Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

Summary

Hier beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung von bioaktiven Wirkstoffen, die Nanoscheiben enthalten. Amphotericin-B-Nanoscheiben werden als Beispiel genommen, um das Protokoll schrittweise zu beschreiben.

Abstract

Der Begriff Nanodisk bezieht sich auf eine diskrete Art von Nanopartikeln, die aus einer Doppelschicht, die ein Lipid bildet, einem Gerüstprotein und einem integrierten bioaktiven Wirkstoff besteht. Nanoscheiben sind als scheibenförmige Lipiddoppelschicht organisiert, deren Umfang durch das Gerüstprotein begrenzt wird, das normalerweise zur Familie der austauschbaren Apolipoproteine gehört. Zahlreiche hydrophobe bioaktive Wirkstoffe wurden in Nanoscheiben effizient gelöst, indem sie in das hydrophobe Milieu der Lipiddoppelschicht des Partikels integriert wurden, was zu einer weitgehend homogenen Population von Partikeln im Bereich von 10-20 nm Durchmesser führte. Die Formulierung von Nanoscheiben erfordert ein präzises Verhältnis der einzelnen Komponenten, eine geeignete sequenzielle Zugabe jeder Komponente, gefolgt von einer Badbeschallung der Formulierungsmischung. Das amphipathische Gerüstprotein kontaktiert und reorganisiert spontan die dispergierte Doppelschicht, die ein Lipid/bioaktives Wirkstoffgemisch bildet, um eine diskrete, homogene Population von Nanoscheibenpartikeln zu bilden. Während dieses Prozesses geht das Reaktionsgemisch von einem undurchsichtigen, trüben Aussehen in eine geklärte Probe über, die, wenn sie vollständig optimiert ist, beim Zentrifugieren keinen Niederschlag ergibt. Die Charakterisierungsstudien umfassen die Bestimmung der Solubilisierungseffizienz bioaktiver Wirkstoffe, Elektronenmikroskopie, Gelfiltrationschromatographie, UV/Vis-Absorptionsspektroskopie und/oder Fluoreszenzspektroskopie. Daran schließt sich in der Regel eine Untersuchung der biologischen Aktivität mit kultivierten Zellen oder Mäusen an. Im Falle von Nanodisks, die ein Antibiotikum (d. h. das Makrolid-Polyen-Antibiotikum Amphotericin B) enthalten, kann ihre Fähigkeit, das Wachstum von Hefen oder Pilzen in Abhängigkeit von Konzentration oder Zeit zu hemmen, gemessen werden. Die relativ einfache Formulierung, die Vielseitigkeit in Bezug auf die Komponenten, die nanoskalige Partikelgröße, die inhärente Stabilität und die wässrige Löslichkeit ermöglichen unzählige In-vitro - und In-vivo-Anwendungen der Nanodisk-Technologie . Im vorliegenden Artikel beschreiben wir eine allgemeine Methodik zur Formulierung und Charakterisierung von Nanodisks, die Amphotericin B als hydrophoben bioaktiven Wirkstoff enthalten.

Introduction

Entstehende diskoidale High-Density-Lipoproteine (HDLs) sind natürlich vorkommende Vorläufer des weitaus häufiger vorkommenden sphärischen HDL, das im menschlichen Kreislaufsystem vorkommt. Diese entstehenden Partikel, die auch als prä-ß-HDL bezeichnet werden, besitzen einzigartige und unverwechselbare strukturelle Eigenschaften¹. Tatsächlich existieren die entstehenden HDLs nicht als kugelförmige Partikel, sondern sind scheibenförmig. Umfangreiche strukturelle Charakterisierungsstudien an natürlichen und rekonstituierten diskoidalen HDLs haben gezeigt, dass sie aus einer Phospholipiddoppelschicht bestehen, deren Umfang durch ein amphipathische....

Protocol

1. Transformation, Expression und Aufreinigung der Gerüstproteinkomponente

1. BL21 bakterielle Transformation mit apoE4-NT enthaltendem Plasmid
   1. Tauen Sie ein Röhrchen mit BL21 (DE3)-kompetenten Zellen 10 Minuten lang auf Eis auf.
   2. Sobald das gesamte Eis geschmolzen ist, mischen Sie vorsichtig und pipettieren Sie vorsichtig 50 μl der Zellen in ein Transformationsröhrchen auf Eis.
   3. Fügen Sie der Zellmischung 5 μl mit 50 ng Plasmid-DNA (für die Sequenz siehe Ergänzende Tabelle 1) hinzu. Schnippen Sie das Röhrchen vorsichtig vier- oder fünfmal, um es zu mischen. Wirbeln Sie nicht.
   4. Die Mischung ....

Results

Bioaktiver Wirkstoff Nanodisk-Formulierungsprozess
Bei dem beschriebenen ampB-Nanodisk-Formulierungsverfahren gilt die Reaktion als abgeschlossen, wenn das Erscheinungsbild der Probe von trüb zu klar übergeht (Abbildung 1). Diese Veränderung deutet darauf hin, dass sich Nanoscheiben gebildet haben und der bioaktive Wirkstoff solubilisiert wurde. Häufig absorbieren bioaktive Wirkstoffe Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich (z. B. ampB, Curcumin, Lutein, Coenzym Q_10<.......

Discussion

Die Formulierung eines bioaktiven Wirkstoffs, der Nanoscheiben enthält, stellt eine bequeme Methode zur Solubilisierung ansonsten unlöslicher hydrophober Verbindungen dar. Da das Produkt nanoaktive Wirkstoff-Nanoscheiben in wässrigen Medien vollständig löslich sind, bieten sie eine nützliche Verabreichungsmethode für eine Vielzahl von hydrophoben Molekülen (Tabelle 1). Dazu gehören kleine Moleküle, natürliche und synthetische Medikamente, sekundäre Pflanzenstoffe, Hormone usw. Die Formulierungsstrategie .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulierung & Standardpräparation
Ampicillin	Fisher Scientific	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid	GenScript	N/A	Transformation
Baffled Flask	New Brunswick Scientific	N/A	Expansion & Expression
BL21 kompetente E. coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Zentrifugenflaschen	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulierung
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Präpartation
Dymyristoylphosphatidylcholin	Avanti Lipide	850345P	ND Formulierung
Erlenmeyerkolben	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Hefe-Viabilitäts-Assay
Glas-Borosilikat-Röhrchen	VWR	47729-570	ND
Formulation GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Hefe-Viabilitäts-Assay
Beheiztes Beschallungsbad	VWR	N/A	ND Formulaton
Heiz- und Stickstoffmodul	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Aufreinigung
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Zentrifuge	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor Beckman	Coulter	339247	Expression
Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulierung
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulierung
Stickstoffgas	Praxair	UN1066	ND Formulierung
NZCYM Medien	RPI Research Products	N7200-1000.0	Expansion & Ausdruck
Pet-22B Vektor	GenScript	N/A	Transformation
Petrischale	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation & Expansion
Quarzküvetten	Fisher Brand	14385 928A	Spektralanalyse
Schüttelbrutkasten	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, Expansion & Expression
Slide-A-Lyzer Bojen	Thermo Scientific	66430	Reinigung
SnakeSkin Dialyseschlauch	Thermo Scientific	68100	Reinigung
SnakeSkin Dialyseschlauch	Thermo Scientific	88243	Reinigung
Natriumchlorid	Fisher Scientific	S271	Reinigung
Natriumphosphat zweibasisch	Fisher Scientific	S374-500	Reinigung
Natriumphosphat monobasisch	Fisher Scientific	BP329-500	Reinigung
Spectra/POR gewichtete Verschlüsse	Spektrum Medizinische Industrie	132736	Reinigung
Spektralphotometer	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	Spektralanalyse
Tischzentrifuge	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Spektralanalyse
Vakuumfilter	Millipore	9004-70-0	Expression &
Reinigungs-Vakuumpumpe	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Aufreinigung
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulierung
Hefe	N/A	BY4741	Hefe-Viabilitätsassay
Hefeextrakt-Pepton-Dextrose	BD	242820	Hefe-Viabilitätsassay