Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G und einem In-vitro-Spontantod-Assay

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von CLON-G, um die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage zu verlängern, und bietet ein zuverlässiges Verfahren zur Beurteilung des Neutrophilentods mit Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.

Zusammenfassung

Die durchschnittliche Lebensdauer eines Neutrophilen beträgt weniger als 24 h, was die Grundlagenforschung an Neutrophilen und die Anwendung von Neutrophilenstudien einschränkt. Unsere bisherigen Forschungen zeigten, dass mehrere Signalwege den spontanen Tod von Neutrophilen vermitteln könnten. Es wurde ein Cocktail entwickelt, der gleichzeitig auf diese Signalwege abzielt, Caspasen-lysosomale Membranpermeabilisierung-Oxidationsmittel-Nekroptose-Hemmung sowie Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (CLON-G), der die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage verlängerte, ohne die Neutrophilenfunktion signifikant zu beeinträchtigen. Gleichzeitig wurde ein zuverlässiges und stabiles Protokoll zur Beurteilung und Bewertung des Neutrophilentods entwickelt. In dieser Arbeit zeigen wir, dass CLON-G die Lebensdauer von Neutrophilen in vitro auf mehr als 5 Tage verlängern kann, und wir zeigen die Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit FACS und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Dieser Bericht stellt Verfahren zur Herstellung von CLON-G vor und stellt einen in vitro Spontantodtest von Neutrophilen vor, der für die Untersuchung von Neutrophilen und für die anschließende Untersuchung des Neutrophilentods verwendet werden kann und somit eine zuverlässige Ressource für die Neutrophilengemeinschaft darstellt.

Einleitung

Es ist bekannt, dass Neutrophile ein Arsenal an reichlich zytoplasmatischen Granula, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH)-Oxidase, antimikrobiellen Enzymen und verschiedenen Organellen enthalten, die sich gegen eindringende Mikroben verteidigen. Darüber hinaus sind sie sehr beweglich und die ersten Zellen, die an die Entzündungsstelle rekrutiert werden, was bedeutet, dass Neutrophile die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems sind ^1,2. Die Granulozyten-Transfusionstherapie ist daher zu einer vielversprechenden klinischen Behandlung für neutropeniebedingte Infektionen geworden, um die ....

Protokoll

Das Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee genehmigte und überwachte alle Verfahren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G und dem In-vitro-Todestest .

1. Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G

HINWEIS: Alle genannten Vorgänge und Materialien müssen steril sein. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen gut gemischt und gleichmäßig verteilt sind.

1. Konservierung der CLON-G-Komponenten
   1. Lösen Sie 50 mg Q-VD-oph ....

Ergebnisse

Die Wright-Giemsa-gefärbte Morphologie (Abbildung 2A-D) und die FACS-Phänotypen (Abbildung 2E-J) der mit CLON-G behandelten Neutrophilen wurden nicht beeinflusst. Die Viabilität der mit CLON-G behandelten Neutrophilen nach 24 h betrug etwa 90%+, basierend auf der durchflusszytometrischen Analyse (Abbildung 3) und den Fluoreszenzbild-Assays (Abbi.......

Diskussion

Neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen und adaptiven Immunität, und ihre Homöostase ist streng reguliert. Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im peripheren Blut des Menschen und haben einen robusten und schnellen Umsatz. Ein gesunder Erwachsener kann täglich 1 x 10⁹ Neutrophile/kg aus dem Knochenmark freisetzen²⁸. Das Absterben der Neutrophilen ist daher zu einem der rätselhaften Rätsel auf diesem Gebiet geworden, und.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,2 &Mikro; m Spritzenfilter	Pall Corporation	4612	Filtrat vorbereitet CLON-G Komponenten.
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	LABSELECT	MCT-001-150	Labor-Verbrauchsmaterial.
15 mL Zentrifugenröhrchen	LABSELECT	CT-002-15	Labor-Verbrauchsmaterial.
24-Well-Zellkulturplatte	Falcon	351147	Neutrophilen-Kulturplatte.
50 mL Zentrifugenröhrchen	LABSELECT	CT-002-50	Labor-Verbrauchsmaterial.
BD LSRII	BD		Instrument für die durchflusszytometrische Analyse des Todes von Neutrophilen.
Calciumchlorid (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assistent der Annexin-V-Bindung an Phosphatidylserin.
Konfokales Mikroskop	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument für die Fluoreszenzanalyse des Todes von Neutrophilen.
Konfokalplatte	NEST	801001-20mm	Labor-Verbrauchsmaterial für Fluoreszenzbild-Assays.
Zählperlen	Thermo Fisher	C36950	Quantifizierung des Todes von Neutrophilen in der Durchflusszytometrie.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Komponente von CLON-G. LMP-Hemmer.
Dimethylsulfoxid ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Lösungsmittel für Q-VD-oph und Nec-1s.
Fötales Rinderserum	Gibco	10099141C	Bestandteil des Basismediums der Neutrophilenkultur. Versorgung mit Nährstoffen.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V kann an Phosphatidylserin gealterter Zellen binden. Dies ist im FITC-Kanal.
Hsp70	Abcam	ab113187	Komponente von CLON-G. LMP-Hemmer.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Komponente von CLON-G. Antioxidans.
NEC-1S	EMD Millipore	852391-15-2	Komponente von CLON-G. Nekroptose-Hemmer.
Penicillin-Streptomycin-Lösung (PS)	Gibco	15070063	Bestandteil des Basismediums der Neutrophilenkultur. Antibiotika zum Schutz der Zellen vor bakterieller Kontamination.
Propidiumiodid (PI)	BioLegend	421301	Für den Todestest von Neutrophilen. Ein kleines fluoreszierendes Molekül, das an DNA bindet; kann aber nicht passiv in Zellen eindringen, die eine intakte Plasmamembran besitzen.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Komponente von CLON-G. Pan-Caspase-Hemmer.
Rekombinanter humaner Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor für die Injektion (CHO-Zelle)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOZYTEN-Komponente	von CLON-G.  Fördern Sie das Überleben von Neutrophilen über den Akt-Signalweg.
Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden	Falcon	100-0102	Labor-Verbrauchsmaterial für die Durchflusszytometrie-Analyse.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Bestandteil des Basismediums für die Neutrophilenkultur.
Kochsalzlösung	LEAGENE	R00641	Lösung für die durchflusszytometrische Analyse des Todes von Neutrophilen.
Natriumhydroxid (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029 pH-Einstellung	für NAC.
Wright-Giemsa Färbelösung	Solarbio	G1020	Neutrophile Cytospin-Färbung.