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Methodenartikel

Osmotische Minipump-Implantation zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor der Maus

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DOI:

10.3791/65169

⸱

7. April 2023

 , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes and Metabolism, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor cerebrospinalis (CSF) von Mäusen. Dieser Ansatz kann nützlich sein, um die Auswirkungen einer hohen Liquorglukose auf die Neurodegeneration, die Kognition und den peripheren Glukosestoffwechsel bei Mäusen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Diabetes erhöht das Risiko eines kognitiven Verfalls und beeinträchtigt die Gehirnfunktion. Ob dieser Zusammenhang zwischen hohem Glukosespiegel und kognitiven Defiziten ursächlich ist oder nicht, bleibt unklar. Darüber hinaus ist auch unklar, ob diese Defizite durch einen Anstieg des Glukosespiegels im Liquor und/oder Blut vermittelt werden. Es gibt nur sehr wenige Studien, die die direkten Auswirkungen eines hohen Liquorglukosespiegels auf die Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS), insbesondere auf das Lernen und das Gedächtnis, untersuchen, da die aktuellen Diabetesmodelle nicht ausreichend entwickelt sind, um solche Forschungsfragen zu beantworten. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur chronischen Erhöhung des Liquorglukosespiegels für 4 Wochen durch kontinuierliche Infundierung von Glukose in den Seitenventrikel mit osmotischen Minipumpen bei Mäusen. Das Protokoll wurde durch die Messung des Glukosespiegels im Liquor validiert. Dieses Protokoll erhöhte den Liquorglukosespiegel auf ~328 mg/dl nach Infusion einer 50%igen Glukoselösung bei einer Flussrate von 0,25 μl/h, verglichen mit einer Liquorglukosekonzentration von ~56 mg/dl bei Mäusen, die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) erhielten. Darüber hinaus hatte dieses Protokoll keinen Einfluss auf den Blutzuckerspiegel. Daher kann diese Methode verwendet werden, um die direkten Auswirkungen einer hohen Liquorglukose auf die Gehirnfunktion oder eine bestimmte Nervenbahn unabhängig von Veränderungen des Blutzuckerspiegels zu bestimmen. Insgesamt wird der hier beschriebene Ansatz die Entwicklung von Tiermodellen erleichtern, um die Rolle einer hohen Liquorglukose bei der Vermittlung von Merkmalen der Alzheimer-Krankheit und/oder anderer neurodegenerativer Erkrankungen im Zusammenhang mit Diabetes zu testen.

Einleitung

Sowohl Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes beeinträchtigen die Gehirnfunktion 1,2,3. Zum Beispiel erhöht Diabetes das Risiko für kognitiven Verfall und neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit 3,4. Darüber hinaus haben Menschen mit Diabetes eine gestörte Glukosewahrnehmung im Gehirn 5,6. Dieser Defekt trägt zur Pathogenese der Hypoglykämie-assoziierten Unwissenheit und einer unzureichenden gegenregulatorischen Reaktion auf Hypoglykämie bei7,8, die tödlich sein kann, wenn sie nicht sofort behandelt wird.

In Anbetracht der Tatsache, dass Diabetes den Glukosespiegel sowohl im Blut als auch im Liquor cerebrospinalis (CSF)9 erhöht, ist es wichtig festzustellen, ob einer oder beide dieser Faktoren zu einer Beeinträchtigung der Gehirnfunktion beitragen. Ob Diabetes allein durch einen hohen Liquorglukosespiegel oder in Kombination mit anderen Faktoren wie Insulinmangel oder Insulinresistenz Hirnschäden verursacht, ist ebenfalls eine offene Frage. Tiermodelle für Typ-1- und Typ-2-Diabetes zeigen neben einem gestörten Energiehaushalt und peripheren Glukosestoffwechsel auch kognitiven Verfall und Neurodegeneration10,11,12,13. Aus diesen Modellen ist es jedoch nicht möglich, die selektiven Effekte von hohen Liquorglukose- und Blutzuckerspiegeln bei der Vermittlung der Komplikationen von Diabetes auf die Gehirnfunktion zu entkoppeln.

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Entwicklung eines Mausmodells für Hyperglykorrhachie, um die Auswirkungen chronisch hoher Liquorglukosespiegel auf die Gehirnfunktion, den Energiehaushalt und die Glukosehomöostase zu testen. Das mit dieser Technik entwickelte Mausmodell stellt ein Werkzeug für Studien dar, die die ätiologische Rolle der dysregulierten Glukosehomöostase auf die neuronale und Verhaltensfunktion untersuchen.

Daher wird der vorgeschlagene Ansatz nützlich sein, um die direkten Auswirkungen erhöhter Liquorglukosespiegel bei verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen zu verstehen.

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Protokoll

Alle Mausverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Rochester genehmigt und gemäß den Richtlinien des US Public Health Service für die humane Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Sechs Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse, die für diese Studie verwendet wurden, wurden kommerziell beschafft. Alle Tiere wurden in Gruppen (5 Mäuse pro Käfig) in einem Raum mit einem 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklus untergebracht und erhielten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Nachdem den Mäusen eine Kanüle zur Infusion von Glukose in den Seitenventrikel implantiert worden war, wurden sie einzeln untergebracht, um Schäden an den Implantaten durch andere Mäuse zu vermeiden.

1. Montage osmotischer Minipumpen

  1. Bereiten Sie künstlichen Liquor cerebrospinalis (aCSF) gemäß dem folgenden Protokoll vor. NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g),CaCl 2,2H2O (0,206 g) und MgCl2,6H2O (0,163 g) werden in 500 ml sterilem Wasser gelöst, um Lösung A herzustellen. Na2HPO 4,7H2O (0,214 g) und NaH2PO 4 lösen. H2O(0,027 g) in 500 ml sterilem Wasser zur Herstellung von Lösung B. Mischen Sie dann Lösung A und B im Verhältnis 1:1, um den aCSF herzustellen.
    HINWEIS: Diese Formulierung von aCSF enthält keine Glukose.
  2. Zur Herstellung der 50%igen Glukoselösung 50 g Glukose zu 50 ml Liquor in ein Becherglas geben. Stellen Sie das Becherglas auf eine Kochplatte und bringen Sie die Temperatur der Suspension auf 60 °C. Mischen Sie die Suspension mit einem Magnetrührer, bis sich die Glukose vollständig aufgelöst hat.
  3. Geben Sie aCSF in das Becherglas, um das endgültige Volumen auf 100 ml zu erhöhen. Führen Sie die Lösung durch einen 0,22 μm Porenfilter, um sie zu sterilisieren.
  4. Bereiten Sie eine 0,9%ige Kochsalzlösung (NaCl) vor und passieren Sie die Lösung durch den 0,22-μm-Filter.
  5. Legen Sie alle Komponenten der Minipumpe und des Infusionssets in eine sterile Schale und schneiden Sie den Schlauch des Gehirninfusionssets mit einer sterilen Schere auf 1 Zoll Länge. Halten Sie den Schlauch mit einem sterilen Hämostat fest und schieben Sie ihn auf die Oberseite eines Endes der Kanüle. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit der Oberseite des Durchflussmodulators. Bedecke beide Enden des Schlauchs mit etwas Kleber, um eine stärkere Verbindung zu erhalten.
  6. Befestigen Sie eine 27-g-Nadel an einer 1-ml-Spritze und füllen Sie sie entweder mit aCSF oder der Glukoselösung. Führen Sie die 27-G-Nadel in ein kleines Stück Schlauch ein. Schließen Sie dann den Schlauch an das offene Ende des Durchflussmodulators an und füllen Sie ihn mit der entsprechenden Lösung, bis Tropfen der Lösung aus der Kanüle austreten. Entfernen Sie alle Luftblasen, die im Schlauch eingeschlossen sind.
  7. Um die Minipumpe zu befüllen, halten Sie die Pumpe aufrecht und führen Sie die Spritzennadel in die Pumpe ein. Füllen Sie es mit der entsprechenden Lösung, bis sich an der Öffnung der Minipumpe ein Tropfen der Lösung bildet.
  8. Setzen Sie den Durchflussmodulator langsam in die Pumpe ein und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Baugruppe gelangen.
  9. Nachdem die osmotischen Minipumpen zusammengebaut sind, füllen Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Füllen Sie den Schlauch mit der sterilen Kochsalzlösung, so dass die Pumpen vollständig eingetaucht sind, und achten Sie darauf, dass die Kanüle nicht in die Kochsalzlösung gelangt. Vier solcher zusammengebauten Pumpen können in einem 50-ml-Röhrchen untergebracht werden.
  10. Setzen Sie die Kappe locker auf jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Pumpen bei 37 °C, um sie mindestens 48 h lang anzusaugen.

2. Operation zur Implantation osmotischer Pumpen

  1. Präoperativer Eingriff
    1. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven und lassen Sie sie vor Gebrauch mindestens 30 Minuten abkühlen. Die Autoklavenbedingungen beinhalten eine Dampfsterilisation bei 121 °C für 30 Minuten.
    2. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Knöpfe, Ohrbügel und die stereotaktische Rahmenoberfläche ab.
      Anmerkungen: Die Operation sollte in einer aseptischen Umgebung durchgeführt werden, wobei zu beachten ist, dass während der Operation keine unsterilen Oberflächen berührt werden. Ersetzen Sie die Handschuhe, wenn der Verdacht auf eine Kontamination besteht.
    3. Legen Sie die Maus in eine Anästhesiekammer, um sie 3-5 Minuten lang mit 3% Isofluran an der Luft zu betäuben. Nehmen Sie dann die Maus aus der Kammer und legen Sie sie auf ein steriles Tuch. Halten Sie die Anästhesie über einen Nasenkegel bei 1,5%-2%.
    4. Kneifen Sie die Hinterpfote der Maus zusammen, um einen Reflex zu beobachten und die Narkosetiefe zu überprüfen.
    5. Injizieren Sie 5 mg/kg Carprofen subkutan zur Analgesie.
    6. Verwenden Sie eine saubere Haarschneidemaschine, um den Operationsbereich am Mauskopf zu befestigen. Reiben Sie die Kopfhaut zuerst mit Povidon-Jod-Lösung und dann mit Alkoholtupfern gründlich für mindestens 2 Minuten ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens dreimal.
    7. Tragen Sie ein Augengleitmittel auf, um zu verhindern, dass die Augen während der Operation austrocknen.
  2. Chirurgie
    1. Setzen Sie die Maus auf den stereotaktischen Rahmen und setzen Sie den Kopf auf die Schneidezahnstange. Bedecken Sie die Nase mit dem Nasenkegel. Bringen Sie sterile Abdeckungen an, um den Operationsbereich zu sichern.
    2. Verlagern Sie den Isofluranfluss auf den Nasenkegel. Halten Sie die Anästhesie weiterhin bei 1,5%-2% Isofluran.
    3. Legen Sie ein Heizkissen unter die Maus, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
    4. Ziehen Sie neue sterile Handschuhe an und machen Sie mit einem Skalpell einen Mittellinienschnitt (~10-15 mm lang) auf der Kopfhaut. Lege die Schädeloberfläche mit einem Spatel frei, während du Wattestäbchen verwendest, um Blutungen abzuwischen.
      Anmerkungen: Verwenden Sie einen Kauterisator, wenn Sie stark bluten, was selten vorkommt.
    5. Reiben Sie mit einer in 3%iges Wasserstoffperoxid getauchten Wattespitze, um die Schädelnähte freizulegen.
    6. Notieren Sie sich Bregma und Lambda, um in den Schädelkoordinaten zu navigieren. Setzen Sie alle Koordinaten bei bremma auf Null.
      HINWEIS: Diese Koordinaten stammen aus einem Mausgehirnatlas14. Der Referenzabstand zwischen Bregma und Lambda im Atlas beträgt 4,21 mm. Um alters- und geschlechtsbedingte Unterschiede in der Schädelgröße zu korrigieren, wurde der Bregma-Lambda-Abstand für jede Maus gemessen und dann durch 4,21 mm geteilt, um einen Multiplikationsfaktor zu erhalten. Wenn beispielsweise der Abstand zwischen Bregma und Lambda 4,65 mm beträgt, ergibt die Division durch 4,21 mm einen Multiplikationsfaktor von 1,10. Alle Koordinaten aus dem Atlas wurden dann mit diesem Faktor multipliziert, um die tatsächlichen Koordinaten zu messen, die zum Bohren des Lochs verwendet wurden. Im obigen Beispiel wären die resultierenden anterior-posterioren (AP) und medial-lateralen (ML) Koordinaten 0,55 bzw. 1,1 mm (d. h. 1,1 x 0,5 oder 1 mm).
    7. Verwenden Sie eine Bohrmaschine, um ein Loch an diesen Koordinaten zu bohren: 0,5 mm posterior zu Bremma und 1 mm seitlich zur Mittellinie nach rechts.
      HINWEIS: Achten Sie beim Bohren des Lochs im Schädel darauf, dass die Dura mater nicht reißt. Stellen Sie sicher, dass der Bohrer steril ist. Es kann zur Sterilisation mit anderen Instrumenten in denselben Autoklavenbeutel gelegt werden.
    8. Führen Sie ein Hämostat unter die eingeschnittene Haut ein und schieben Sie es an die Stelle, an der die osmotische Minipumpe implantiert werden soll. Öffnen und schließen Sie das Hämostat vorsichtig, um eine Tasche für die Minipumpe zu schaffen.
    9. Verwenden Sie ein steriles Hämostat, um eine vorbereitete osmotische Minipumpe von der Spitze des Durchflussmodulators zu entnehmen. Schieben Sie die Pumpe durch die eingeschnittene Haut in die Tasche.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, dass die Pumpe und die Kanüle keine unsterile Oberfläche berühren.
    10. Tragen Sie etwas Kleber auf die Unterseite der Kanüle auf und fixieren Sie sie im Kanülenhalter. Senken Sie die Kanüle langsam durch das gebohrte Loch 2 mm ventral auf die Schädeloberfläche. Lassen Sie es dort mindestens 5 Minuten einwirken, damit sich der Kleber verfestigen kann.
    11. Bevor Sie die Kanüle in das Gehirn einführen, vergewissern Sie sich, dass die Kanüle nicht verstopft ist und die Lösung richtig fließt.
      Anmerkungen: Manchmal kann sich aufgrund einer sehr geringen Flussrate Glukose an der Spitze der Kanüle ablagern und den Fluss blockieren.
    12. Schneiden Sie mit Hilfe einer Schere die Oberseite der Kanüle ab, um sicherzustellen, dass sie sich nicht von der Schädeloberfläche löst.
    13. Decken Sie die Kanüle mit einer Schicht Zahnzement ab, um zusätzlichen Halt zu erhalten.
    14. Verwenden Sie Nylonnähte (Größe 5-0 und 30 Zoll Länge), um die Wunde zu schließen, und tragen Sie ein topisches Antibiotikum auf die Wunde auf, um eine Infektion zu verhindern.
    15. Schalten Sie Isofluran aus und lassen Sie das Tier sich von der Narkose erholen. Setzen Sie das Tier dann in einen neuen, sauberen Käfig um.
  3. Nachsorge
    1. Überwachen Sie die Maus nach der Operation mindestens 1 Woche lang.
    2. Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen subkutan einmal alle 24 Stunden für drei Tage nach der Operation.
    3. Lassen Sie die Wunde vollständig heilen, bevor Sie die Fäden 7-10 Tage nach der Operation entfernen.
      HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass Mäuse mit hohem Liquorglukosespiegel länger brauchten, um zu heilen. Das Trimmen von Krallen an den Hinterpfoten der Maus minimiert die Wahrscheinlichkeit einer Verletzung der Einschnittstelle aufgrund des Kratzverhaltens von Mäusen.

3. Austausch der Minipumpen

HINWEIS: Da die in dieser Studie verwendeten Minipumpen nur 4 Wochen halten, wurde auch der Austausch von Minipumpen getestet, um die Dauer der Glukoseinfusion zu verlängern, wie es bei Langzeitstudien erforderlich sein kann. Dies umfasste die folgenden Schritte.

  1. Bereiten Sie die Mäuse wie oben beschrieben auf die Operation vor.
  2. Machen Sie einen kleinen vertikalen Schnitt von 1 cm in der Haut etwas oberhalb der Pumpe.
  3. Führen Sie ein Hämostat unter die eingeschnittene Haut ein und ziehen Sie die Pumpe heraus.
  4. Entfernen Sie die Pumpe aus dem Schlauch und schließen Sie eine neue angesaugte Pumpe an den Schlauch an.
  5. Setzen Sie die Pumpe wieder ein und nähen Sie die Haut.
  6. Befolgen Sie die gleichen Pflegeanweisungen nach der Operation wie oben beschrieben.

4. Verfahren zur Sammlung des Liquors

  1. Präparat
    1. Ziehen Sie Glaskapillaren mit einem Durchmesser von 1 mm mit einer Mikropipettenabziehmaschine, um Spitzen mit einem Durchmesser von 0,5 mm zu erhalten. Die Einstellungen sind: Wärme = 800, Zug = 15, Geschwindigkeit = 5 und Zeit = 200 Einheiten. Legen Sie die gezogenen Kapillaren bis zur Verwendung in eine sterile Schachtel.
    2. Befestigen Sie eine 27-g-Nadel an einer 1-ml-Spritze. Führen Sie die gezogene Kapillare in die Nadel ein und verwenden Sie ein kleines Klebeband, um die Verbindung zu sichern.
    3. Fixieren Sie die Spritze fest in einem Kapillarhalter eines Mikromanipulators.
    4. Bereiten Sie als Nächstes die Maus auf die Operation vor, wie oben im voroperativen Verfahren beschrieben.
  2. Chirurgischer Eingriff
    1. Platzieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Rahmen. Nachdem Sie den Kopf wie zuvor beschrieben am Rahmen befestigt haben, drehen Sie die Knöpfe, um den Kopf so zu neigen, dass die Nase nach unten zeigt. Bringen Sie sterile Abdeckungen an, um den Operationsbereich zu sichern.
    2. Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der dorsalen Oberfläche, beginnend von der intraauralen Ebene bis zur kaudalen Seite.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, den Schlauch beim Einschnitt nicht zu beschädigen.
    3. Entfernen Sie die Stütze vom Mauskörper und lassen Sie die Maus senkrecht ruhen, so dass der Hals nach hinten vollständig gestreckt ist.
    4. Mit Hilfe einer gebogenen stumpfen Pinzette halbieren Sie die hinteren Nackenmuskeln sanft von der Mittellinie aus, um ein kleines Fenster zu schaffen. Verwenden Sie dann einen feuchten Applikator mit Wattespitzen, um die Nackenmuskulatur sanft von der Mittellinie zur Peripherie zu verschieben.
    5. Beobachten Sie, ob die Cisterna magna freiliegt, die als dreieckiges Fenster mit einer transparenten Dura-Membran erscheint.
    6. Platzieren Sie die Mikromanipulatorbaugruppe auf dem stereotaktischen Rahmen neben der Maus und achten Sie darauf, dass die Kapillarspitze keine Oberfläche berührt.
    7. Brechen Sie die Kapillarspitze vorsichtig auf, ohne das Setup zu stören.
    8. Während Sie in die Lupe schauen (2,25-fache Vergrößerung), drehen Sie die entsprechenden Knöpfe am Mikromanipulator, um die Kapillarspitze langsam auszurichten und in Richtung der Cisterna Magna zu bewegen.
    9. Ein gewisser Widerstand ist zu spüren, sobald die Kapillarspitze die Membran der Cisterna magna berührt. Drücken Sie die Spitze mit Hilfe der Noppen sehr langsam gegen die Membran.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, keine Blutgefäße in der Membran zu beschädigen. Dieser Schritt ist sehr wichtig, um eine Blutkontamination im Liquor zu vermeiden.
    10. Stechen Sie sehr vorsichtig in die Membran. Der Liquor beginnt aufgrund des Unterdrucks in der Kapillare sofort in die Kapillare zu fließen.
    11. Lassen Sie den Aufbau einige Minuten stehen, bis ~10 μl Liquor in der Kapillare gesammelt sind.
    12. Ziehen Sie dann langsam die Kapillare aus der Cisterna Magna heraus und drücken Sie einen sterilen Applikator mit Wattestäbchen vorsichtig gegen die Öffnung der Cisterna Magna, um ein Auslaufen des Liquors zu verhindern.
    13. Entfernen Sie vorsichtig die Kapillare aus der Spritze und befestigen Sie sie an einem Mikrokappen-Bulb-Dispenser. Drücken Sie auf die Glühbirne, um den Liquor in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
    14. Platzieren Sie eine Stütze unter der Maus und drehen Sie die stereotaktischen Knöpfe, um den Kopf auszurichten.
    15. Verschließen Sie die Wunde mit Nylonnähten.
    16. Injizieren Sie 300 μl sterile Kochsalzlösung subkutan, bevor Sie die Maus aus dem Gerät nehmen.
    17. Pflegen Sie die Tiere wie oben beschrieben, bis es Zeit ist, die Fäden zu entfernen - ~ 7-10 Tage nach der Operation.

5. Glukose-Assay

  1. Befolgen Sie das Protokoll, wie es im kolorimetrischen Glukose-Assay-Kit beschrieben ist.
  2. Die im Kit enthaltene Natriumphosphat-Pufferlösung wird in Reinstwasser auf eine Konzentration von 50 mM verdünnt.
  3. Bereiten Sie Glukosestandards in den Bereichen 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 und 50 mg/dl aus der im Kit enthaltenen 1.000 mg/dl Stammlösung in verdünnter Pufferlösung vor.
  4. Bereiten Sie eine 7-fache Verdünnung der Liquorproben im Puffer vor. Wenn beispielsweise das gesammelte Gesamtvolumen des Liquors 10 μl beträgt, beträgt das siebenfach verdünnte Volumen 70 μl.
  5. Pipettieren Sie 15 μl Glukosestandards und verdünnten Liquor in Duplikaten in eine 96-Well-Platte.
  6. Pipettieren Sie 85 μl verdünnten Puffer in jede der Vertiefungen mit Standards und Liquor.
  7. Geben Sie 6 ml verdünnten Puffer in die Durchstechflasche mit der kalorimetrischen Glukoseenzymmischung und wirbeln Sie sie einige Sekunden lang, um sie gründlich zu mischen.
  8. Geben Sie 100 μl der Enzymmischung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu starten.
  9. Verschließen Sie die Platte mit einer Abdeckfolie und klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Reagenzien zu mischen.
  10. Stellen Sie die Platte für 10 Minuten in einen Inkubator bei 37 °C. Fläschchen mit hohem Glukosespiegel beginnen sich sofort violett zu verfärben.
  11. Entfernen Sie nach 10 Minuten die Abdeckung und messen Sie die Absorption bei 500-520 nm mit einem Plattenleser.
  12. Berechnen Sie die Glukosekonzentration in den Liquorproben, indem Sie ihre Werte aus der Standardkurve interpolieren.

6. Blutzuckertest

  1. Machen Sie mit einer Rasierklinge einen kleinen seitlichen Schnitt in den Mausschwanz und verwenden Sie einen Tropfen Blut, um den Blutzucker mit einem Blutzuckermessgerät gemäß den Anweisungen der Bedienungsanleitung zu messen.

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Ergebnisse

Männlichen Mäusen wurde eine Kanüle implantiert, die an eine osmotische Minipumpe angeschlossen war (Abbildung 1), um einen Liquor oder eine 50%ige Glukoselösung in ihre Seitenventrikel zu infundieren (Abbildung 2). Der Liquor wurde 10 Tage nach der Operation entnommen (Abbildung 3), um die Wirksamkeit dieses Verfahrens zu validieren. Die Ergebnisse zeigten einen Anstieg des Liquorglukosespiegels (Mittelwert: 327,7 mg/dl) bei Mäusen...

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Diskussion

Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll zur Erhöhung der Liquorglukose bei Mäusen durch die Verwendung osmotischer Minipumpen, die an eine Kanüle angeschlossen sind, die in den Seitenventrikel implantiert wird. Die chronische Infusion von Glukose in das Mäusegehirn durch dieses Verfahren wird nützlich sein, um die Auswirkungen einer langfristigen Hyperglykorrhachie auf die Kognition, den systemischen Glukosestoffwechsel und den Energiehaushalt zu beschreiben und die Pathogenese von Diabeteskomplikatione...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

National Institutes of Health gewähren DK124619 an KHC.

Anschubfinanzierung und Pilotforschungspreis, Department of Medicine, University of Rochester, NY, an KHC.

Der Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, University of Rochester, an KHC.

Forschungspreis der Universität, Büro des Vizepräsidenten für Forschung, Universität Rochester, NY, an KHC.

MUR entwarf und führte die Methode durch, analysierte die Ergebnisse, erstellte Grafiken und Abbildungen und schrieb und redigierte das Manuskript. KHC konzipierte und betreute die Studie, analysierte die Ergebnisse und schrieb und redigierte das Manuskript. KHC ist der Garant für diese Arbeit. Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung des Manuskripts zu.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m SpritzenfilterMembranlösungenSFPES030022S
1 mL sterile Spritze (Luer-Lok-Spitze)BD309628
1 mL TB SpritzeBD309659
100 mL GlasbecherglasFisher N/a
100% Ethanol (Koptec)DLIUN170Verwenden Sie eine 70%ige Verdünnung, um den Operationsbereich zu reinigen
50 mL konisches RöhrchenFisher N/A
ZündanzeigerKOPF1905
Alzet Gehirn InfusionskitDURECTKit # 3; 0008851Schlauch im Kit auf 1 Zoll Länge schneiden
Alzet osmotische PumpeDURECT2004Durchflussmenge 0,25 µ L/h
AnästhesiesystemKent ScientificSomnoSuite
Betadine LösungAvrio HealthN/A
CaCl2 . 2H2OFisher C79-500
KanülenhalterKOPF1966
ZentrierendoskopKOPF1915
Dental Cement LiquidLang Dental REF1404
Dental Zement PulverLang DentalREF1220-C
D-Glukose   SigmaG8270
Elektrische BohrmaschineKOPF1911Beim Bohren eines Lochs ein Reißen der Dura Mater vermeiden
Augenschmiermittel (Optixcare)CLC MedicaN/A
Glasperlensterilisator (Germinator 500)VWR101326-488Legen Sie Instrumente vor der Operation in steriles Wasser, um sie abkühlen zu lassen
Glukose-Assay-KitCayman chemisches10009582
H2O2SigmaH1009-500ml3% H2O2 auf die Schädeloberfläche auftragen, um die Schädelnähte sichtbar zu machen.
HaarschneiderWAHL N/A
HeizkissenHeatpax19520483
HämostatN/AN/A
Isofluran (Fluriso)ZoetisNDC1385-046-60
KClVWR0395-500g
Magnetischer StänderWPIM1
Vergrößerungs-SchreibtischleuchteBrightechLightView Pro Flex 2
MetallspatelN/AN/A
MgCl2 . 6H2OFisher BP214-500
Mikromanipulator (Rechtshänder)WPIM3301R
Mikromanipulator mit DigitalanzeigeKOPF1940
Na2HPO4 . 7H2OFisher S373-500
NaClSigmaS7653-5Kg
NaH2PO4 . H2OFisher S369-500
NeosporinJohnson & JohnsonN/ATopische Salbe zur Vorbeugung von Infektionen auftragen
ParafilmBemisDM-999
Rimadyl (Carprofen) 50mg/mlZoetisN/A5 mg/kg, subkutan, zur Analgesie
SkalpellN/AN/A
Stereotaktisches AllignmentsystemKOPF1900
Sterile 27-Gauge-NadelBD305109
Sterile Wattestäbchen-Applikatoren (Solon)AMD Medicom56200
Sterile Nylonnähte (5.0)OasisMV-661Verwenden Sie zum Verschließen der Wunde ein nicht absorierbares Nahtmaterial
Sterile scharfe Schere N/AN/A
Sterile OP-KlingenVWR55411-050
OP-Handschuhe (Nitril)AmmexN/AHandschuhwechsel bei Verdacht auf Kontamination
TablettN/AN/A

Referenzen

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