegeben (siehe Materialtabelle).
  8. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 2 Stunden, messen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 490 nm und berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen.
    HINWEIS: Zellviabilität = (OD behandelt - OD blank) / (OD control - OD blank) × 100.

3. Bestimmung von Laktatdehydrogenase (LDH), Kreatinkinase (CK), Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD), Glutathionperoxidase (GSH Px) und Katalase (CAT)

  1. Die H9c2-Zellen werden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen ausgesät. Sammeln Sie den Überstand nach dem Eingriff und ermitteln Sie die LDH- und SOD-Werte gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  2. Sammeln Sie den Überstand und waschen Sie ihn einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie das Zelllysat in die Kulturschale und lassen Sie es 20 Minuten auf Eis ruhen. Sammeln Sie die Flüssigkeit aus der Kulturschale in ein Zentrifugenröhrchen.
  3. CK-, MDA-, GSH-Px- und CAT-Werte gemäß den Anweisungen des Herstellerserkennen 23 (siehe Materialverzeichnis und Zusatzdatei 1).
  4. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration der Lyse mit der Bicinchoninsäure (BCA)-Methode, um die Konzentration von CK, MDA, GSH-Px und CAT24 zu korrigieren (siehe Materialtabelle).

4. Bestimmung der ROS

  1. Säen Sie die H9c2-Zellen in einer 48-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 103 Zellen. DCFH-DA (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1.000 mit dem serumfreien Medium verdünnen. Entsorgen Sie den Zellüberstand und waschen Sie die Zelle zweimal mit einem serumfreien Medium.
  2. In jede Vertiefung werden 150 μl verdünntes DCFH-DA gegeben und 20 min bei 37 °C inkubiert. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem serumfreien Medium und nehmen Sie die Bilder unter einem Fluoreszenzmikroskop auf (siehe Materialtabelle).

5. Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials

  1. Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials mit einem JC-1 mitochondrialen Membranpotential-Assay-Kit25 (siehe Materialtabelle). Entsorgen Sie das Nährmedium und waschen Sie sie einmal mit serumfreiem Medium.
  2. Geben Sie JC-1 Arbeitslösung in jedes Röhrchen und mischen Sie sie gut. 20 min bei 37 °C inkubieren und die Zellen zweimal mit JC-1 Färbepuffer waschen. Fügen Sie jedem Well ein komplettes Medium hinzu und nehmen Sie Fotos unter einem Fluoreszenzmikroskop auf.

6. TUNEL-Färbetest

  1. Verwenden Sie ein TUNEL-Apoptose-Assay-Kit (siehe Materialtabelle), um die Apoptoseratenzu bestimmen 26. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet einmal mit serumfreiem Medium.
  2. Fügen Sie Zellfixierlösung hinzu und waschen Sie sie einmal mit PBS, nachdem sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden.
  3. 0,3 % Triton-100 in jede Vertiefung geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. TUNEL-Detektionsarbeitslösung zugeben und bei 37 °C im Dunkeln 60 min inkubieren.
  4. Fügen Sie eine Anti-Fluoreszenz-Löschversiegelungstablette hinzu, die 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; siehe Materialtabelle) enthält, und nehmen Sie Fotos unter einem Fluoreszenzmikroskop auf.

7. Überwachung des autophagischen Flusses durch Transfektion des Adenovirus mCherry GFP-LC3B

  1. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums in jeder Vertiefung durch frisches Medium. Ad-mCherry GFP-LC3B Adenovirus (Multiplizität der Infektion [MOI] von 2) in das Nährmedium geben und 5 μg/ml Polybren (siehe Materialtabelle) zugeben, um die Infektionseffizienz zu verbessern.
  2. Ersetzen Sie das frische Medium nach 24 h und beobachten Sie die Expression des fluoreszierenden Proteins unter einem konfokalen Mikroskop.
  3. Kultur der Zellen unter den gleichen Bedingungen wie in Abschnitt 1 nach Bestätigung der erfolgreichen Virusinfektion und Aufnahme von Bildern unter dem konfokalen Mikroskop27.
    HINWEIS: Mehr als 20 % der Zellen zeigten eine Fluoreszenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), was auf eine erfolgreiche Infektion hinweist.

8. Western-Blot-Analyse

  1. Sammeln Sie Zellen für die Extraktion des gesamten Proteins und lysieren Sie sie (RIPA, Proteasehemmer und Phosphatase-Inhibitor = 100:1:1; siehe Materialtabelle) 30 Minuten lang auf Eis.
  2. Fügen Sie der Proteinprobe nach der Proteinquantifizierung 5x Proteinbeladungspuffer hinzu und kochen Sie die Proben 10 Minuten lang.
  3. Elektrophoresieren Sie die Proben, die gleiche Mengen an Protein enthalten, mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gelelektrophoresegelen (SDS-PAGE)28. Anschließend werden die Proben auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen übertragen.
  4. Die PVDF-Membranen werden für 1 h mit 5%igem Magermilchpulver blockiert und mit dem Primärantikörper (PINK1, Parkin; siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht und dem Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert.
  5. Erkennen Sie die Zielbanden mit der verbesserten Chemilumineszenzlösung (ECL) und dem Chemilumineszenz-Detektionssystem. Verwenden Sie die Software Image J, um die Banden über die Densitometrie28 zu quantifizieren.

9. Nachweis der mitochondrialen Translokation von Parkin durch Immunfluoreszenz

  1. Beobachten Sie die Kolokalisation von Parkin mit Mitochondrien durch doppelte Immunfluoreszenzfärbung. Entsorgen Sie den Zellüberstand aus jeder Gruppe und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
  2. Fixieren Sie die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd und fügen Sie 0,1% Triton-100 in PBS hinzu.
  3. Blockieren Sie mit tierversuchsfreier Blocklösung (siehe Materialtabelle) für 1 h, um eine unspezifische Bindung zwischen Proteinen und Antikörpern zu verhindern und den Fluoreszenzhintergrund zu reduzieren.
  4. Mit einem Primärantikörper (Parkin und Tom20; siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht inkubieren.
  5. Einen fluoreszierenden Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) zugeben und 1 h im Dunkeln inkubieren.
  6. Fügen Sie die DAPI-haltigen Anti-Fluoreszenz-Löschtabletten hinzu und nehmen Sie Bilder unter dem konfokalen Mikroskop auf.

10. Statistische Analyse

  1. Führen Sie statistische Analysen mit Hilfe von Grafik- und Analysesoftware durch (siehe Materialtabelle).
  2. Vergleichen Sie kontinuierliche Variablen zwischen Gruppen mithilfe der einfaktoriellen ANOVA. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

Auswirkungen von Crocetin auf die Lebensfähigkeit der Zellen
Crocetin in 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM und 100 μM hatte eine signifikante proliferative Wirkung auf die Zellen, während Crocetin in Konzentrationen über 200 μM die Proliferation von H9c2-Zellen signifikant hemmte (Abbildung 1A). Nach 4 h Behandlung mit 400 μMH2O2war die Zellviabilität deutlich reduziert, und Crocetin konnte diese Veränderung bis zu einem gewissen Grad rückgängig machen (...

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Diskussion

Die Erforschung wirksamer Inhaltsstoffe aus komplexen Verbindungen natürlicher Arzneimittel durch fortschrittliche Technologie ist ein Hotspot der TCM-Forschung29 und kann nach der Verifizierung Laborbeweise für die zukünftige Arzneimittelentwicklung liefern. Distel ist ein repräsentatives Medikament bei der Behandlung von "Förderung der Durchblutung und Minimierung von Blutstau" und wird häufig bei der Behandlung von Myokardinfarkt eingesetzt30,31

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Beijing Natural Science Foundation (Nr. 7202119) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82274380) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % TrypsinGibco2323363
1 % Penicillin-StreptomycinSigmaV900929
5x Protein-Loading-PufferBeijing Pulilai Gene TechnologyB1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B AdenovirusBeyotimeC3011
Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Verifizierter Lieferant - Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0514
Alexa Fluor 594-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0513
Tierversuchsfreie BlockierungslösungCST15019s
Anti-Parkin-AntikörperSanta Cruzsc-32282
Anti-PINK1-AntikörperABklonalA11435
Anti-TOM20-AntikörperABklonalA19403
Anti-β-Aktin  AntikörperABklonalAC026
BCA-Protein-Assay-KitKeyGEN BiotechKGP902
BlutzählplatteServicebioWG607
CAT-Assay-KitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Chemilumineszenz-DetektionssystemShanghai Qinxiang Scientific Instrument FactoryChemiScope 6100
CK Assay-KitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA032-1-1
Coenzym Q10 (CoQ 10)MacklinC6129
CrocetinChengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.RFS-Z01802006012
DAPI-haltige Antifluoreszenz-QuenchtablettenZhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9557
DCFH-DABeyotimeS0033S
DMSOSolarbioD8371
Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)Gibco8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) LösungNCM BiotechP10100
Fötales Rinderserum (FBS)Corning-Cellgro35-081-CV
GraphPad Prism 7.0 https://www.graphpad.com/
GSH-Px Assay-KitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA005-1-2
H9c2 MyokardzellenBeijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.CS0062
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Ziegen-Anti-IgG (H+L)Verifizierter Lieferant - Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZB-2305
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Anti-Maus-IgG (H+L)Verifizierter Lieferant - Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZB-2301
JC-1 Assay-Kit für mitochondriale MembranpotenzialLABLEADJ22202
LDH-Assay-KitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA020-2-2
MDA-Assay-KitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-2-2
MethanolAladdinA2114057 MTS-Assay
PromegaG3581
PerhydrolG-KlonCS7730
Phosphatase-InhibitorCWBIOCW2383
PolybrenBeyotimeC0351
Polyvinylidendifluorid (PVDF)-MembranenMilliporeISEQ00010
Radioimmunpräzipitation Assay (RIPA) LysepufferSolarbioR0010
SDS-PAGE GeleShanghai Epizyme Biomedical TechnologyPG112
SDS-PAGE LaufpufferpulverServicebioG2018-1L
SDS-PAGE Transfer PufferPulver ServicebioG2017-1L
SOD-Assay-KitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-2-2
Tris-gepuffertes KochsalzpulverServicebioG0001-2L
Triton X-100SigmaSLCC9172
TUNEL Apoptose-Assay-KitBeyotimeC1086
Tween-20SolarbioT8220

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