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Summary

Die Triglycerid-Lipolyse in Adipozyten ist ein wichtiger Stoffwechselprozess, der zur Freisetzung von freien Fettsäuren und Glycerin führt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der basalen und stimulierten Lipolyse in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen zur Verfügung.

Abstract

Adipozyten speichern Energie in Form von Triglyceriden in Lipidtröpfchen. Diese Energie kann über die Lipolyse mobilisiert werden, bei der die Fettsäureseitenketten nacheinander vom Glycerinrückgrat abgespalten werden, was zur Freisetzung freier Fettsäuren und Glycerin führt. Aufgrund der geringen Expression der Glycerinkinase in weißen Adipozyten sind die Wiederaufnahmeraten von Glycerin vernachlässigbar, während die Wiederaufnahme von Fettsäuren durch die Fettsäurebindungskapazität von Medienkomponenten wie Albumin bestimmt wird. Sowohl die Freisetzung von Glycerin als auch von Fettsäuren in Medien kann durch kolorimetrische Assays quantifiziert werden, um die lipolytische Rate zu bestimmen. Durch die Messung dieser Faktoren zu mehreren Zeitpunkten kann man die lineare Lipolyserate mit hoher Sicherheit bestimmen. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Messung der Lipolyse in in vitro differenzierten Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen zur Verfügung. Dieses Protokoll kann auch für andere Präadipozyten-Zelllinien oder Fettgewebe aus anderen Organismen optimiert werden. Überlegungen und Optimierungsparameter werden diskutiert. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Rate der Adipozyten-Lipolyse zwischen Mausmodellen und Behandlungen zu bestimmen und zu vergleichen.

Introduction

Überschüssige Nährstoffe werden im weißen Fettgewebe in Form von Triglyceriden im neutralen Lipidkern der Lipidtröpfchen gespeichert. Triglyceridspeicher werden über Lipolyse mobilisiert, ein Prozess, bei dem die Fettsäureseitenketten nacheinander durch Fettgewebe-Triglyceridlipase (ATGL), hormonsensitive Lipase (HSL) und Monoglyceridlipase (MGL) gespalten werden, was zur Freisetzung freier Fettsäuren (FFAs) und des Glycerinrückgrats^{führt 1,2}. Die Lipolyse wird durch Katecholamin-Signalübertragung im Fettgewebe aktiviert. Sympathische Nervenendigungen setzen lokal Katecholamine frei, die an β-adrenerge Rezeptoren auf der Plasmamembran der Adipozyten binden. Nach der Ligandenbindung aktivieren diese G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) die Adenylylcyclase über G_αs. Die anschließende Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) durch cAMP führt zu einer Hochregulation sowohl von ATGL als auch von HSL. Die Phosphorylierung von Perilipin-1 durch PKA bewirkt die Dissoziation von ABHD5 (auch bekannt als CGI-58), das ATGL³ bindet und koaktiviert. PKA phosphoryliert HSL direkt und fördert seine Translokation vom Zytosol zum Lipidtröpfchen, wo die Interaktion mit phosphoryliertem Perilipin-1 die Lipaseaktivität weiter fördert 4,5,6,7. Die dritte Lipase, die an der Lipolyse beteiligt ist, MGL, scheint nicht durch den Katecholamin-Signalweg reguliert^{zu werden 8}. Wichtig ist, dass die Triglyceridsynthese in Adipozyten durch den Glycerinlipidsyntheseweg vermittelt wird, bei dem keine Monoglyceride als Zwischenprodukt gebildet werden. Stattdessen katalysieren Glycerin-3-phosphat-Acyltransferasen die Bildung von Lysophosphatidsäure, die mit einem anderen Fettacyl-CoA zu Phosphatidsäure kombiniert und dann vor der endgültigen Synthese von Triglyceriden zu Diglyceriden isomerisiert wird (Abbildung 1)9,10,11.

Abbildung 1: Lipolyse- und Glycerinlipidsynthesewege. Oben: Lipolytischer Weg; Rot dargestellte Enzyme: Fettgewebe-Triglyceridlipase (ATGL), hormonsensitive Lipase (HSL) und Monoglyceridlipase (MGL). Unten: Glycerin-Lipid-Syntheseweg; Grün dargestellte Enzyme: Diglycerid-Acyltransferase (DGAT), Phosphatidsäure-Phosphatase (PAP), Lysophosphatidsäure-Acyltransferase (LPAT, auch bekannt als LPAATs) und Glycerin-3-Phosphat-Acyltransferase (GPAT). Lipide: Triglyceride (TG), Diglyceride (DG), Monoglyceride (MG), freie Fettsäuren (FFA), Fettacyl-CoA (FA-CoA), Lysophosphatidsäure (LPA) und Phosphatidsäure (PA). Weitere Metaboliten: anorganisches Phosphat (Pi) und Glycerin-3-phosphat (G3P). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Extrazelluläres Adenosin ist ein weiterer wichtiger Regulator der Lipolyse, der durch G_s– und G_i-gekoppelte GPCRs die Aktivität der Adenylcyclase beeinflusst. Der in Adipozyten vorherrschende Adenosinrezeptor ADORA1 hemmt die Adenylylcyclase und damit die Lipolyse durch die Aktivierung von G_i¹². ADORA2A wird in niedrigeren Konzentrationen und vor allem in braunen Adipozyten exprimiert und aktiviert die Lipolyse über den G_s-Signalweg ¹³. ADORA1 beeinflusst sowohl die basale Lipolyse als auch die Reaktion auf adrenerge Agonisten. Die Wirkung von Adenosin auf die Lipolyse kann durch Zugabe von Adenosin-Deaminase zur Neutralisierung von Adenosin sowie des ADORA1-spezifischen Agonisten Phenylisopropyladenosin^14,15 kontrolliert werden. Die hormonelle Aktivierung von G q-gekoppelten GPCRs kann auch die Lipolyse über die Aktivierung der Phospholipase C und der Proteinkinase C^{beeinflussen 16,17,18,19}. Entzündungssignale wirken sich auch auf die lipolytischen Raten aus. Die Aktivierung von TLR4 durch LPS (und andere Endotoxine) erhöht die lipolytische Rate durch die Aktivierung von ERK, das Perilipin-1 und HSL²⁰ phosphoryliert. TNF-α aktiviert auch die Lipolyse über ERK- und NF-κB-Aktivierung sowie die transkriptionelle Herunterregulierung der Phosphodiesterase PDE-3B und CIDEC^21,22,23. IL-6 wurde auch mit einer erhöhten Lipolyse von Adipozyten in Verbindung gebracht, insbesondere im mesenterialen Fettgewebe, dessen FFA-Freisetzung die Lebersteatose und die Gluconeogenese beeinflusst^24,25,26.

Die Lipolyse wird im gefütterten Zustand durch Insulin unterdrückt. AKT phosphoryliert und aktiviert PDE-3B, um den cAMP-Signalweg zu unterdrücken und die PKA-Aktivierung zu verhindern²⁷. Insulin reguliert ATGL²⁸ auch transkriptionell herunter. Adipositas fördert die Katecholaminresistenz durch eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich der Herunterregulierung von β-adrenergen Rezeptoren in Adipozyten 29,30,31,32,33. Adipozyten exprimieren alle drei β-adrenergen Rezeptoren (β-1, β-2 und β-3). Während β-1 und β-2 adrenerge Rezeptoren ubiquitär exprimiert werden, wird der β-3 adrenerge Rezeptor in Mäusen überwiegend in Adipozyten exprimiert^34,35. Die Expression von Adrb3 wird durch C/EBPα während der Adipogenese induziert³⁶. Der adrenerge Rezeptor β-3 wird in reifen Adipozyten stark exprimiert. Die Aktivierung von β-1 und β-2 adrenergen Rezeptoren ist aufgrund der Rückkopplungshemmung durch β-Arrestin³⁷ selbstlimitierend. Die Hemmung der Rückkopplung des β-3-adrenergen Rezeptors wird durch andere Signalwege vermittelt, die die Adrb3-Expression reduzieren^33,38,39.

Zahlreiche Verbindungen können verwendet werden, um die Lipolyse der Adipozyten zu aktivieren. Katecholamine sind wichtige physiologische Aktivatoren der Lipolyse. Noradrenalin (oder Noradrenalin) und Adrenalin (oder Adrenalin) aktivieren alle drei β-adrenergen Rezeptoren⁴⁰. Noradrenalin und Adrenalin beeinflussen die Lipolyse auch durch die Aktivierung des α-adrenergen Rezeptorsignals⁴¹. Häufig verwendete β-adrenerge Rezeptoragonisten sind Isoproterenol, ein nicht-selektiver β-adrenerger Rezeptoragonist, und die β-3-Adrenosensor-Agonisten CL-316,243 und Mirabegron⁴². Da Adipozyten überwiegend den β-3 adrenergen Rezeptor exprimieren, verwenden wir hier CL-316.243 als Beispiel. Seine Spezifität für den β-3-adrenergen Rezeptor macht es auch zu einem relativ spezifischen Aktivator der Adipozyten-Katecholamin-Signaltransduktion, der auch sicher in vivo verwendet werden kann. Beachten Sie, dass die üblicherweise verwendete Konzentration von 10 μM CL-316,243 in Zellkultur um Größenordnungen höher ist als die ~0,1 μM-Dosis, die erforderlich ist, um ein maximales Ansprechen zu erreichen³³. Forskolin umgeht den adrenergen Rezeptor und aktiviert direkt die Adenylylcyclase und die nachgeschaltete lipolytische Signalübertragung. Es gibt noch viele weitere Aktivatoren sowie Unterdrücker der Lipolyse. Bei der Auswahl einer Verbindung zur Stimulierung der Lipolyse sollten die Rezeptorspezifität und die nachgeschalteten Signalwege innerhalb des experimentellen Designs sorgfältig berücksichtigt werden.

Die Lipolyserate im weißen Fettgewebe ist ein wichtiger Stoffwechselfaktor, der sich auf die Kältetoleranz und die Nährstoffverfügbarkeit während des Fastens oder der körperlichen Betätigung auswirkt^43,44,45,46. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Lipolyserate in Adipozyten und Fettgewebe zu messen, was das Verständnis des Adipozytenstoffwechsels und dessen Auswirkungen auf den metabolischen Phänotyp verschiedener Mausmodelle erleichtern wird. Um die lipolytische Rate zu quantifizieren, messen wir das Vorkommen lipolytischer Produkte in den Medien (d.h. FFAs und Glycerin). Die Methode beruht auf der Freisetzung lipolytischer Produkte aus den Adipozyten in das Medium. Da weiße Adipozyten geringe Mengen an Glycerinkinase exprimieren, sind die Glycerin-Wiederaufnahmeraten niedrig⁴⁷. Umgekehrt sollte auch die Produktion von FFAs und Glycerin über andere Stoffwechselwege als die Lipolyse in Betracht gezogen werden. Adipozyten scheinen eine Phosphatase mit Aktivität gegen Glycerin-3-Phosphat zu exprimieren, was die Produktion von Glycerin aus Glycerin-3-phosphat ermöglicht, das aus Glukose^{abgeleitet wird 48,49,50}. Die Glykolyse ist eine Quelle für Glycerin-3-phosphat, die für die FFA-Wiederveresterung in weißen Adipozyten verwendet wird. Wenn der Glukosespiegel begrenzt ist, benötigt die Glyceroneogenese andere 3-Kohlenstoffquellen wie Laktat und^{Pyruvat 51}. Die Kanalisierung von FFAs, die durch Lipolyse innerhalb der Zelle freigesetzt werden, und ihr metabolisches Schicksal sind nur unzureichend verstanden. FFAs, die durch Lipolyse freigesetzt werden, müssen in Fettacyl-CoA umgewandelt werden, bevor sie wieder verestert oder einer β-Oxidation unterzogen werden. Es scheint, dass FFAs, die durch Lipolyse freigesetzt werden, wahrscheinlich die Zelle verlassen, bevor sie wieder aufgenommen und in Fettacyl-CoA umgewandelt^werden 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFAs können außerhalb der Zelle durch Albumin sequestriert werden. Wichtig ist, dass langkettige FFAs dafür bekannt sind, die Lipolyse rückkopplungshemmend zu sein, wenn sie nicht durch Albumin 63,64,65,66,67 sequestriert werden. Daher ist die Optimierung der FFA-Pufferkapazität des Mediums während des Lipolyse-Assays von entscheidender Bedeutung. Das hier beschriebene Verfahren ähnelt den bisher veröffentlichten Methoden zur Messung der lipolytischen Rate in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen und Menschen 15,68,69,70,71. Dieses Protokoll unterscheidet sich durch die Verwendung von seriellem Sampling; Durch die Durchführung von seriellen Abtastungen können wir intern überprüfen, ob die Lipolyse in der linearen Phase gemessen wird, und mehrere Messungen verwenden, um die Lipolyserate zu berechnen, wodurch Messfehler reduziert werden, um das Vertrauen in den endgültigen berechneten Wert zu erhöhen. Der Nachteil der seriellen Probenahme besteht darin, dass der Assay mehr Zeit und Reagenzien benötigt. Der längere Zeitrahmen verringert jedoch die Auswirkungen von Messfehlern auf den Standardfehler der Schätzungen des Satzes. Darüber hinaus misst dieses Protokoll sowohl die FFA- als auch die Glycerinfreisetzung und berücksichtigt das Verhältnis von FFA:Glycerinfreisetzung mit dem Ziel, ein Verhältnis von 3:1 zu erreichen, wie es bei vollständiger Lipolyse und Freisetzung von lipolytischen Produkten in das Medium zu erwarten wäre⁷².

Protocol

Die Verwendung aller Tiere wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Weill Cornell Medical College der Cornell University genehmigt.

1. Vorbereitung von Puffern und Sammelplatten

1. Stellen Sie 5 % Kälberserumalbumin (BSA) her, indem Sie 5 g BSA in 100 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) ohne Phenolrot auflösen. Rühren Sie das BSA vorsichtig um, damit es sich auflöst (Schütteln ist kontraproduktiv). Sobald das BSA vollständig aufgelöst ist, sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter. Lagern Sie die BSA-Medien bis zu 1 Monat bei 4 °C.
2. Stellen Sie Arbeitskonzentrationen von Kontroll- und Stimulationsmedien her. Steuermedien: 5% BSA-Medien mit Fahrzeugsteuerung. Stimulationsmedien: 5% BSA-Medien mit 0,5 μM CL-316,243. Stellen Sie für jedes Experiment neue Stimulationsmedien her.
3. Erwärmen Sie das zu verwendende Medium auf 37 °C. Beschriften Sie eine 96-Well-Platte für die Mediensammlung.

2. Probenvorbereitung

1. Führen Sie die Zellkultur wie unten beschrieben durch. Führen Sie alle Zellarbeiten in einem sterilen Abzug durch, um die Kontamination von außen zu minimieren.
   1. Isolieren und differenzieren Sie primäre Präadipozyten, wie in^73,74.
      1. Platte primäre Präadipozyten mit hoher Dichte, z. B. 1 x 10⁵ Zellen/Well in einer 24-Well-Platte in 1 ml/Well Kulturmedium (15 % fetales Kälberserum (FBS) und 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamin in DMEM/F12).
      2. Nachdem die Zellen eine 100%ige Konfluenz erreicht haben, differenzieren Sie 3 Tage lang mit 5 μM Dexamethason, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin, 1 μg/ml Insulin und 1 μM Thiazolidindion (TZD) in Nährmedien. Wechseln Sie dann für mindestens 3 Tage zu Nährmedien mit 1 μg/ml Insulin, um Lipidtröpfchen zu züchten. Verwenden Sie 1 ml/Vertiefung des Mediums in der 24-Well-Platte.
      3. Wechseln Sie das Nährmedium (1 ml/Well) alle 2 bis 3 Tage mit Insulin. Die Zellen können bis zu 2 Wochen in Medien mit Insulin gehalten werden. Verwenden Sie für diesen Assay nur Kulturen, in denen die Differenzierungsraten über 90 % liegen und in allen Gruppen ähnlich sind, da eine reduzierte Differenzierung als Verringerung der lipolytischen Rate fehlinterpretiert werden könnte.
      4. Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in insulinfreien Medien, bevor Sie die Lipolyse messen.
         HINWEIS: Insulin im Medium hält die Lipidtröpfchen aufrecht, hemmt aber auch die Lipolyse. Die Inkubation ohne Insulin für 24 h ermöglicht eine vollständige lipolytische Aktivierung ohne Verlust des Lipidtröpfchenvolumens. In einigen Systemen muss die Kulturzeit ohne Insulin möglicherweise verkürzt oder verlängert werden.
   2. Waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, um Serumreste aus dem Nährmedium zu entfernen.
      HINWEIS: Dieses Protokoll beinhaltet keinen Serummangel, der die Lipolyse aktivieren kann. Die Serumverhungerung kann nach Ermessen des Forschers eingesetzt werden.
2. Führen Sie die Ex-vivo-Kultur wie unten beschrieben durch.
   1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, mit einer Vertiefung für jedes Gewebe, das von jeder Maus entnommen werden soll. Geben Sie 4 ml DMEM bei Raumtemperatur in jede zu verwendende Vertiefung.
      HINWEIS: BSA in den Sammelmedien ist nicht erforderlich.
   2. Bereiten Sie eine 48-Well-Platte für den Lipolyse-Assay vor, mit einer Well für jedes Replikat. Geben Sie 400 μl DMEM bei Raumtemperatur in jede zu verwendende Vertiefung. Verwenden Sie zwei bis vier Kontroll- und zwei bis vier stimulierte Vertiefungen pro Gewebe und Maus.
   3. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation unter Narkose mit einer sekundären Methode wie einem bilateralen Pneumothorax. Hier verwendeten wir eine 32 g schwere, 7 Monate alte weibliche C57BL/6J-Maus, die 4 Monate lang mit einer 45% fettreichen Diät gefüttert wurde.
      HINWEIS: Dieses Protokoll kann auch für Männer sowie für andere Sorten, Diäten und Altersgruppen verwendet werden.
   4. Mit 70%igem Ethanol besprühen und mit einer Schere einen kleinen (~ 1 cm) seitlichen Schnitt in der Mitte der Bauchhaut machen, die Haut auseinanderziehen, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten zusammendrücken und die untere Bauchhaut umklappen, um die hinteren subkutanen Depots freizulegen. Lokalisieren und entfernen Sie den inguinalen Lymphknoten und stumpf präparieren Sie das inguinale Fettgewebe unmittelbar hinter dem inguinalen Lymphknoten mit einer Pinzette.
   5. Um das Gonadenfettgewebe zu gewinnen, machen Sie einen lateralen und einen vertikalen Schnitt im Bauchfell, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten. Halten Sie das Gonadenfettpolster mit einer Pinzette fest und schneiden Sie entlang der Gebärmutter (oder des Nebenhodens bei Männern), um das Gonadenfettgewebe zu entfernen. Legen Sie die gesammelten Depots in eine 6-Well-Platte.
   6. Entfernen Sie das Taschentuch aus der Vertiefung, legen Sie es auf eine Silikonmatte und schneiden Sie es mit einer Schere in 5 bis 7 mg große Stücke.
   7. Wiegen Sie 25 bis 30 mg (fünf oder sechs Stücke) für jede Assay-Vertiefung ab und geben Sie sie in eine 48-Well-Assay-Platte. Tupfen Sie das Taschentuch vor dem Wiegen auf ein sauberes Handtuch, um alle Medien zu entfernen. Wiegen Sie das Gewichtsboot nach der Entnahme des Gewebes und notieren Sie das Gewicht der zurückgebliebenen Rückstände. Wischen Sie das Gewichtsboot zwischen den Proben sauber und tarieren Sie es bei Bedarf erneut. Verwenden Sie für jedes Gewebe ein neues Gewichtsschiffchen.
   8. Nachdem alle Gewebeproben gewogen wurden, legen Sie die 48-Well-Assay-Platte für 15 Minuten in einen Inkubator mit 10 % CO₂ bei 37 °C und 10 %.

3. Lipolyse-Assay

1. Führen Sie die Mediensammlung durch. Führen Sie den Transfer des Mediums und die anschließende Probenentnahme in einem sterilen Abzug durch, um eine mögliche Kontamination durch externe Quellen zu minimieren.
   1. Entfernen Sie bei t = 0 das Medium und fügen Sie 400 μl pro Well Kontroll- oder Stimulationsmedium hinzu, und stellen Sie die Assay-Platte in einen Inkubator mit 37 °C und 10 % CO₂ . Bei Ex-vivo-Gewebekulturen ist das Medium vorsichtig mit einer Pipette zu entfernen. Die Absaugung sollte niemals verwendet werden.
      Anmerkungen: Alternativ können Sie eine zweite Platte mit Kontroll- und Stimulationsmedien vorbereiten und das Gewebe übertragen.
   2. Bei t = 1, 2, 3 und 4 h werden 200 μl Medium gesammelt, durch 200 μl des entsprechenden Kontroll- oder Stimulationsmediums ersetzt und die Assayplatte in den Inkubator zurückgelegt. Lagern Sie den Auffangteller bei 4 °C. Um die FFA-Pufferkapazität der BSA-Medien zu ermitteln, verwenden Sie eine zusätzliche Sammlung nach 24 h.
      HINWEIS: Die Experimente können hier gestoppt und die gesammelten Medien bei -20 °C gelagert werden.

4. Kolorimetrischer FFA-Assay

1. Erwärmen Sie die Reagenzien auf Raumtemperatur und lösen Sie eine Flasche Farbreagenz A mit einer Flasche Lösungsmittel A und eine Flasche Farbreagenz B mit einer Flasche Lösungsmittel B auf. Ab dem Datum der Rekonstitution werden diese Reagenzien am besten innerhalb von 1 Woche verbraucht. 1 Monat nach der Rekonstitution verwerfen.
2. Tauen Sie die Proben auf und mischen Sie sie.
3. Erstellen Sie eine FFA-Standardkurve. Die Standardlösung ist 1 mM. Verwenden Sie das folgende Volumen mit den Reagenzien für die Standardkurve: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 Verdünnung), 10 μL (1:4 Verdünnung), 10 μL (1:8 Verdünnung) und 10 μL Wasser für maximale Reichweite. Für niedrige FFA-Spiegel können 10 μl mit 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM und 0,05 mM Standard besser geeignet sein.
4. Pipettieren Sie Standards und Proben in eine 96-Well-Assay-Platte. Das empfohlene Probenvolumen beträgt 10 μl. Fügen Sie drei Vertiefungen mit dem gleichen Volumen an BSA-Medien wie die Proben zur Hintergrundkorrektur hinzu.
   Anmerkungen: Wenn die Probenkonzentrationen außerhalb des Bereichs der Standardkurve liegen, wiederholen Sie den Assay und stellen Sie das Probenvolumen auf 2-25 μl ein.
5. Geben Sie 150 μl Reagenz A in jede Vertiefung und mischen Sie. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen. Lass alle Blasen mit einer feinen Nadel platzen. Inkubieren Sie die Assayplatte bei 37 °C für 5 min.
6. Lesen Sie die Absorption der Platte bei 550 nm und 660 nm Referenz ab (Messwert A).
7. Geben Sie 75 μl Reagenz B in jede Vertiefung und mischen Sie. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen. Lass alle Blasen mit einer feinen Nadel platzen. Inkubieren Sie die Assayplatte bei 37 °C für 5 min.
8. Lesen Sie die Absorption der Platte erneut bei 550 nm und 660 nm Referenz ab (Messwert B).

5. Kolorimetrischer Glycerin-Assay

1. Rekonstituieren Sie das freie Glycerin-Reagenz mit 36 ml Reinstwasser und akklimatisieren Sie es auf Raumtemperatur. Diese Reagenzien werden am besten innerhalb weniger Wochen verwendet. 2 Monate nach der Rekonstitution verwerfen.
2. Tauen Sie die Proben auf und mischen Sie sie.
3. Erstellen Sie eine Glycerin-Standardkurve, indem Sie eine siebenstufige, 2-fache serielle Verdünnung der Glycerin-Standardlösung und einen Wasserrohling vornehmen.
   HINWEIS: Die Standardkurve ist bis zu 25 μl 2,8 mM Glycerin relativ linear, bei höheren Konzentrationen jedoch nicht linear.
4. Pipettieren Sie jeweils 25 μl Standard und Proben in die 96-Well-Assay-Platte. Fügen Sie drei Vertiefungen mit dem BSA-Medium zur Hintergrundkorrektur hinzu.
5. Geben Sie 175 μl freies Glycerinreagenz in jede Vertiefung und mischen Sie. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen. Lass alle Blasen mit einer feinen Nadel platzen. Inkubieren Sie die Assayplatte bei 37 °C für 5 min.
6. Lesen Sie die Absorption der Platte bei 540 nm ab.

6. Berechnung der lipolytischen Rate

1. Beginnen Sie mit den Werten für die optische Dichte (OD). Verwenden Sie für Glycerin direkt die OD-Werte von_{A 540} . Berechnen Sie den OD des FFA-Assays nach der folgenden Formel:
   OD = (Messwert B: A 550 – A 660) – (Messwert A: A₅₅₀ – A ₆₆₀)
2. Verwenden Sie die Standardkurve, um die FFA- und Glycerinwerte in den gesammelten Proben zu berechnen. Zeichnen Sie die Standard-OD-Werte auf der y-Achse auf und verwenden Sie auf der x-Achse Standardkonzentrationen relativ zum Probenvolumen (d. h. die Konzentration der Wells mit 20 μl 1 mM FFA-Standard auf einer Platte mit 10 μl-Proben entspricht 2 mM). Passen Sie eine lineare Trendlinie an:
   y = mx + b
3. Untersuchen Sie die Standardkurve visuell und entfernen Sie alle Punkte, die außerhalb des linearen Bereichs des Assays liegen. Berechnen Sie die Probenkonzentrationen mit der folgenden Gleichung:
   Probenkonzentration: x = (OD – b) ÷ m
4. Passen Sie Proben an, die außerhalb des linearen Untersuchungsbereichs liegen, und untersuchen Sie sie erneut. Um die endgültige Probenkonzentration zu erhalten, subtrahieren Sie die Konzentration der Hintergrundvertiefungen, die nur BSA-Medien enthalten, von der Konzentration der Proben.
5. Berechnen Sie die Mol FFA und Glycerin, die von jeder Probe zu jedem Zeitpunkt produziert werden, gemäß der Formel:
   
   wobei C n = Konzentration zum Zeitpunkt t = _n; V_t = Gesamtvolumen im Bohrloch; V_s = Probenentnahmevolumen; und M n = Mol, die zum Zeitpunkt t = n produziert werden (wenn die Konzentrationen in mM und die Volumina in ml angegeben sind, beträgt die Ausgabe μMol).
   Zum Beispiel zu verschiedenen Zeitpunkten:
   M 1 = C₁ × V_t
   M 4 = C₄ × V_t + (C₁ + C₂+ C₃)V_s
   oder
   M 4 = C₄ × V_t + C₃ × V s + C₂ × V s + C₁ ×_{V s}
6. Normalisieren Sie das Gewebegewicht, indem Sie es durch das Gewebegewicht für jede Probe in Gramm dividieren, um Einheiten von μmol/g zu erhalten. Für kultivierte Zellen werden die Werte als μmol/well angegeben. Stellen Sie sicher, dass die Zellzahl und die Differenzierungseffizienz von Well zu Well vergleichbar sind.
   HINWEIS: Unterschiede in der Proliferations- oder Differenzierungseffizienz erschweren die Interpretation der Ergebnisse und erfordern eine andere Methode der Normalisierung (z. B. Normalisierung auf Protein; siehe Diskussion).
7. Berechnen Sie die Steigung der erzeugten μmol/g (y-Achse) über der Zeit (x-Achse) für jede Probe einzeln.
   1. In einer Tabellenkalkulation kann dies mit der Funktion =SLOPE(known_ys,known_xs) erfolgen. Geben Sie in einer neuen Zelle “=SLOPE” ein (markieren Sie dann mit dem Cursor die Glycerin- oder FFA-Werte der Probe in μmol/g und markieren Sie dann die entsprechenden Zeitwerte).
   2. Überprüfen Sie die Linearität der Daten. ^R2-Werte sind eine schnelle Möglichkeit, die Linearität der Proben zu bestimmen. In einer Tabellenkalkulation kann dies mit der Funktion =RSQ(known_ys,known_xs) auf die gleiche Weise wie in Schritt 6.7.1 beschrieben erfolgen, aber die anfängliche Eingabe ist =RSQ. Stellen Sie sicher, dass die R^2-Werte > 0,98 liegen. Niedrigere Werte weisen auf eine Abweichung von der Linearität hin. Dies kann durch einen Mess-/Abtastfehler oder einen Verlust der Linearität entstehen.
      1. Eine andere Möglichkeit, die Linearität zu testen, besteht darin, eine lineare Regression für jede Stichprobe durchzuführen und die Residuen darzustellen. Generieren Sie in einer statistischen Analysesoftware eine XY-Tabelle mit einem einzelnen Y-Wert für jeden Zeitpunkt. Wählen Sie Analysieren > Einfache lineare Regression aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Residualdiagramm , bevor Sie auf OK klicken. Das Residuendiagramm wird als neues Diagramm angezeigt.
8. Verwenden Sie die FFA- und Glycerinproduktionsrate (d. h. die Steigung [(μmol/g/h]) für jede Probe als individuellen Datenpunkt, um statistische Analysen durchzuführen und Werte darzustellen, wenn verschiedene lipolytische Bedingungen verglichen werden. Wenn lipolytische Raten über Genotypen hinweg verglichen werden, verwenden Sie zwei oder drei Proben pro Tier als technische Replikate und verwenden Sie den Durchschnitt für einen Datenpunkt pro Tier, so dass die Stichprobengröße gleich der Anzahl der Tiere ist.

Representative Results

Discussion

Hier stellen wir ein grundlegendes Protokoll zur Messung der Lipolyserate in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe zur Verfügung. Um die Lipolyse zu quantifizieren, ist es wichtig, die lipolytische Rate in der linearen Phase zu messen. Wir verwenden eine serielle Probenahmetechnik, bei der ein großer Teil der Medien gesammelt und in regelmäßigen Abständen durch frische Medien ersetzt wird. Diese semikonservative Methode ermöglicht die Zugabe von frischem BSA mit FFA-Pufferkapazität und verzögert die Rückkopplungshemmung, wodurch die Dauer der linearen Lipolyse verlängert wird. Dieses experimentelle Design versucht, die Vaskularisation von Fettgewebe in vivo zu rekapitulieren, das frisches Albumin liefert, um freigesetzte FFAs zu binden⁷⁵. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Lipolyse in murinem ex vivo weißem Fettgewebe und inguinalem Fettgewebe zu messen, die in vitro differenziert wurden. Das Protokoll kann wahrscheinlich so optimiert werden, dass es in braunen und beigen Fettdepots sowie in Fettgewebe anderer Organismen und immortalisierten Zelllinien mit hohem adipogenem Potenzial gut funktioniert. Das Protokoll ermöglicht Flexibilität in Bezug auf Alter, Geschlecht und Ernährung der Mäuse vor der Entnahme von Fettgewebe für Ex-vivo-Assays . Einige Manipulationen, wie z. B. Fasten, können sich auf die basale lipolytische Rate auswirken, während andere Interventionen wie ernährungsinduzierte Fettleibigkeit ebenfalls die Rate der stimulierten Lipolyse beeinflussen.

Das Protokoll muss für jedes experimentelle System optimiert werden, je nachdem, ob die lipolytischen Raten höher oder niedriger sind. Um die Linearität zu überprüfen, empfehlen wir, die R^2-Werte zu berechnen und sich das Residuendiagramm anzusehen. Die^R2-Werte sollten sehr nahe an 1 liegen. Bei der Auswertung des Residuendiagramms sollte man zu späteren Zeitpunkten nach negativen Residualwerten Ausschau halten, da diese darauf hindeuten, dass die lipolytischen Raten abnehmen und die Linearität verloren geht. Beispiele für solche Residuendiagramme sind in Abbildung 5E,F dargestellt. Die Eliminierung der 4-h-Zeitpunkte ermöglicht in diesem Fall eine genauere Berechnung der linearen lipolytischen Rate und verbessert die^R2-Werte. Da die Rate jedoch von mehreren Zeitpunkten aus berechnet wird, ist sie relativ robust, und die Einbeziehung eines solchen Zeitpunkts hat nur einen geringen Einfluss auf die^R2-Werte und die berechnete Lipolyserate. Wenn ein einzelner Zeitpunkt zur Berechnung der lipolytischen Rate verwendet wird, können die Daten leichter verzerrt werden.

Die Art und Weise, wie die Daten normalisiert werden, kann sich auch auf die relativen Ergebnisse zwischen Stichproben auswirken. Hier empfehlen wir, das ex vivo Gewebe auf das Gewebegewicht zu normalisieren und die primären Präadipozyten in vitro pro Well zu differenzieren. Diese Normalisierungstechniken sind jedoch möglicherweise nicht für alle experimentellen Systeme geeignet. Wichtig ist, dass eine Normalisierung pro Well nicht angemessen ist, wenn sich die Proliferationsrate oder die Differenzierungseffizienz zwischen den Gruppen unterscheidet. Alternative Normalisierungstechniken sind Protein, Lipid und DNA. Jede Methode der Normalisierung hat ihre Vor- und Nachteile. Die Normalisierung des Gewebegewichts und des Gewebes ist einfach und unkompliziert. Unterschiede in der Adipozytengröße können bedeuten, dass mageres Fettgewebe viel mehr Adipozyten pro Gramm enthält als fettleibiges Fettgewebe, während Unterschiede in der Differenzierungseffizienz zu Unterschieden in der Anzahl der Adipozyten pro Well führen können. Lipide können mit organischen Lösungsmitteln (z. B. 2:1 Chloroform:Methanol [v/v]) extrahiert und der Triglyceridgehalt mit einem kolorimetrischen Reagenz gemessen werden. Während die Normalisierung des Lipidgehalts keine traditionell verwendete Methode ist, sind die Lipidtröpfchen schließlich die Organelle, die einer Lipolyse unterzogen wird, und diese Normalisierungsmethode ist spezifisch für Adipozyten, was nützlich sein kann, wenn die Differenzierungsraten zwischen den Zellen unterschiedlich sind. Nach der Lipidextraktion können 0,1-0,3 N NaOH zur Proteinextraktion verwendet werden, die dann mit dem Bradford- oder BCA-Proteinassay⁶⁸ untersucht werden können. Alternativ können die Proben in Lysepuffer homogenisiert und die Lipidfraktion durch Zentrifugation⁷⁰ entfernt werden. Beachten Sie, dass eine Lipidkontamination die Proteinassays stört. Wenn das Protein zur Normalisierung verwendet werden soll, müssen die Zellen ausgiebig (mindestens dreimal) gewaschen werden, um BSA aus dem Assay-Medium zu entfernen. Manchmal haften differenzierte Adipozyten nicht gut auf der Platte und vertragen nicht die drei Waschungen, die erforderlich sind, um überschüssiges BSA zu entfernen. Die Normalisierung auf DNA ermöglicht die Normalisierung auf die Zellzahl und kann mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit durchgeführt werden, gefolgt von der Quantifizierung der Gesamt-DNA durch Absorption oder Echtzeit-PCR-Analyse der Genkopienzahl. Alternativ kann in plattierten Zellen eine DAPI-Färbung mit anschließender Bildgebung verwendet werden, um Kerne zu zählen und auf die Zellzahl zu normalisieren. Bei der Normalisierung anhand der Zellzahl oder des Proteins ist es wichtig, Nicht-Adipozytenzellen in der Probe zu berücksichtigen. Fettgewebe enthält auch Immun- und Endothelzellen; In fettleibigem Fettgewebe können Entzündungen und Hypertrophie dazu führen, dass nur 1 von 10 Zellkernen aus reifen Adipozyten stammt. Adipozyten tragen jedoch immer noch zum größten Teil der Masse und des Lipidgehalts des Gewebes bei. Bei in vitro differenzierten Präadipozyten wirkt sich die Differenzierungseffizienz auf den relativen Prozentsatz reifer Adipozyten aus; Wenn dies der Fall ist, ist die Normalisierung kompliziert. Idealerweise sollte die Differenzierungseffizienz optimiert werden, bevor die Zellen für einen Lipolyse-Assay verwendet werden. Wenn dies nicht möglich ist, wird eine Normalisierung des Lipidgehalts empfohlen, wenn das Lipidtröpfchenvolumen zwischen differenzierten Adipozyten ähnlich ist. Der Vergleich der lipolytischen Raten zwischen Adipozytenkulturen mit ungleicher Differenzierung kann zu falschen Schlussfolgerungen über die Lipolyse führen, wenn der treibende Faktor tatsächlich die Adipogenese ist. Dies ist eine Einschränkung des Protokolls.

Langkettige FFAs hemmen die Lipolyse 63,64,65,66,67. FFAs reichern sich an, wenn sie in den Medien nicht ausreichend abgeschieden werden. Ein Großteil der Fehlerbehebung im Zusammenhang mit der Optimierung der Messung der Lipolyse hängt mit der Minimierung der FFA-Retention zusammen. Die Berechnung des molaren Verhältnisses der FFA:Glycerin-Freisetzung in das Medium hilft bei der Identifizierung von Problemen im Zusammenhang mit der FFA-Retention. Wenn das molare Verhältnis von FFA:Glycerin 3:1 beträgt, werden alle Produkte der Lipolyse freigesetzt und in den Medien aufgefangen, während ein Verhältnis unter 2:1 Anlass zur Sorge gibt. Eine wichtige Überlegung bei Ex-vivo-Assays ist die Größe des Fettgewebebrockens. Größere Gewebestücke haben ein geringeres Verhältnis von Oberfläche zu Volumen und halten daher mit größerer Wahrscheinlichkeit FFAs zurück und weisen infolgedessen reduzierte lipolytische Raten auf (Abbildung 4A,B). Vor diesem Hintergrund ist es wichtig, das Fettgewebe für jede Probe in Stücke von gleichbleibender Größe und Form zu schneiden. Um die FFA-Sequestrierung in den Medien zu erleichtern, ist es auch wichtig sicherzustellen, dass die Medien genügend BSA enthalten, um die freigesetzte FFA zu binden. Die FFA-Pufferkapazität der Medien kann durch Erhöhung der BSA-Konzentration oder Erhöhung des Medienvolumens erhöht werden. Ebenso effektiv ist es, das Sammelvolumen oder die Sammelhäufigkeit zu erhöhen. Wenn man hohe lipolytische Raten, aber FFA:Glycerin-Verhältnisse unter 2:1 beobachtet, empfehlen wir, die Sammelhäufigkeit auf alle 30 Minuten zu erhöhen und den Assay nach 2,5 h zu stoppen.

Das hier vorgestellte Protokoll ist für weißes Fettgewebe ex vivo der Maus und primäre Präadipozyten, die in vitro differenziert sind, optimiert, die beide hochgradig lipolytisch sind. Der Assay muss optimiert werden, um die Lipolyse in anderen Systemen zu messen, oder wenn Unterschiede in der relativ niedrigen Basalrate der Lipolyse von besonderem Interesse sind. Zum Beispiel haben 3T3-L1-Adipozyten eine geringere lipolytische Aktivität³². Wenn die lipolytische Rate niedrig ist, sollte das Inkubationsvolumen verringert werden (d. h. anstelle von 400 μl pro Well in einer 24-Well-Platte sollten 200 μl in einer 24-Well-Platte oder 300 μl in einer 12-Well-Platte und 100-150 μl pro Zeitpunkt gesammelt werden). Das Sammelvolumen sollte nicht unter 100 μl fallen, da größere Probenvolumina erforderlich sind, um niedrige FFA- und Glycerinspiegel genau zu messen. Um Glycerin mit 50 μl Medium pro Probe zu untersuchen, sollte das freie Glycerinreagenz in 31 ml Wasser gelöst und 150 μl Reagenz mit 50 μl Probe in jeder Vertiefung verwendet werden. Die FFA-Werte können mit 25 μl Probe pro Vertiefung gemessen werden, vielleicht auch mehr, solange die Linearität beibehalten wird. Die Zeitpunkte können auch verlängert werden, um das Signal zu erhöhen. Bei der Bestimmung der lipolytischen Raten von anderen Zellen als weißen Adipozyten sollten Unterschiede im Zellstoffwechsel berücksichtigt werden. Zum Beispiel exprimieren braune und beige Adipozyten viel höhere Konzentrationen von Glycerinkinase und sind daher in der Lage, die Glycerinfreisetzung durch Lipolyse zu erhalten^76,77. Diese metabolisch aktiven Zellen könnten auch in der Lage sein, freigesetzte Fettsäuren in katabole oder synthetische Wege zu leiten, ohne sie in das Medium freizusetzen. Das metabolische Schicksal von FFA und Glycerin in dem spezifischen Zelltyp, der untersucht wird, muss bei der Interpretation der Ergebnisse eines Lipolyse-Assays berücksichtigt werden, insbesondere bei einem anderen Zelltyp als weißen Adipozyten. Lipolyse-Assays in anderen Zelltypen müssen optimiert und validiert werden.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Unterschiede in der lipolytischen Rate in Mausmodellen zu bewerten. Primäre Präadipozyten, die in vitro differenziert sind, sind ein nützliches Werkzeug, um zellautonome Effekte von genetischen Manipulationen oder pharmakologischen Behandlungen in Adipozyten zu untersuchen. Fettgewebe hingegen enthält andere Zelltypen, darunter auch Immunzellen. Der Einfluss von Immunzellen des Fettgewebes auf die Regulierung der Lipolyse ist wichtig zu berücksichtigen, wenn die Lipolyse des gesamten Gewebes beurteilt wird. Kultivierte Lipolysemodelle für Adipozyten können den potenziell komplizierenden Einfluss von Immunzellen umgehen und eine gründliche Untersuchung der spezifischen Zelltypen ermöglichen, während Fettgewebeexplantaten einen robusteren Vergleich zur in vivo Umgebung ermöglichen. Darüber hinaus kann der ex vivo Assay verwendet werden, um lipolytische Raten in verschiedenen Fettdepots zu untersuchen. In diesen Systemen wird die Lipolyse durch Verbindungen wie β-adrenerge Rezeptoragonisten stimuliert, so dass Veränderungen des Sympathikustonus, die sich auf das In-vivo-Mausmodell auswirken könnten, nicht beobachtet werden. Die In-vivo-Messung der Lipolyse wird durch die Dynamik der Freisetzung und Aufnahme von FFA und Glycerin in verschiedenen Geweben im ganzen Körper erschwert. Die FFA- und Glycerinspiegel im Serum zu einem bestimmten Zeitpunkt sind das Gleichgewicht zwischen Sekretion und Aufnahme, und es sollte nicht davon ausgegangen werden, dass Veränderungen der Serum-FFA- und Glycerinspiegel ausschließlich auf die Lipolyse des Fettgewebes zurückzuführen sind. Die nüchtern-induzierte Lipolyse wird durch den Sympathikustonus beeinflusst, führt aber nicht zu schnellen und robusten Veränderungen des Serum-FFA- oder Glycerinspiegels, was es schwierig macht, Veränderungen der Nüchternserum-Serumspiegel von FFA und Glycerin zu interpretieren. Die In-vivo-Lipolyse kann mit einem β-3-Adrenorezeptor-Agonisten wie CL-316,243 stimuliert werden, und erhöhte Serum-FFA und Glycerin sind innerhalb von 20 Minuten nach der Stimulation nachweisbar. Lipolytische In-vivo-Assays sollten sowohl Basismessungen von Serum-FFA und Glycerin als auch eine Vehikelkontrolle umfassen. Auf diese Weise kann die stimulationsspezifische Veränderung des Serum-FFA- und Glycerinspiegels bestimmt werden.

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc, 	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793 	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A 	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B 	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x 	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work