Das serielle Anästhesie-Array für die Hochdurchsatzuntersuchung flüchtiger Wirkstoffe mit Drosophila melanogaster

Die Existenz von kollateralen Anästhesieeffekten (d.h. Effekte, die nicht sofort beobachtbar sind, aber verzögerte Verhaltensfolgen haben können) ist allgemein anerkannt, aber das Verständnis ihrer Mechanismen und Risikofaktoren bleibt rudimentär ^1,2. Ihre verzögerte Manifestation und Subtilität begrenzen die Anzahl potenziell wichtiger Variablen, die in Säugetiermodellen innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens und zu akzeptablen Kosten untersucht werden können. Die Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) bietet einzigartige Vorteile im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen³ und für das toxikologische Screening⁴, die bisher nicht zur Untersuchung von anästhesierenden Kollateraleffekten eingesetzt wurden.

Wir haben das serielle Anästhesie-Array (SAA) entwickelt, um den Einsatz von Fruchtfliegen bei der Untersuchung der Pharmakodynamik und Pharmakogenetik von Anästhetika zu erleichtern. Ein wesentlicher Vorteil der SAA ist die gleichzeitige Exposition bei identischen Versuchsbedingungen mehrerer Kohorten. In Verbindung mit der experimentellen Flexibilität von Fruchtfliegen ermöglicht der hohe Durchsatz der SAA die Erforschung biologischer und umweltbezogener Variablen in einem Maßstab, der in Säugetiermodellen unmöglich ist.

Im Prinzip handelt es sich bei der SAA einfach um eine Reihe von miteinander verbundenen Anästhesiestellen (Kammern aus 50-ml-Fläschchen), durch die ein Trägergas flüchtige Wirkstoffe abgibt. Die erste Kammer des Systems enthält destilliertes Wasser, durch das das Trägergas befeuchtet wird (Fliegen reagieren empfindlich auf Austrocknung), und endet mit einem einfachen Durchflussindikator, der den Gasfluss durch das System anzeigt. Feine Netze, die an den Öffnungen der Verbindungsschläuche angebracht sind, trennen die Kammern, um die Wanderung von Fliegen zwischen den Kammern zu verhindern. Die Anzahl der Stellen "in Reihe" ist durch den Widerstand gegen den drucklosen Gasstrom (Schläuche, Netze) begrenzt.

Wir haben die Kinetik dieses SAA-Prototyps in einer früheren Publikation⁵ charakterisiert. Obwohl die genauen pharmakokinetischen Eigenschaften zwischen den SAAs variieren, sind die relevanten Grundlagen, die experimentell getestet wurden, wie folgt: (i) Ein anfänglicher Fluss von 1,5-2 l/min gleicht alle Kammern (Gesamtvolumen von ±550 ml) mit der gewünschten Konzentration des Anästhetikums innerhalb von 2 Minuten aus; ii) die Konzentration des in die Kammern abgegebenen Anästhesiedampfes sich zwischen der ersten und der letzten Stelle nicht nennenswert ändert, weil die Menge des Anästhetikums, die im Gasvolumen in einer einzelnen Kammer (50 ml) enthalten ist, die von einer beliebigen Anzahl von Fliegen aufgenommene Menge bei weitem übersteigt; und (iii) sobald die Kammern ausgeglichen sind, kann der Trägergasstrom reduziert werden (50-100 ml/min oder weniger), um Verschwendung und Kontamination der Umwelt zu vermeiden (flüchtige Anästhetika haben Treibhausgaseigenschaften). Der minimale Durchfluss, der zur Aufrechterhaltung einer stationären Dampfkonzentration erforderlich ist, hängt in erster Linie von der Undichtigkeit des SAA ab, da die Dampfaufnahme durch die Fliegen vernachlässigbar ist. Unter diesen Standardbedingungen (2 % Isofluran und 1,5 l/min Trägergasfluss) werden die Fliegen innerhalb von 3-4 Minuten in allen Positionen des Arrays betäubt (d. h. unbeweglich), mit unmerklichen Unterschieden zwischen den Positionen. VGAs können Minuten bis Stunden lang verabreicht werden, und unsere typischen Belichtungsparadigmen liegen im Bereich von 15 Minuten bis 2 Stunden. Um das System zu spülen, wird der Verdampfer ausgeschaltet und der Durchfluss wird aufrechterhalten, um etwa das 10-fache des Arrays auszutauschen (1,5 l/min für 5 min). Die Geschwindigkeit der Anästhesieelimination hängt von der eingestellten Flussrate ab.

Flüchtige Anästhetika interagieren mit zahlreichen noch nicht identifizierten Zielen, einschließlich des immuninflammatorischen Systems⁶. Der Beitrag einzelner molekularer Zielstrukturen zu primären versus kollateralen Endpunkten (der "Anästhesiezustand" vs. lang- und kurzfristige "Nebenwirkungen") ist nur unzureichend verstanden. Daher ist ein empfindliches Fliegensystem mit hohem Durchsatz wertvoll, um Experimente an höheren Tieren zu unterstützen, trotz der offensichtlichen Unterschiede zwischen Fliegen und Säugetieren⁷. Einige Unterschiede können in der Tat vorteilhaft sein; Zum Beispiel unterscheidet sich das Immunsystem der Fliege von dem höherer Tiere dadurch, dass ihm der adaptive Arm der Antwort fehlt⁸. Auch wenn dies wie eine Einschränkung für das Verständnis von Krankheiten beim Menschen erscheinen mag, bietet es eine einzigartige Gelegenheit, die Interaktion von VGAs mit der angeborenen immuninflammatorischen Antwort isoliert von der adaptiven Antwort zu untersuchen⁹. Dies ermöglicht es, die pharmakologischen Wirkungen von VGA auf Entzündungen und deren Modulation durch die unterschiedlichen genetischen Hintergründe einer Population zu untersuchen.

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, die im Protokoll verwendet werden.

1. Bau der SAA

1. Stellen Sie den Rahmen her, indem Sie Holz schneiden und den Rahmen mit den Abmessungen in Abbildung 1A zusammenbauen.
2. Konische 50-ml-Röhrchenkappen modifizieren.
   1. Bohren Sie mit einem 9/32-Zoll-Bohrer zwei Löcher in jede Kappe. Schleifen Sie die Löcher, um das zerlumpte Plastik zu reinigen. Schleifen Sie die Oberseite der Kappe, um die Oberfläche aufzurauen (dies hilft bei der Haftung des Klebstoffs).
   2. Schneiden Sie serologische 5-ml-Pipetten auf die richtige Größe zu (3 Zoll für den Zufluss und 1,5 Zoll für den Ausfluss), indem Sie den Kunststoff einritzen und ihn dann an der geritzten Linie sauber brechen. Schleifen Sie die Enden der geschnittenen/zerbrochenen Pipetten.
   3. Kleben Sie das Netz auf die Schläuche (lassen Sie den Klebstoff richtig trocknen). Schneiden Sie das Netz nach dem Trocknen des Klebers auf die Größe des Schlauches zu.
   4. Führen Sie die Röhrchen in die Löcher der konischen Kappen ein, wobei beide Röhrchen (3/4 Zoll) über die Kappe hinausragen. Stellen Sie sicher, dass das Zulaufrohr länger in das Rohr hineinragt als der Abfluss (Abbildung 1B).
   5. Tragen Sie Kleber auf die Oberseite der Kappen um die Tuben auf, um die Teile zusammenzuhalten (lassen Sie dem Klebstoff eine angemessene Trocknungszeit zu, bevor Sie fortfahren).
3. Befestigen Sie die Kappen am Rahmen und verlegen Sie den Schlauch (Abbildung 1C).
   1. Befestigen Sie selbstklebende Kabelzurrgurte am Rahmen (3,25 Zoll voneinander entfernt, Mitte zu Mitte).
   2. Befestigen Sie die Kappen mit Kabelbindern am Rahmen. Schneiden Sie die Enden des Kabelbinder-Tags kurz ab.
   3. Schneiden Sie die Längen (9 Zoll) der Tygon-Schläuche ab und verbinden Sie sie mit den Ein- und Auslaufschläuchen an jeder modifizierten Kappe (Abbildung 1D). Beginnen Sie am stromaufwärts gelegenen Ende und befestigen Sie dann den Schlauch vom Auslauf an den Zulauf der nächsten Position.
   4. Fügen Sie einen Durchflussindikator zum stromabwärts gelegenen "Zufluss" hinzu (Position 10, Abbildung 1E).
   5. Setzen Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen auf die erste Position und füllen Sie es bis knapp unter das Einströmröhrchen mit Wasser (Abbildung 1F).
4. Bereite die Schnittstelle für den Vaporizer vor. Entfernen Sie die Kolben, schneiden Sie Kerben aus zwei 10-ml-Dosierspritzen (1/2 Zoll tief x 1/4 Zoll breit, Abbildung 1G) und führen Sie sie in den Ein- und Auslass des Verdampfers ein, wobei die Kerben direkt zur Vorderseite des Verdampfers zeigen, um sie mit den Löchern auszurichten (Abbildung 1H). Optional: Kleben Sie die modifizierten Spritzen fest. Wenn es erschwinglich ist, verwenden Sie einen handelsüblichen Verteiler (siehe Materialtabelle für eine Option).
5. Schließen Sie das gesamte System an. Verwenden Sie Tygon-Schläuche, um die Komponenten in der folgenden Reihenfolge miteinander zu verbinden: Trägergastank mit Regler > gasspezifischer Durchflussmesser > Verdampfer > SAA (Abbildung 1C).
6. Füllen Sie leere Stellen auf dem Array mit leeren konischen 50-ml-Röhrchen. Schalten Sie den Gastank ein, öffnen Sie den Durchflussmesser auf ~2 l/min und schalten Sie den Verdampfer auf 0% ein. Bestätigen Sie den Gasfluss durch das System, indem Sie den Durchflussmesser stromaufwärts des Verdampfers und den Durchflussanzeiger stromabwärts der letzten Kammer des SAA auf Durchfluss überprüfen. Alternativ können Sie das nachgeschaltete Schlauchende in Wasser einführen und nach Blasen suchen.
   Anmerkungen: Da das System nicht unter Druck steht, stoppt eine Wassersäule von mehr als ein paar Zentimetern den Durchfluss. Wenn es am stromabwärts gelegenen Ende des Arrays keinen Durchfluss gibt, überprüfen Sie Folgendes: Der Verdampfer muss eingeschaltet sein, um den Durchfluss zu ermöglichen; Prüfen Sie, ob der Tankregler und die Durchflussmesser den Durchfluss zulassen. Überprüfen Sie die Array-Positionen, um sicherzustellen, dass die Rohre fest angeschraubt sind. und prüfen Sie, ob der Klebstoff an den modifizierten Kappen undicht ist.

Abbildung 1: Aufbau der SAA. (A) Schematische Darstellung des Holzrahmens, der die SAA trägt. (B) Schematisierter Querschnitt einer modifizierten Kappe mit Zu- und Abflussröhrchen aus serologischen 5-ml-Pipetten mit Messungen. (C) Zusammengesetzte SAA (reproduziert aus Olufs et ^al.5) (D) Details einer modifizierten konischen 50-ml-Kappe, die Ein- und Ausflussröhrchen zeigt. (E) Abfluss stromabwärts (Position 10) mit dem Durchflussanzeiger. (F) Vorgeschaltetes (Position 1) wassergefülltes Rohr zur Befeuchtung des Trägergases. Der rote Pfeil zeigt den Wasserstand an. (G) Modifizierte 10-ml-Dosierspritze für den behelfsmäßigen Verteiler. Der rote Kreis hebt die ausgeschnittene Kerbe hervor, die sich zwischen den 8-ml- und 10-ml-Markierungen (oder 1/2 Zoll x 1/4 Zoll) befindet. (H) Rückansicht des Tec7 Vaporizers, die das Einsetzen und die Ausrichtung der modifizierten Spritzen zeigt. In dieser Ansicht ist nur eine Spritze vorhanden, die links das Loch (roter Pfeil) zeigt, das mit der Kerbe der modifizierten Spritze ausgerichtet werden muss. Hinweis: Eine Fehlausrichtung dieser Aussparung und der Ausflussöffnung führt zu einer Unterbrechung der Anästhesieverabreichung. Dieses Teil ist eine potentielle Schwachstelle in diesem maßgeschneiderten System. Wenn Mittel zur Verfügung stehen, sollte ein kommerzieller Verteiler verwendet werden. Abkürzung: SAA = serielles Anästhesie-Array. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Vor der Anästhesieexposition

1. Vierundzwanzig Stunden oder mehr vor der Anästhesieexposition sortieren Sie die Fliegenkohorten nach Bedarf für das Experiment mit der bevorzugten Methode (z. B. CO₂ oder Äther).

3. Funktionsweise der SAA

1. Fliegen aus Lebensmittelfläschchen in leere konische 50-ml-Röhrchen (ohne CO₂) überführen.
   1. Zählen und notieren Sie alle toten Fliegen, bevor Sie sie aussetzen.
2. Öffnen Sie die Kappe und schrauben Sie 50 mL konische Röhrchen mit Fliegen auf den SAA.
3. Schalten Sie das Trägergas ein und stellen Sie die gewünschte Durchflussmenge ein.
   Anmerkungen: Wir verwenden normalerweise 1-2 l/min.
4. Stellen Sie den Anästhesieverdampfer auf die gewünschte Konzentration ein.
   HINWEIS: Wir verwenden in der Regel 2 % für Isofluran und 3,5 % für Sevofluran, was bei Säugetieren äquipotente Dosen sind¹⁰.
5. Setzen Sie die Fliegen für die gewünschte Dauer aus (min: 15 min).
   HINWEIS: Eine minimale Belichtungszeit von 15 Minuten wird empfohlen, um mögliche Schwankungen in der Äquilibrierung zwischen den Positionen der SAA zu vermeiden. In diesem System dauert es 2-3 Minuten, bis sich die Anästhetika über alle Positionen hinweg ausgeglichen haben.
6. Spülen Sie das System am Ende der Exposition 5 Minuten lang mit einem Frischgasstrom (Verdampfer auf 0 % eingestellt) mit 1,5 l/min, was etwa dem 10-fachen des gesamten SAA-Volumens entspricht.

4. Checkliste vor Beginn eines Experiments

1. Öffnen Sie den Hochdruckregler (oben auf dem Lufttank) vollständig und schließen Sie ihn dann eine halbe Umdrehung, um den Trägergasfluss sicherzustellen.
2. Folgen Sie den Schläuchen für jede Leitung zu den i) Durchflussmessern und ii) dem Verdampfer (stellen Sie sicher, dass der Zu- und Abfluss richtig angeschlossen ist) und iii) überprüfen Sie den Anästhesiespiegel in den Verdampfern.
3. Überprüfen Sie nach dem Beladen der Kammern mit Probanden, ob die Luft/das Gas mit dem Blasentest oder dem Durchflussanzeiger strömt.
   Anmerkungen: Einige Vaporizer lassen keinen Luftstrom zu, wenn sich der Drehknopf in der Aus-Position befindet.
4. Wenn Gas fließt, vergewissern Sie sich, dass sowohl der Durchflussmesser als auch die Durchflussanzeige stromabwärts den Durchfluss anzeigen.
5. Lassen Sie am Ende des Experiments 4-5 Minuten Luftstrom einwirken, um das Anästhetikum auszuwaschen.

Einen SAA-Videolink finden Sie hier: Perouansky Research Methods - Abteilung für Anästhesiologie - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Unser Labor hat die SAA verwendet, um (i) den Einfluss des Genotyps auf die Verhaltensempfindlichkeit gegenüber Anästhetika zu untersuchen5; (ii) Screening mitochondrialer Mutanten auf die Kollateraleffekte von Anästhetika11; und (iii) die Pharmakodynamik von Isofluran und Sevofluran auf die Ergebnisse bei Schädel-Hirn-Trauma (SHT) zu untersuchen12,13,14,15,16,17. Die veröffentlichten Ergebnisse zeigen deutlich, dass der genetische Hintergrund die Pharmakodynamik klinisch eingesetzter VGAs sowohl in Bezug auf den konventionellen Phänotyp der Anästhesie als auch auf die Kollateraleffekte der Anästhesietoxizität sowie den Gewebeschutz beeinflusst 5,11,13,14,15.

Repräsentatives Beispiel 1 (Abbildung 2): Genetische Drift in der Resilienz gegenüber Isofluran-Toxizität, nachgewiesen durch zuverlässig reproduzierbare Versuchsbedingungen
Die Entdeckung einer graduellen quantitativen Veränderung der VGA-induzierten Mortalität bei separat kultivierten ND2360114-Fliegen ist ein Beispiel für die Nützlichkeit zuverlässiger Vergleiche der Anästhesiepharmakodynamik zwischen Versuchsgruppen, die die SAA verwenden. ND23 ist ein Gen, das für eine Untereinheit im Kern des Komplexes I des mETC kodiert (analog zu Ndufs8 bei Säugetieren)18. Mutationen in dieser Untereinheit sind eine Ursache für das Leigh-Syndrom, eine tödliche mitochondriale Erkrankung. Wir beobachteten eine allmähliche Abschwächung des Isofluran-induzierten Mortalitätsphänotyps im Laufe der Zeit in verschiedenen homozygoten ND2360114-Beständen , die gleichzeitig unter Standard-Laborbedingungen (d.h. ohne Exposition gegenüber VGAs) kultiviert wurden. Diese evolutionäre Anpassung an die Isofluran-Toxizität erfolgte ohne jegliche Exposition gegenüber VGAs und ist wahrscheinlich ein Kollateraleffekt des "Survival of the fittest" innerhalb der mutierten Bestände. Diese allmähliche Änderung der Isofluran-Sensitivität wäre unerkannt geblieben, wenn wir nicht darauf vertrauen hätten, dass die experimentellen Bedingungen über die Assays hinweg und im Laufe der Zeit identisch waren. Wir schlussfolgern, dass die Selektion Modifikatoren der Effekte von ND2360114 begünstigt, mit einer zufällig erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber Isofluran-Toxizität. Da Entzündungen im Zentralnervensystem eine wichtige Rolle in der Pathogenese des Leigh-Syndroms spielen, könnte die beobachtete Resistenzentwicklung auf adaptive Veränderungen in der angeborenen Immunentzündungsreaktion zurückzuführen sein, wobei die Resistenz gegen Isofluran-Toxizität ein zufälliges Nebenprodukt ist.

Abbildung 2: Variation der durch Isofluran-Toxizität induzierten Mortalität als Folge des evolutionären Drucks in ND2360114-Fliegen. Sieben Linien (A-G), die aus einer einzigen Population durch Einzelpaarpaarungen isoliert, erweitert und auf 24-Stunden-Mortalität (PM24) nach einer 2-stündigen Exposition mit 2% Isofluran (im Alter von 10-13 Tagen) getestet wurden, zeigen eine Variabilität im Phänotyp, die sich aus einer einzigen Population ergibt. Die Daten werden als Box- und Whisker-Diagramme angezeigt. Die Kästchen stellen das zweite und dritte Quartil der Daten dar, wobei sich die Whisker bis zu den minimalen und maximalen Datenpunkten erstrecken. Der Mittelwert und der Median werden durch "+" bzw. horizontale Linien angezeigt. Die prozentualen Sterblichkeiten der einzelnen Replikate (N) werden als Kreise dargestellt. N = 3-4 Fläschchen mit 20-50 Fliegen/Durchstechflasche. p-Wert für eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA; p = 0,012 weist auf einen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Repräsentatives Beispiel 2 (Abbildung 3): Illustration einer Hochdurchsatzanwendung der SAA zur Aufdeckung genetischer Hintergrundeffekte auf die Isofluran-Pharmakodynamik
Als Beispiel für den hohen Durchsatz des Systems veranschaulicht Abbildung 3 die Auswirkungen einer identischen Exposition gegenüber Isofluran (15 Minuten 2%iges Isofluran) vor einem Schädel-Hirn-Trauma (SHT)16, einem Protokoll zur Prüfung der Anästhesie-Vorkonditionierung (AP) in diesem fliegenden Modell13,15,19. Das Ergebnis ist die Mortalität 24 Stunden nach SHT, korrigiert um natürliche Fluktuation (MI24). In diesem Modell gewannen alle Fliegen innerhalb von 30 Minuten nach dem SHT ihre Mobilität zurück (d. h. sie waren am Leben), und die im MI24 aufgezeichnete Mortalität war eine Folge einer sekundären Hirnverletzung (sBI). In den vier Fliegenlinien reduzierte AP mit Isofluran den MI24 in unterschiedlichem Ausmaß, was darauf hindeutet, dass die Reaktionsfähigkeit auf AP ein quantitatives Merkmal ist. Da die Entzündungsreaktion ein wichtiger Faktor für die Morbidität von sBI ist, kann AP eine Modulation des Immunsystems beinhalten20.

Abbildung 3: Einfluss des genetischen Hintergrunds auf die Unterdrückung der Mortalität (MI24) durch Präkonditionierung mit Isofluran. Die Vorkonditionierung von Fliegen mit 15 min 2%igem Isofluran (violett) reduzierte den Mortalitätsindex nach 24 h (MI24) in den Stämmen w 1118 und y1w1118 (p < 0,0001 bzw. p = 0,036). Der MI 24 war in den vorkonditionierten Linien Oregon R (OR) und Canton S (CS) nicht signifikant niedriger (p = 0,16 bzw. p = 0,27). Die Daten werden als Box- und Whisker-Diagramme angezeigt. Die Kästchen stellen das zweite und dritte Quartil der Daten dar, wobei sich die Whisker bis zu den minimalen und maximalen Datenpunkten erstrecken. Der Mittelwert und der Median werden durch "+" bzw. horizontale Linien angezeigt. Die MI24-Werte der einzelnen Replikate (N) werden als Kreise dargestellt. N = 15-33 Durchstechflaschen mit 30-40 Fliegen/Durchstechflasche für SHT-behandelte Fliegen. N = 2-15 Durchstechflaschen mit 30-40 Fliegen/Durchstechflasche für unbehandelte Kontrollen. p-Werte aus einem ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.