Generierung von 3D-Tumorsphäroiden für Wirkstoffevaluierungsstudien

Zusammenfassung

Dieser Artikel demonstriert eine standardisierte Methode zur Konstruktion dreidimensionaler Tumorsphäroide. Eine Strategie zur Sphäroidbeobachtung und bildbasierten Deep-Learning-Analyse unter Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystems wird ebenfalls beschrieben.

Zusammenfassung

In den letzten Jahrzehnten wurden neben monolayerkultivierten Zellen auch dreidimensionale Tumorsphäroide als potenziell leistungsfähiges Werkzeug für die Evaluierung von Krebsmedikamenten entwickelt. Den herkömmlichen Kulturmethoden fehlt jedoch die Möglichkeit, die Tumorsphäroide auf dreidimensionaler Ebene homogen zu manipulieren. Um diese Einschränkung zu beheben, stellen wir in dieser Arbeit eine bequeme und effektive Methode zur Konstruktion von Tumorsphäroiden mittlerer Größe vor. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode der bildbasierten Analyse unter Verwendung einer auf künstlicher Intelligenz basierenden Analysesoftware, die die gesamte Platte scannen und Daten über dreidimensionale Sphäroide erhalten kann. Es wurden mehrere Parameter untersucht. Durch die Verwendung einer Standardmethode zur Konstruktion von Tumorsphäroiden und eines Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analysesystems kann die Effektivität und Genauigkeit von Arzneimitteltests, die an dreidimensionalen Sphäroiden durchgeführt werden, drastisch gesteigert werden.

Einleitung

Krebs ist eine der am meisten gefürchteten Krankheiten, nicht zuletzt wegen seiner hohen Sterblichkeitsrate¹. In den letzten Jahren hat sich die Möglichkeit, Krebs zu behandeln, durch die Einführung neuer Therapien erhöht 2,3,4,5. Zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle werden verwendet, um Krebs im Labor zu untersuchen. 2D-Modelle können jedoch nicht alle wichtigen Parameter, die auf eine Antitumorsensitivität hinweisen, sofort und genau beurteilen. Daher können sie die In-vivo-W....

Protokoll

1. Sphäroide-Konstruktion

1. Anti-Adhäsions-Behandlung der Kulturplatte
   1. Pipettieren Sie 100 μl Antihaftreagenz in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit U-förmigem Well-Boden und bewahren Sie sie 10 Minuten lang auf. Nach 10 Minuten das Beschichtungsreagenz absaugen und zweimal mit sterilisiertem PBS waschen.
   2. Legen Sie die Kulturplatte bis zur Verwendung in einen Inkubator (37 °C in befeuchteter Luft mit 5 % CO₂).
2. Zellvorbereitung, -entnahme und -zählung
   1. Verwenden Sie das für die Zellen spezifische Nährmedium, um die Zellen in Zellkulturflaschen zu kultivieren (Ergänzende Tabel....

Ergebnisse

Abbildung 1A,B zeigt den Prozess, der in dieser Studie zur Konstruktion von Tumorsphäroiden verwendet wird. Wir haben die Zellen zunächst in einer 48-Well-U-Bodenplatte ausgesät. Dieser Schritt ist fast derselbe wie bei der 2D-Zellkultur. Wir hielten die Platte in einem gemeinsamen Inkubator mit Wasser, das die Brunnen umgab, so dass die abgelagerten Zellen begannen, in einem Selbstorganisationsprozess Sphäroide zu bilden. Unter normalen Betriebsbedingungen bildeten sich di.......

Diskussion

Die Mikroumgebung spielt eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum. Es kann die Bereitstellung extrazellulärer Matrices, Sauerstoffgradienten, Ernährung und mechanische Interaktion beeinflussen und damit die Genexpression, Signalwege und viele Funktionen von Tumorzellen beeinflussen 19,20,21. In vielen Fällen erzeugen 2D-Zellen solche Effekte nicht oder sogar gegenteilige Effekte, was die Bewertung von medikamentösen Behandlungen b.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5-10 μ L Pipettenspitzen	AXYGEN	T-300
1,5  mL Kochbeständige Mikroröhrchen	Axygen	MCT-150-C
100-1000μ L Pipettenspitzen	KIRGEN	KG1313
15 mL Zentrifugenröhrchen	Nest	601052
200 μ L Pipettenspitzen	AXYGEN	T-200-Y
3D-Gel	Avatarget	MA02
48-Well-U-Bodenplatte	Avatarget	P02-48UWP
50 mL Zentrifugenröhrchen	Nest	602052
Alamar Blue	Thermo
Anti-Adhärenz-Spüllösung	STEMCELL	#07010
Zertifiziert FBS	BI	04-001-1ACS
Deionisiertes Wasser	Aladdin	W433884-500ml
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	11965-092
DMSO	Sigma	D2650-100ML
Excel Software	Microsoft Office
Graphpad Prisma Software	GraphPad-Software
High Content Imager und SMART-System	Avatarget	1-I01
Image J Software	National Institutes of Health
Insulin-Transferrin-Selenium-A Ergänzung (100X)	Gibco	51300-044
Parafilm	Bemis	PM-996
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin/ Streptomycin Sol	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Scientific Fluoroskan Ascent	Thermo	Fluoroskan Ascent
T25 Kolben	JET Biofil	TCF012050
Trypsin, 0,25% (1X)	Hyklon	SH30042,01

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