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Summary
Aquí, presentamos un método de evaluación de estabilidad basado en tecnología de dispersión de luz múltiple para evaluar la estabilidad de los extractos de medicina tradicional china.
Abstract
El intermedio de extracción de la medicina tradicional china es el intermediario clave en el proceso de preparación, y su estabilidad tiene un impacto importante en la eficacia y calidad del producto final. Sin embargo, los métodos de evaluación de estabilidad existentes a menudo requieren mucho tiempo y mano de obra, lo que requiere observación a largo plazo y la operación de equipos complejos (como la cromatografía líquida de alto rendimiento), y es difícil obtener más información física sobre la inestabilidad del sistema. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer una tecnología de análisis de estabilidad rápida y precisa para la medicina tradicional china. La dispersión múltiple de luz es un método analítico de vanguardia que puede evaluar con precisión y rapidez la estabilidad de las medicinas tradicionales chinas de una manera respetuosa con el medio ambiente sin cambiar la naturaleza o el estado de la muestra o usar reactivos orgánicos.
En este trabajo, utilizando los datos de escaneo precisos de la dispersión de luz múltiple, el protocolo actual adquirió rápidamente las curvas de variación para el grosor de la capa, la velocidad de migración de partículas y el tamaño promedio de las partículas a lo largo del tiempo. Esto permitió la identificación precisa del mecanismo y las características cruciales que causan la inestabilidad del sistema en sus primeras etapas. Cabe destacar que el período de investigación para el proceso de extracción puede acortarse considerablemente mediante la cuantificación detallada de la estabilidad del sistema, que también permite un análisis rápido, preciso y profundo de los efectos de varios procesos de extracción en la estabilidad de Phyllanthus emblica L.
Introduction
En la fabricación de la medicina tradicional china (MTC), la estabilidad de los intermedios de extracción de la MTC y las preparaciones líquidas relacionadas siempre ha sido el foco de la inspección1. La eficacia clínica de los medicamentos, especialmente con polifenoles como ingrediente activo primario, sufre debido a importantes problemas de estabilidad 2,3. El líquido oral Sanajon y el líquido oral Nuodikang son ejemplos de casos típicos de este problema4. Por lo tanto, es crucial aprender a utilizar herramientas eficientes para evaluar y optimizar de forma rápida y precisa la estabilidad de los intermedios líquidos en el proceso de producción de MTC. Se cree que Phyllanthus emblica L. (PE), una planta medicinal muy extendida en el sudeste asiático, tiene buenas propiedades antioxidantes5, así como acciones antiinflamatorias6, antibacterianas7 y antitumorales8. Durante el procedimiento de extracción térmica, los taninos en PE se transforman violentamente9. Bajo catálisis a altas temperaturas, estos taninos se hidrolizan rápidamente para producir moléculas como el ácido gálico y el ácido elágico, que conducen a inestabilidad o precipitación debido a su escasa solubilidad1. Los métodos actuales para evaluar la estabilidad de la MTC, como las pruebas aceleradas o la centrifugación, suelen ser engorrosos4, lo que limita el desarrollo posterior de los procesos de preparación pertinentes.
Basándonos en el principio de dispersión múltiple de luz (MLS), establecimos un método de evaluación de estabilidad rápida para extractos de PEF y analizamos el mecanismo de inestabilidad. MLS es un método de medición basado en el escaneo de fuentes de luz infrarroja cercana. Cualquier cambio en el sistema de solución resulta en un cambio en la intensidad de la luz. La luz incidente se dispersa cuando es absorbida o penetrada por las partículas de la muestra. El sistema registra la señal luminosa de transmisión cuando pasa a través de la muestra; Si la transmitancia de luz de la muestra es deficiente, el sistema registra la señal luminosa de retrodispersión. En comparación con la observación visual, esto puede ahorrar mucho tiempo1 y puede analizar de forma rápida y precisa el fenómeno de inestabilidad en detalle, proporcionando así información más útil para guiar la optimización del proceso de extracción.
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Protocol
1. Preparación del extracto
- Pese con precisión una cantidad adecuada de PE y agregue 10 veces (peso) de agua desionizada para la extracción por reflujo.
- Coloque cinco muestras para la extracción por reflujo durante 0 h (E1), 0,5 h (E2), 1 h (E3), 1,5 h (E4) y 2 h (E5) después del pesaje.
- Después de la extracción, enfríe las muestras a temperatura ambiente y péselas para compensar el peso perdido para garantizar la consistencia con los pesos previos a la extracción.
- Centrifugar las muestras a 8.581 × g durante 10 min para asegurar la eliminación del material insoluble y los residuos herbales de la solución de muestra.
- Use una pipeta para agregar 20 ml de solución de muestra en el frasco de muestra para asegurarse de que la solución agregada cada vez esté a la misma altura.
NOTA: Evite la contaminación, como huellas dactilares, en la parte de escaneo de la botella de muestra, asegúrese de que la botella de muestra esté limpia y verifique si hay arañazos visibles en la superficie de la botella. Al agregar la solución de muestra, tenga cuidado de no derramar o salpicar en la botella de muestra, y asegúrese de que el nivel de líquido esté a la misma altura en cada botella.
2. Funcionamiento del instrumento
- Encienda el instrumento de detección MLS y caliéntelo durante 30 minutos.
- Haga clic en el botón Crear archivo en el menú superior (o haga clic en Archivo | Nueva función de archivo) para crear un nuevo archivo de prueba.
- Haga clic en el botón Mostrar temperatura de laboratorio de turbisca en el menú superior para ajustar la temperatura objetivo del instrumento a 25 ° C.
NOTA: La temperatura establecida del instrumento debe ser superior a la temperatura ambiente; de lo contrario, la temperatura de la muestra se verá afectada por la temperatura ambiente. - Haga clic en Análisis del programa en el menú superior para ingresar al programa de análisis de configuración. Agregue el programa a la lista y, en la barra de tareas, agregue 5 minutos como ciclo, escanee durante 48 h a la secuencia de análisis y establezca el tiempo de equilibrio en 20 minutos. Seleccione este programa de análisis para todas las mediciones posteriores.
- Mueva la botella de muestra preparada al sistema de detección MLS. Después de configurar el programa, haga clic en Inicio para iniciar la medición.
NOTA: Tenga cuidado de no agitar la botella de vidrio al cargar la muestra. La medición solo se puede iniciar después de que la temperatura de la muestra y la temperatura de ajuste estén equilibradas.
3. Configuración del programa de análisis de dispersión de luz múltiple
- Después de la recopilación de datos, haga clic en la lista de parámetros de cálculo para establecer los parámetros ópticos para calcular el índice de estabilidad (SI), el tamaño de partícula y la velocidad de migración de partículas.
- Establezca los parámetros ópticos de la siguiente manera: la intensidad de transmisión de luz de fase continua (T0) como 99.99% (agua), el índice de refracción de fase dispersa (np) como 1.36 y el índice de refracción de fase continua (nf) como 1.33.
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Representative Results
La Figura 1 muestra el principio de medición de luz múltiple y el significado de los resultados recopilados. En los resultados de los espectros MLS (Figura 2), la abscisa fue la altura de la celda de muestra, y la ordenada fue la intensidad de transmisión (T%) y retrodispersión (BS%). Al calcular los resultados de los espectros MLS, el sistema puede obtener los cambios en los parámetros físicos clave de la muestra durante el período de medición, incluido el valor medio de transmisión delta (ΔT) (Figura 3A), la trayectoria libre de fotones (Figura 3B), el SI (Figura 3C) y el tamaño de partícula (Figura 3D).). Con la extensión del tiempo de medición, los espectros MLS de extractos estables fluctúan poco o nada, y sus parámetros físicos, incluyendo el ΔT, la trayectoria libre de fotones y el tamaño de partícula, tienden a ser estables.
Los resultados típicos de inestabilidad de la muestra se muestran en la Figura 2A, C-E. Los resultados espectrales de las muestras estables tendían a ser consistentes en todo momento de exploración, como se muestra en la Figura 2B, que es una característica típica de las muestras estables. Para cuantificar aún más los parámetros de estabilidad, el SI se puede utilizar para la evaluación. El protocolo actual permite la identificación rápida de la estabilidad bajo diferentes métodos de extracción basados en SI (Figura 3C) y el análisis del mecanismo de inestabilidad. Cabe señalar que los valores más bajos del SI se asocian con una mejor estabilidad. La muestra se considera estable si el SI es <10 dentro del período de exploración. Al comparar los valores del SI, se pudieron distinguir con precisión las estabilidades de las cinco muestras y se pudieron obtener los espectros característicos de estabilidad relevantes (Figura 4). La tasa de migración de partículas (Tabla 1) combinada con el parámetro anterior puede proporcionar información adicional sobre el mecanismo de inestabilidad de la muestra.
Figura 1: Principio de análisis de MLS. El MLS utiliza luz infrarroja cercana pulsada como fuente de luz (longitud de onda: 880 nm), y dos detectores ópticos síncronos detectan la luz de transmisión (T, 0 ° de la radiación incidente, sensor de transmisión) y la luz de retrodispersión (BS, 135 ° de la radiación incidente, detector de retrodispersión) que pasan a través de la muestra, respectivamente. La fuente de luz, el detector de luz de transmisión y el detector de luz de retrodispersión constituyen la sonda de medición. La medición de abajo a arriba de la celda de muestra comprende un escaneo. Cualquier inestabilidad en la muestra tendrá un ligero impacto en las intensidades de la señal T y BS . Este impacto es registrado y analizado para caracterizar diversos fenómenos inestables, incluyendo floculación, estratificación y sedimentación4. Mediante el cálculo de múltiples resultados de escaneo, se puede analizar con precisión el mecanismo y la velocidad de la inestabilidad del sistema de solución en la etapa inicial de inestabilidad, y la curva de relación del espesor de la capa (capa de sedimento, capa flotante y capa de clarificación) con el tiempo, así como la curva de relación de la velocidad de migración de partículas y el tamaño de partícula con el tiempo, se puede obtener. Abreviatura: MLS = dispersión de luz múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Espectros MLS (transmisión y retrodispersión) del extracto de PE con diferentes métodos de extracción. (A-E) Espectros MLS de E1-E5. A partir de los datos espectrales, se puede inferir aproximadamente que (B) la muestra E2 fluctuó menos, lo que indica que la muestra era más estable, mientras que (A) E1 puede haber tenido turbidez debido a la disminución general de la luz de transmisión. (C-E) Las muestras E3-E5 eran bastante inestables, y los datos espectrales de las muestras a diferentes alturas eran diferentes, lo que indica que la estratificación ocurrió en el período posterior. Abreviaturas: MLS = dispersión múltiple de luz, PE = Phyllanthus emblica L., EN = extracto obtenido por el método N. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados del análisis de espectros MLS . (A) Con el paso del tiempo, el valor T se vuelve más alto y la muestra es más inestable. Para E3 y E4, el nivel de ΔT volvió al de la etapa anterior al final, lo que indica que la agregación y la precipitación ocurrieron en estos extractos. El ΔT de E5 se mantuvo en un nivel bajo después de la turbidez, lo que indica que E5 puede haber tenido una gran cantidad de sedimentación. (B) La tendencia en el camino libre de fotones puede reflejar los cambios en la luz transmitida de la muestra. (C) La estabilidad de varios extractos fluctuó continuamente a lo largo del tiempo, siendo E2 > E1 > E5 > E3 > E4 el orden de estabilidad durante el período de almacenamiento. (D) Los cambios dinámicos en el tamaño de las partículas pueden revelar la agregación de partículas en la muestra. Los resultados muestran que los tamaños de partícula de todas las muestras cambiaron considerablemente dentro de 8-20 h, con el tamaño de partícula de E3 y E5 incluso excediendo el rango de medición. Por lo tanto, esta etapa es crucial para la formación de agregados inestables de moléculas o partículas en la muestra. Del mismo modo, en la etapa final, a medida que las partículas comenzaron a nuclearse y continúan añadándose, finalmente se observó una reducción en el tamaño de partícula después de que suficientes partículas formaron grandes aglomerados y precipitaron. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inestabilidad de extractos de PE obtenidos por diferentes métodos de extracción. El resultado lleva tiempo ya que la abscisa y el color representan la intensidad de la luz transmitida o la luz retrodispersada. El resultado puede reflejar directamente la situación real de turbidez y estratificación de las muestras en diferentes puntos de tiempo y alturas. La banda de cromaticidad en la parte superior de cada resultado representa los valores de intensidad de luz correspondientes a diferentes colores, donde la parte azul representa T%, y la parte marrón representa BS%. (A) El T% de E1 comenzó a disminuir después de 16 h, lo que indica que la muestra estaba turbia, y todo el proceso no se deslaminó ni precipitó. (B) El T% de E2 fue consistente durante todo el período de medición, lo que indica que la muestra fue estable. (C) E3 estaba turbio a las 16 h, y su BS% aumentó repentinamente a las 20 h, lo que indica que las partículas en la muestra se recogieron, estratificaron y precipitaron en ese momento. (D) El resultado aquí es similar al de (C). (E) E5 experimentó una delaminación severa después de 20 h, que duró hasta el final de la medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medición | Zona de cálculo | Tasa de migración (mm/h) |
| E1 | 0-24 h | 1.56 |
| E2 | 0-24 h | 0.005 |
| E3 | 0-24 h | 1.476 |
| E4 | 0-19 h | 2.732 |
| E5 | 0-24 h | 1.377 |
Tabla 1: Resultados de la tasa de migración de partículas. En los resultados, la tasa de migración de partículas puede considerarse como la tasa de precipitación de partículas, que puede reflejar la estabilidad de la muestra hasta cierto punto. Las tasas de migración más altas indican una estabilidad más pobre. Se puede ver en los resultados que la tasa de migración se clasificó como E4 > E1 > E3 > E5 > E2, y este orden es algo diferente de los resultados para el índice de estabilidad, SI. Esto se debe a que este resultado refleja la tasa de migración promedio de partículas en la muestra durante el período de medición en lugar de la tasa de migración de partículas durante la precipitación rápida de la muestra.
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Discussion
La evaluación rápida y precisa de la estabilidad de la MTC siempre ha sido un foco de la investigación de la MTC. Para proporcionar información más útil para dirigir la mejora del proceso de extracción, este estudio analizó los mecanismos de estabilidad e inestabilidad de una muestra utilizando una tecnología no destructiva de infrarrojo cercano.
En este protocolo, los parámetros de estabilidad importantes se calculan en función de los datos precisos del escaneo MLS. Los escaneos MLS pueden recopilar la transmisión (T%) y la retrodispersión (BS%) de la muestra en tiempo real y calcular el índice de estabilidad (SI), el tamaño de partícula, la velocidad de migración de partículas y otros parámetros físicos importantes. La fórmula de cálculo viene dada por la ecuación (1)4:
ETI = 
(1)
donde x i es la transmisión promedio por cada minuto de medición, x T es el promedio x i, x T = (x 1 + x 2 + ... x i + xi +1 ... + x n)/n, y n es el número de escaneos. El SI es un parámetro importante que refleja la estabilidad de la muestra, y un aumento en el valor del SI indica una disminución en la estabilidad. SI incluye todos los datos de medición para el cálculo, lo que significa que se puede utilizar para predecir y evaluar la estabilidad de las muestras a corto plazo.
El cálculo del tamaño de partícula se basa en la ley de Beer-Lambert. La fórmula de cálculo viene dada por la ecuación (2):
T(l,ri) = T0 
, l(d,φ) = 
(2)
donde ri es el diámetro interior de la célula, y T0 es la intensidad de la luz de transmisión de la fase continua. De acuerdo con la intensidad de la luz de transmisión medida (T), la fracción de volumen de partículas (φ) y los parámetros establecidos, se puede calcular el tamaño de partícula.
La velocidad de sedimentación se calcula utilizando la ecuación (3):
(3)
V es la tasa de migración de partículas (ms−1), ρ c es la densidad de fase continua (kgm−3), ρp es la densidad de partículas (kgm−3), g es la constante de gravedad (9.81 ms−2), d es el diámetro promedio de partícula (μm), v es la viscosidad de fase continua (cP) y es el porcentaje de volumen.
En el proceso de extracción con calor, una gran cantidad de taninos hidrolizables en el PE se hidrolizan, liberando el ácido elágico aglicona insoluble. Dado que el ácido elágico es una molécula plana no polar, sufre agregación intermolecular y precipitación debido a interacciones hidrofóbicas, y esta es la principal causa de precipitación en la solución1. Con la extensión del tiempo de extracción, se forma más ácido elágico, lo que resulta en una mala estabilidad de la muestra, y se acorta el tiempo de clarificación de la muestra correspondiente. Esto se refleja bien en los resultados de la Figura 4.
Sobre la base de los resultados del cálculo anterior, se puede concluir que la precipitación provocada por la agregación de componentes o partículas, que es evidente en las muestras E3-E5, es la fuente principal del mecanismo de inestabilidad de la solución de extracción de PE. Debido a los polisacáridos disueltos durante el proceso de extracción, el E2 fue relativamente estable porque el proceso de precipitación se vio obstaculizado por su alta viscosidad10. Sin embargo, a medida que se prolongaba el período de extracción, se producían grandes cantidades de componentes insolubles como el ácido elágico, lo que dificultaba el mantenimiento del estado estacionario. En general, la inestabilidad acelerada comenzó en ~ 12 h, y la duración de la extracción tuvo una correlación negativa con la estabilidad, que fue crucial para la optimización del proceso.
La importancia del método MLS con respecto a los métodos existentes es la siguiente. En primer lugar, los resultados de medición son más precisos y auténticos, ya que el método es fácil de usar, no requiere tratamiento previo de la muestra y las mediciones se pueden tomar sin tocar la muestra. Incluso las muestras con altas concentraciones no necesitan ninguna dilución. En segundo lugar, la MLS tiene una alta sensibilidad. Las velocidades cambiantes basadas en la concentración y el tamaño de las partículas se pueden detectar al comienzo del cambio en las partículas dispersas en la preparación líquida. Por lo tanto, en comparación con la observación visual, MLS es ~ 200 veces más eficiente en el tiempo.
Dado que los cambios de temperatura pueden afectar la intensidad de la luz dispersa del sistema, debe enfatizarse que la temperatura de la muestra debe mantenerse constante después de la instalación, lo que requiere un tiempo de equilibrio. Además, los elementos interferentes (como los residuos de material medicinal) deben eliminarse para evaluar adecuadamente la estabilidad del extracto. Finalmente, es esencial medir con precisión las características físicas antes de la prueba para determinar con precisión los parámetros físicos, como el tamaño de partícula y la trayectoria libre de fotones.
Hay varias limitaciones para este enfoque. Por ejemplo, la oxidación del almacenamiento a largo plazo causa cambios bruscos de color en la solución de extracción, lo que puede afectar la evaluación de la precipitación y el comportamiento de agregación. Puede ser difícil garantizar la consistencia de algunas muestras cuando se requieren muestras paralelas, ya que no se pueden medir varias muestras a la vez. La inversión en equipos requerida para esta tecnología es relativamente costosa, lo que es la principal barrera para su aplicación y promoción.
En el futuro, confiamos en que este método hará contribuciones sobresalientes en el campo de las preparaciones farmacéuticas, particularmente en las evaluaciones de dispersión y disolución in vitro. Puede ser utilizado para estudiar nuevos sistemas de administración de fármacos como liposomas, nanopartículas y geles in situ, y debido a sus ventajas de ser más eficiente, rápido, simple y completo, este método podría acortar considerablemente el ciclo de investigación11,12. Además, se podría realizar un modelo de predicción de estabilidad basado en una gran cantidad de datos de inestabilidad de medicamentos. Esta tecnología podría combinarse y mejorarse con otras técnicas de detección en el futuro, lo que podría contribuir a la investigación y el desarrollo farmacéutico.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973493); Equipo Nacional de Innovación Interdisciplinaria de Medicina Tradicional China (ZYYCXTD-D-202209); Sanajon Pharmaceutical Group Chengdu University of TCM production, study, and Research Joint Laboratory Project (2019-YF04-00086-JH); y el Proyecto Financiado por el Plan de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Sichuan (2021YFN0100). Los autores agradecen al Instituto Innovador de Medicina China y Farmacia de la Universidad de Chengdu de TCM por su apoyo técnico en el trabajo de espectrometría de masas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable electric heating jacket | Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd | MH-1000 | www.keweiyq.com |
| Analytical balance(1/10000) | Sartorious, Germany | BSA224S | www.sartorius.com.cn |
| CNC ultrasonic instrument | Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd | KQ-500DE | www.ks-csyq.com |
| GL-16 high-speed centrifuge | Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd | 18091403 | www.sklxj.com |
| Phyllanthus emblica L. | Hehuachi medicinal materials market | YJL2004 | Produced in Yunnan |
| Turbisoft Lab multiple light scattering instrument | French Formulaction Company | Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5 | www.formulaction.com |
| UPR-II-5T ultra-pure water device | Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd | Z16030559 | www.ccdup.com |
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Medicina Número 194 Phyllanthus emblica L. estabilidad dispersión múltiple de la luz extractoErratum
Formal Correction: Erratum: Using Multiple Light Scattering to Examine the Stability of Phyllanthus emblica L. Extracts Obtained with Different Extraction Methods
Posted by JoVE Editors on 08/04/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Multiple Light Scattering to Examine the Stability of Phyllanthus emblica L. Extracts Obtained with Different Extraction Methods. The Authors section was updated from:
Haozhou Huang1
Mengqi Li2
Chuanhong Luo3
Sanhu Fan4
Taigang Mo4
Li Han3
Dingkun Zhang3
Junzhi Lin5
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Sichuan Nursing Vocational College
3School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, State Key Laboratory of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China
4Sanajon Pharmaceutical Group
5TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
to
Haozhou Huang1,2
Mengqi Li3
Chuanhong Luo4
Sanhu Fan5
Taigang Mo5
Li Han4
Dingkun Zhang4
Junzhi Lin6
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3Sichuan Nursing Vocational College
4State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Sanajon Pharmaceutical Group
6TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
