Hier beschreiben wir eine Verbesserung der Semi-in-vitro (SIV) Methode zur Beobachtung der Pollenschlauchführung und -aufnahme bei Arabidopsis thaliana, die die Empfänglichkeit der Eizellen erhöht. Die Hochdurchsatz-SIV-cum-Septum-Methode kann mit Gametophyten-Markerlinien und genetisch kodierten Biosensoren gekoppelt werden, um den dynamischen Prozess der Befruchtung zu überwachen.
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Methodenartikel
Live-Bildgebung der Arabidopsis-Pollensondenaufnahme und Doppelbefruchtung mit der Semi-In-vitro-Cum-Septum-Methode
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bei Blütenpflanzen sind das Wachstum und die Führung des Pollenschlauchs (männlicher Gametophyt) innerhalb des Stempels und die Aufnahme des Pollenschlauchs durch den weiblichen Gametophyten essentiell für die Doppelbefruchtung und die anschließende Samenentwicklung. Die Interaktionen zwischen männlichen und weiblichen Gametophyten während der Pollenschlauchaufnahme gipfeln in einem Pollenschlauchriss und der Freisetzung von zwei Samenzellen, um eine doppelte Befruchtung zu bewirken. Da das Wachstum der Pollenschläuche und die doppelte Befruchtung tief im Gewebe der Blüte verborgen sind, ist dieser Prozess in vivo schwer zu beobachten.
Eine semi-in vitro (SIV) Methode zur Lebendzell-Bildgebung der Befruchtung in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurde entwickelt und in mehreren Untersuchungen umgesetzt. Diese Studien haben dazu beigetragen, die grundlegenden Merkmale aufzuklären, wie der Befruchtungsprozess in Blütenpflanzen abläuft und welche zellulären und molekularen Veränderungen während der Interaktion der männlichen und weiblichen Gametophyten auftreten. Da diese Lebendzell-Imaging-Experimente jedoch die Exzision einzelner Eizellen beinhalten, sind sie auf eine geringe Anzahl von Beobachtungen pro Bildgebungssitzung beschränkt, was diesen Ansatz mühsam und sehr zeitaufwändig macht. Neben anderen technischen Schwierigkeiten wird häufig über ein Versagen der Pollenschläuche bei der Befruchtung der Eizellen in vitro berichtet, was solche Analysen stark beeinträchtigt.
Hier wird ein detailliertes Videoprotokoll für die Bildgebung der Pollenschlauchaufnahme und -befruchtung in einer automatisierten und Hochdurchsatzmethode bereitgestellt, das bis zu 40 Beobachtungen der Pollenschlauchaufnahme und -ruptur pro Bildgebungssitzung ermöglicht. In Verbindung mit dem Einsatz von genetisch kodierten Biosensoren und Markerlinien ermöglicht diese Methode die Generierung großer Stichprobengrößen mit reduziertem Zeitaufwand. Nuancen und kritische Punkte der Technik, einschließlich der Inszenierung von Blüten, der Präparation des Mediums und der Bildgebung, werden im Videoformat klar detailliert beschrieben, um zukünftige Forschungen zur Dynamik der Pollenschlauchführung, -aufnahme und -befruchtung zu erleichtern.
Einleitung
Die Erzeugung genetisch einzigartiger Nachkommen in sexuell reproduzierenden Organismen hängt von der erfolgreichen Verschmelzung männlicher und weiblicher Gameten ab. Bei Blütenpflanzen hängt die Interaktion zweier männlicher Gameten (Samenzellen) mit zwei weiblichen Gameten (Eizelle und Zentralzelle) während der Doppelbefruchtung von der Spermienfreisetzung aus dem Pollenschlauch (dem männlichen Gametophyten) ab. Dieser Prozess, der als Pollenschlauchempfang bezeichnet wird, wird weitgehend von den synergistischen Zellen gesteuert, die sich im Embryosack befinden (dem weiblichen Gametophyten)1,2. Da die Poll....
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Protokoll
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Geräte.
1. Überlegungen zur Gestaltung des bildgebenden Experiments
- Legen Sie die Bilddauer und die Abtastfrequenz fest, die erforderlich sind, um das gewünschte zu beobachtende Phänomen zu erfassen. Nach dem Abtasttheorem von Nyquist muss die Abtastfrequenz beispielsweise größer als doppelt so hoch sein wie die höchste Frequenz der Eingabestichprobe. Um synergistische [Ca2+]cyt-Oszillationen genau zu erfassen, führen Sie daher etwa alle 10 s eine Bildgebung durch, aber um die Gesch....
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Ergebnisse
Um den Zeitpunkt der nuklearen Degeneration in der rezeptiven synergistischen in Bezug auf die Pollenschlauchruptur in Arabidopsis zu beurteilen und zu beobachten, ob die linke oder rechte synergistisch prädestiniert ist, die rezeptive synergistisch zu werden, wurde die hier beschriebene SIV-cum-Septum-Methode unter Verwendung eines weiblichen Gametophyten-Kernmarkers verwendet, der mit einem synergistischen zytosolischen Marker (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) als Septumspender und e.......
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Diskussion
Dieses Manuskript stellt ein effizientes Protokoll für die Bildgebung der Pollenschlauchaufnahme und der Doppelbefruchtung bei Arabidopsis vor. Die verbesserte Methode, SIV cum septum, erhöht den Prozentsatz und die Gesamtzahl der erfolgreichen Pollenschlauch-Empfangsereignisse, die pro Bildgebungssitzung beobachtbar sind, erheblich. Die hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse zeigen eine Bildgebungssitzung mit 41 erfolgreichen Pollenschlauchempfangsereignissen und 10 Eizellen, die Empfangsdefekte auf.......
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Offenlegungen
Die Autoren berichten über keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Sara Simonini und Stefano Bencivenga für die Spende des pFG:roGFP2-ORP1-NLS-Konstrukts und Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter und Celia Baroux für ihre Beratung zur Mikroskopie. Wir danken den Ratschlägen von Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima und allen anderen auf der International Conference on Sexual Plant Reproduction 2022, die Interesse an einem Protokoll über SIV cum Septum gezeigt haben. Diese Arbeit wurde von der Universität Zürich und Beiträgen des Schweizerischen Nationalfonds an die U.G.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mm Glasschiene | Epredia | ||
| 35 mm Glasbodenschale (14 mm Vertiefung) | Mattek | P35G-1,5-14-C | |
| Calciumchlorid | Roth | CN93.1 | |
| Kolumbien (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | Stigma-Spender | |
| Dissektionsbereich | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulinnadel (0,3 g) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | Septumspender | |
| Magnesiumsulfat | Merck | 5886 | |
| Kaliumchlorid | Roth | 6781.1 | |
| Rasierklinge | Beldura | 7026797 | |
| Scotch doppelseitiges Klebeband | Scotch | 768720 | Weniger dickflüssig und gut für die Narbendissektion |
| Natriumchlorid | Roth | 3957.1 | |
| Saccharose | ITW Reagenzien | A2211,1000 | |
| Tesa doppelseitiges Klebeband | Tesa | 05681-00018 | Sehr klebrig und gut für die Septumdissektion |
| Agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
Referenzen
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
