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Methodenartikel

Mikro-CT-Bildgebung und morphometrische Analyse von Neugeborenengehirnen von Mäusen

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DOI:

10.3791/65180

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19. Mai 2023

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1Unidad Ejecutora de Estudios en Neurociencias y Sistemas Complejos (ENyS, CONICET-UNAJ-HEC), 2Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 4Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt die Schritte zur Gewinnung hochauflösender Bilder von neugeborenen Mäusegehirnen durch die Kombination von Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) und einem Kontrastmittel in ex vivo-Proben . Wir beschreiben grundlegende morphometrische Analysen, um die Größe und Form des Gehirns in diesen Bildern zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Neurobilder sind ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Gehirnmorphologie in Experimenten mit Tiermodellen. Die Magnetresonanztomographie (MRT) hat sich zur Standardmethode für Weichteile entwickelt, obwohl ihre geringe räumliche Auflösung für Kleintiere einige Grenzen mit sich bringt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung hochauflösender dreidimensionaler (3D) Informationen über Gehirne und Schädel von Mäusen bei Neugeborenen mittels Mikro-Computertomographie (Mikro-CT). Das Protokoll umfasst die Schritte, die erforderlich sind, um die Proben zu sezieren, das Gehirn zu färben und zu scannen und morphometrische Messungen des gesamten Organs und der interessierenden Regionen (ROIs) zu erhalten. Die Bildanalyse umfasst die Segmentierung von Strukturen und die Digitalisierung von Punktkoordinaten. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Kombination von Mikro-CT und Lugol-Lösung als Kontrastmittel eine geeignete Alternative für die Darstellung der perinatalen Gehirne von Kleintieren darstellt. Dieser Bildgebungs-Workflow hat Anwendungen in der Entwicklungsbiologie, Biomedizin und anderen Wissenschaften, die daran interessiert sind, die Auswirkungen verschiedener genetischer und umweltbedingter Faktoren auf die Gehirnentwicklung zu bewerten.

Einleitung

Die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) ist ein wertvolles Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche. In der Biologie eignet es sich aufgrund der Röntgenabsorption in mineralisiertem Gewebe besonders für die Knochenforschung. Aufgrund dieser Eigenschaft wurden verschiedene Fragestellungen u.a. zur Knochenentwicklung1, zum Stoffwechsel2 und zur Evolution 3,4 mit Hilfe der Mikro-CT angegangen. Im Jahr 2008 zeigten de Crespigny et al.5, dass Mikro-CT-Bilder von erwachsenen Mäuse- und Kaninchengehirnen mit Jod als Kontrastmittel erhalten werden konnten. Diese Arbeit eröffnete eine neue Anwendung für diese bildgebende Technik, da Jod die Aufnahme von Bildern von Weichteilen ermöglichte, die sonst unempfindlich gegenüber Röntgenstrahlen wären. Das allgemeine Ziel der Kombination von Mikro-CT und einem jodbasierten Kontrastmittel ist es daher, hochauflösende Bilder zu erhalten, in denen Weichteile auf meso- oder makroanatomischer Ebene unterschieden und identifiziert werden können.

Diese Technik hat ein bemerkenswertes Potenzial für Studien, die eine detaillierte phänotypische Ex-vivo-Charakterisierung kleiner Proben wie Mausembryonen erfordern, die in experimentellen Designs weit verbreitet sind6. Jodkontrast in Kombination mit Mikro-CT-Bildgebung wurde verwendet, um volumetrische Quantifizierungen von Organen7 und dreidimensionalen (3D) Strukturen 8,9 zu erhalten. In den letzten Jahren wurde das Mikro-CT-Scannen von gefärbten Proben angewendet, um phänotypische Merkmale des Gehirns von Nagetieren zu beschreiben10, und es wurden verschiedene Verbesserungen der Technik vorgeschlagen. Für erwachsene Gehirne wurde festgestellt, dass ein Protokoll von 48 Stunden Eintauchen in Jod mit einem vorherigen Perfusionsschritt mit einem Hydrogel Bilder von hoher Qualität lieferte11. Gignac et al.12 erweiterten die Grenzen dieser Technik, indem sie zeigten, dass mit Jod gefärbte Rattengehirne verarbeitet werden können, um histologische Routinetechniken durchzuführen. In ähnlicher Weise zeigen diese Verfahren vielversprechende Ergebnisse für embryonale und vorentwöhnte Nagetiergehirne 8,13,14,15.

Obwohl die Neurowissenschaften weitgehend mikroskopbasierte Techniken angewendet haben, um verschiedene strukturelle und funktionelle Aspekte der Gehirnentwicklung zu bewerten, eignen sich solche Studien eher zur Charakterisierung spezifischer Zellpopulationen oder räumlich begrenzter Strukturen. Umgekehrt ermöglicht die Mikro-CT-Bildgebung die Beschreibung ganzer Strukturen und die Erfassung von 3D-Modellen, die relevante räumliche Informationen erhalten, was eine Ergänzung zu mikroskopischen Techniken darstellt. Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist auch eine Standardtechnik, die zur Untersuchung der strukturellen Merkmale von Kleintieren angewendet wird 16,17,18. Die Mikro-CT mit Kontrastmittel hat jedoch zwei wesentliche Vorteile für ex vivo fixierte Proben: Mikro-CT-Scanner sind weitgehend kostengünstiger und einfach zu bedienen und ermöglichen eine höhere räumliche Auflösung als MRT12.

Diese Arbeit zielt darauf ab, das Verfahren zu beschreiben, um hochauflösende Bilder von neugeborenen Mäusegehirnen mittels Mikro-CT-Scan nach Färbung mit Lugol-Lösung, einem jodbasierten Kontrastmittel, zu erhalten. Es wird ein umfassendes Protokoll vorgestellt, das mit vorbereitenden Phasen wie der Probenentnahme und Fixierung von Geweben beginnt und die Färbung, die Mikro-CT-Bildaufnahme und die Standardverarbeitung durchläuft. Die Bildverarbeitung umfasst die Segmentierung eines 3D-Volumens des gesamten Kopfes sowie des Gehirns und die Auswahl spezifischer anatomischer Ebenen zur Digitalisierung von Punktkoordinaten, die dann für morphometrische Analysen verwendet werden könnten. Obwohl der Fokus hier auf dem neonatalen Mäusegehirn liegt, können ähnliche Strategien auf andere Weichteile angewendet werden. Somit ist das hier vorgestellte Protokoll flexibel genug, um mit subtilen Modifikationen auf andere Arten von Proben angewendet zu werden.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren folgten den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care.

1. Probenentnahme und -vorbereitung

  1. Bereiten Sie 500 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) vor.
    1. Unter einem Extraktionsflussmittel in einem Schrank 20 g PFA-Pulver zu 250 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem 1-Liter-Glasbecherglas geben. Stellen Sie den Becher mit Magnet auf eine magnetische Rührplatte.
    2. Während des Erhitzens umrühren. Überprüfen Sie mit einem Thermometer ständig die Temperatur der Lösung, um sie unter 60 °C zu halten.
    3. Geben Sie mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff Tropfen von 1 M NaOH in die Lösung, um das PFA aufzulösen. Sobald sich das PFA-Pulver vollständig aufgelöst hat, kühlen Sie die Lösung bei Raumtemperatur (RT) ab.
    4. Stellen Sie das Volumen mit 1x PBS auf 500 ml ein. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2-7,3 ein, indem Sie Tropfen von 1 M HCl mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff hinzufügen.
    5. Filtern Sie die Lösung mit einem Papierfilter und einem Glastrichter in einer 1-Liter-Glasflasche.
    6. Verschließen Sie die Glasflasche, nehmen Sie sie aus dem Flussmittelschrank und lagern Sie sie im Kühlschrank bei -4 °C.
  2. Sammeln Sie Gehirnproben.
    1. Um Proben zu erhalten, opfern Sie Mausneugeborene am Morgen nach ihrer Geburt im Alter von 0,5 Tagen (P 0,5) mit einer chirurgischen Schere, um sie zu enthaupten.
    2. Legen Sie die Schere in den Nacken des Neugeborenen, während Sie den Körper halten, und führen Sie einen einzigen und sauberen Schnitt durch.
  3. Fixieren Sie die Proben in PFA.
    1. Füllen Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 40 ml 4% PFA.
    2. Tauchen Sie jeden Kopf in das Röhrchen, das PFA als Fixiermittel enthält. Verwenden Sie dazu einen Paton-Spatel oder einen Löffel.
    3. Lagern Sie die konischen Röhrchen 48 h bei -4 °C im Kühlschrank und wechseln Sie dann zu 40 mL 1x PBS mit 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel. Im Kühlschrank bei -4 °C aufbewahren.

2. Probenfärbung

  1. Bereiten Sie die Lugolsche Lösung (3,75 % w/v) vor.
    1. Unter einem Extraktionsflussmittel in einem Schrank werden in einem 1-Liter-Glasbecher 10 g Kl und 5 g I2 in 400 ml destilliertem Wasser unter ständigem Mischen mit einem Magnetrührer gelöst.
  2. Tauchen Sie jeden Kopf in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 40 ml Lugol-Lösung.
    1. Bei Neugeborenen mit einer ungefähren Körpergröße von 1,3 g lassen Sie die Proben 15-20 Stunden lang unter ständigem Mischen mit einem Orbitalschüttler eintauchen.
    2. Legen Sie die Proben vor dem Scannen 30 Minuten lang in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml 1 % Agarose.

3. Mikro-CT-Scans

HINWEIS: Für das Mikro-CT-Scannen ist eine spezielle Ausrüstung erforderlich. Für diese Art von Scanner gibt es verschiedene Optionen, und die Details zur Anschaffung hängen von den Eigenschaften der verwendeten Geräte ab. Das Labor von Dr. Hallgrímsson setzt auf einige Alternativen von Mikro-CT-Scannern. Hier basiert das Protokoll auf der Verwendung eines einfachen Desktop-Scanners, der zu den leichter zugänglichen Kleintier-Bildgebungsgeräten gehört, die von Labors auf der ganzen Welt verwendet werden. Wenn das Scanobjektiv der Schädel ist, überspringen Sie die Schritte in Abschnitt 2 des Protokolls und fahren Sie mit Abschnitt 3 fort. Nach dem Scannen des Schädels konnten der Färbeprozess und das Scannen des Gehirns durchgeführt werden, um Bilder von denselben Proben sowohl des Gehirns als auch des Schädels zu erhalten.

  1. Legen Sie die Probe in den Mikro-CT-Halter.
    1. Geben Sie die Probe in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Fixieren Sie die Probe, um Bewegungen während der Scannersitzung zu vermeiden. Zu diesem Zweck kann etwas Polyurethanmaterial verwendet werden, um die leeren Teile des Rohrs zu füllen.
    2. Öffnen Sie das Gerät und legen Sie das Röhrchen mit der Probe in den Mikro-CT-Halter.
    3. Loggen Sie sich in das Micro-CT-Bedienfeld ein und registrieren Sie die zu scannende Probe. Dadurch wird automatisch eine Beispielnummer generiert. Füllen Sie zusätzlich zur Nummer das Feld "Name" aus. Sowohl der Probenname als auch die Probennummer sollten an anderer Stelle (z. B. in einer Tabelle) aufgezeichnet werden, falls die Rohdaten erneut abgerufen werden müssen.
    4. Starten Sie das Scanprogramm. Geben Sie den Namen oder die Nummer der Probe ein und wählen Sie eine Steuerdatei aus, die die Scanparameter enthalten soll.
  2. Scannen Sie die Probe.
    1. Stellen Sie auf dem Bildschirm der Mikro-CT-Software die folgenden Parameter ein: isotrope Voxelgröße von 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, 800.000 ms Integrationszeit und 500 Projektionen pro 180°.
    2. Legen Sie den Scanbereich fest, indem Sie Scout-Ansicht auswählen. Sobald das Referenzbild angezeigt wird, drücken Sie Referenzlinie , um den Bereich festzulegen. Bewegen Sie die durchgezogene grüne Linie an den Rand des Samples und halten Sie dann die Umschalttaste gedrückt, während Sie den Cursor ziehen, um den Scanbereich zum anderen Rand des Samples zu erweitern.
    3. Wählen Sie OK , um den Scan zu starten.
  3. Werten Sie den Scan aus und exportieren Sie ihn.
    1. Öffnen Sie das Micro-CT-Scanner-Auswertungsprogramm und klicken Sie auf Probe und Messung auswählen. Geben Sie im Feld Filter den Namen der Probe ein, wählen Sie die Probe aus und wählen Sie die Messdatei aus.
    2. Die Datei wird als Slices geladen, deren Anzahl vom anfänglichen Scanfenster abhängt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle laden , um jedes Slice zu laden und später das Verschieben zwischen den Slices zu erleichtern.
    3. Wählen Sie Aufgaben > Auswertung 3D , um einen Zuschneiderahmen um die Segmente zu initialisieren. Es erscheint eine 3D-Auswertungsaufforderung mit einer Reihe von Feldern, darunter Aufgabe/Bewertung, VOI (Volume of Interest), Start X, Y, Z und Dimension X, Y, Z.
    4. Setzen Sie das Feld Aufgabe > Auswertung 3D auf das entsprechende Skript, da eine Vielzahl von Auswertungsaufgaben ausgeführt werden können, wie z. B. Rekonstruktion, Segmentierung, Morphometrie (z. B. Knochenmineraldichte) und Dateikonvertierungen oder -übertragungen. Das Skript Default Evaluation kann als Leitfaden verwendet werden.
    5. Nachdem Sie das Skript ausgewählt haben, passen Sie das VOI-Feld auf dem Hauptbild an. Beginnen Sie mit der ersten Scheibe. Stellen Sie sicher, dass die Box die zu bewertende Anatomie enthält. Verschieben Sie den VOI, indem Sie mit der rechten Maustaste auf eines der kleinen weißen Quadrate zum Feldrand klicken und die Größe des VOI mit der mittleren Maustaste ändern. Alternativ können Sie die Bemaßungsfelder numerisch anpassen.
    6. Führen Sie die Probe mit der Bildlaufleiste unter dem Bild durch, um sicherzustellen, dass alle Anatomien in der VOI-Box erfasst wurden. Klicken Sie oben links in der Software auf XY, XZ oder YZ , um die Ausrichtung zu ändern.
    7. Wählen Sie Evaluierung starten aus. Je nach Skript für die Aufgabenauswertung wird dadurch eine 3D-AIM-Bilddatei mit einer entsprechenden .txt-Headerdatei generiert. Darüber hinaus kann im Skript ein Pfad angegeben werden, um das Image (FTP) an einen bestimmten Speicherort zu bringen.

4. Bildbearbeitung

  1. Öffnen Sie die Bilder in der Bildbearbeitungssoftware.
    HINWEIS: Die Bildverarbeitung kann mit verschiedenen Softwares durchgeführt werden. Dieses Protokoll enthält die grundlegenden Schritte in einer kommerziellen Software, die in der Region weithin akzeptiert ist und über vielseitige Tools für die grundlegende und fortgeschrittene Verarbeitung verfügt. Darüber hinaus gibt es verschiedene akzeptable Formate für rekonstruierte Mikro-CT-Bilder. Dieser Aspekt hängt in der Regel von der für die Erfassung verwendeten Ausrüstung und deren Software ab. Hier erfolgt die Bildverarbeitung mit .bmp Bildern. Das gleiche Verfahren kann für .tiff Bilder und andere Typen angewendet werden. Da die Erfassung in einem Scanner mit .aim als Standardformat erfolgt, wird zunächst eine Konvertierung von .aim in .bmp vorgestellt.
    1. Um .aim-Dateien zu öffnen, wählen Sie Datei > Open Data und wählen Sie die Datei aus. Danach öffnet sich ein Fenster mit dem Titel Dateiformatauswahl. Wählen Sie Rohdaten aus.
    2. Es öffnet sich ein Fenster mit dem Titel Rohdatenparameter. Geben Sie in diesem Fenster die Parameter ein, die den Informationen auf dem Header .txt der Datei folgen, die für jede AIM-Datei generiert wird. Wählen Sie für Datentyp die Option 16-Bit für Header komplett mit der Zahl aus, nachdem Bilddaten am Byteoffset beginnen. Legen Sie außerdem die Abmessungen und die Voxelgröße mithilfe der Informationen im Header .txt der Datei fest. Sobald die Parameter vollständig sind, drücken Sie OK.
    3. Wenn eine Konvertierung von .aim in .bmp erforderlich ist, klicken Sie im Hauptfenster > in der Projektansicht mit der rechten Maustaste auf das .aim-Objekt und wählen Sie die Option Konvertieren > Bildtyp konvertieren. Wählen Sie unter Eigenschaften die Option 8-Bit als Ausgabetyp aus. Wählen Sie Anwenden aus.
    4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das neue 8-Bit-Objekt. Wählen Sie Speichern unter aus. Wählen Sie .bmp und speichern Sie.
    5. Um die .bmp Datei zu öffnen, wählen Sie Datei > Daten öffnen und wählen Sie die Datei aus. Danach öffnet sich ein Fenster mit den Parametern des Bildes. Bestätigen Sie die Parameter und akzeptieren Sie, wenn sie korrekt sind.
    6. Im Hauptfenster > Projektansicht wird ein neues Objekt mit dem Namen der .bmp Dateien erstellt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf dieses Objekt und wählen Sie die Option Ortho Slice. Wählen Sie unter Eigenschaften die Segmentnummer und die anzuzeigende Ausrichtungsebene aus.
  2. Erhalten Sie 3D-Volumen des gesamten Kopfes.
    1. Klicken Sie im Hauptfenster > in der Projektansicht mit der rechten Maustaste auf das Bildobjekt. Wählen Sie die Option Interaktiver Schwellenwert > Erstellen aus. Ändern Sie unter Eigenschaften die Werte für Minimales RGB und Maximales RGB , bis der Teil des Bildes ausgewählt ist, der dem Kopf des Tieres entspricht. Wählen Sie Anwenden aus.
    2. Im Hauptfenster > Projektansicht wird ein Objekt mit Schwellenwert erstellt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf dieses Objekt, und wählen Sie unter Eigenschaften die Option Isofläche aus. Wählen Sie unter Eigenschaften einen Schwellenwert aus, um die Oberfläche zu visualisieren, und klicken Sie auf Anwenden. Dieser Schwellenwert muss empirisch gewählt werden, dann müssen möglicherweise andere Werte untersucht werden.
  3. Punktkoordinaten digitalisieren
    1. 3D-Punktkoordinaten können sowohl auf der Grundlage von Schichten als auch von extrahierten Oberflächen digitalisiert werden. Klicken Sie für die erste Option mit der rechten Maustaste in die Bildoption und wählen Sie Slice. Wählen Sie unter Verschieben den gewünschten Ausschnitt in der Axialebene aus. Wenn die Ebene nicht richtig platziert ist, klicken Sie in den Eigenschaften auf Optionen > Drehen, um die richtige Ausrichtung festzulegen.
    2. Um Orientierungspunkte zu digitalisieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Hauptfenster > Projektansicht und wählen Sie Objekt > Punkte und Linien > Orientierungspunkte erstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die neuen Objekt-Landmarks und wählen Sie Landmark-Ansicht. Ändern Sie in der Orientierungspunktansicht die Größe des Punktes in Größe. Um Orientierungspunkte in Eigenschaften hinzuzufügen, verwenden Sie die Option Im Bearbeitungsmodus hinzufügen.
      HINWEIS: Für Neugeborene wurde zuvor eine Reihe von Orientierungspunkten und Halblandmarken um die axialen und sagittalen Kurven des Gehirns veröffentlicht14.
    3. Wählen Sie zunächst die Achsenebene, die den rostralsten Punkt der Riechkolben und den kaudalsten Punkt des Kortex kreuzt.
    4. Wählen Sie die Objektorientierungspunkte aus, und wählen Sie unter Eigenschaften die Option Orientierungspunkt-Editor aus. Klicken Sie mit dem Pfeil auf die Stelle, an der der Punkt digitalisiert werden soll.
    5. In der vorgeschlagenen Gruppe von Landmarken werden 24 Punkte in der ausgewählten Achsenebene digitalisiert. Digitalisieren Sie den ersten im kaudalsten Punkt des Gehirns an der Mittellinie.
    6. Digitalisieren Sie fünf Punkte, die gleichmäßig um die Kurve verteilt sind (Semilandmarks), bis zum nächsten Orientierungspunkt am Schnittpunkt zwischen Mittelhirn und Kortex.
    7. Digitalisieren Sie dann acht Punkte (Semilandmarks) um den Kortex.
    8. Digitalisieren Sie einen neuen Orientierungspunkt an der Schnittstelle zwischen Kortex und Riechkolben. Digitalisieren Sie dann vier Punkte (Halbwege) um die Riechkolben.
    9. Digitalisieren Sie eine neue Landmarke am rostralsten Punkt der Riechkolben in der Mittellinie. Digitalisieren Sie dann zwei Punkte (Semilandmarks) zwischen den beiden Riechkolben.
    10. Digitalisieren Sie eine neue Landmarke am kaudalsten Punkt der Riechkolben in der Mittellinie.
    11. Legen Sie für sagittale Punkte einen Schnitt in der rechten Gehirnhälfte in einer parasagittalen Ebene fest, wo das Gehirn am kaudal am stärksten ausgeprägt ist.
    12. In dem vorgeschlagenen Satz von Landmarken werden 33 Punkte in der ausgewählten parasagittalen Ebene digitalisiert. Digitalisieren Sie die erste im Schnittpunkt zwischen Zwischenhirn und Hinterhirn. Digitalisieren Sie dann neun Punkte (Semilandmarks) in der ventralen Grenze des Gehirns.
    13. Digitalisieren Sie eine neue Landmarke am rostralsten Punkt des Riechkolbens. Digitalisieren Sie dann drei Punkte (Semilandmarks) um die Riechkolben herum.
    14. Digitalisieren Sie einen neuen Orientierungspunkt im Schnittpunkt zwischen Riechkolben und Kortex. Digitalisieren Sie dann drei Punkte (Semilandmarks) um die Riechkolben herum.
    15. Digitalisieren Sie einen neuen Orientierungspunkt im Schnittpunkt zwischen Riechkolben und Kortex. Digitalisieren Sie dann sieben Punkte (Semilandmarks) um den Kortex.
    16. Digitalisieren Sie einen neuen Orientierungspunkt an der Schnittstelle zwischen Kortex und Mittelhirn. Digitalisieren Sie dann sieben Punkte (Semilandmarks) um den Kortex.
    17. Digitalisieren Sie einen neuen Orientierungspunkt an der Schnittstelle zwischen Kortex und Mittelhirn. Digitalisieren Sie dann sechs Punkte (Semilandmarks) um das Mittelhirn.
    18. Digitalisieren Sie einen neuen Orientierungspunkt an der Schnittstelle zwischen Mittelhirn und Kleinhirn. Digitalisieren Sie dann zwei Punkte (Halblandmarken) um das Kleinhirn herum.
    19. Digitalisieren Sie einen neuen Orientierungspunkt an der Schnittstelle zwischen Kleinhirn und Hinterhirn.
    20. Speichern Sie die digitalisierten Punkte. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Objekt-Orientierungspunkte und wählen Sie die Option Daten speichern.
  4. Analysieren Sie die Punktkoordinaten.
    HINWEIS: Sobald die Punktkoordinaten für eine Reihe von Proben digitalisiert sind, können grundlegende Analysen mit geometrischen Morphometriewerkzeugen durchgeführt werden, um Größen- (Schwerpunktgröße) und Formvariablen (Form- oder Prokrustes-Koordinaten) zu erhalten. Die Analysen werden in einer freien Open-Software-Umgebung durchgeführt, die sich besonders für statistische Analysen eignet.
    1. Erstellen Sie mit einem Notizblock eine Datei mit den Koordinaten aller digitalisierten Exemplare. Befolgen Sie dazu das TPS-Format, wie in https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm beschrieben.
    2. Öffnen Sie die Statistiksoftware. Wählen Sie Datei > Richtung ändern , um das Verzeichnis auszuwählen, in dem die .tps-Datei gespeichert wird.
    3. Wählen Sie Pakete > Pakete installieren. Wählen Sie einen Cran Mirror. Suchen Sie nach geomorph und installieren Sie es.
    4. Laden Sie Pakete, indem Sie in der Konsole Folgendes eingeben: library(geomorph) und library(Morpho).
    5. Laden Sie das Dataset, indem Sie in der Konsole Folgendes eingeben: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
    6. Führen Sie eine generalisierte Prokrustesanalyse durch, indem Sie in die Konsole Folgendes eingeben: GPA<- gpagen(dataset).
    7. Rufen Sie die Schwerpunktgröße ab, indem Sie in der Konsole Folgendes eingeben: CS<-GPA$Csize.
    8. Rufen Sie Prokrustes-Koordinaten ab, indem Sie Folgendes in die Konsole eingeben: ProcCoord<- GPA$coords.
    9. Zeichnen Sie die Prokrustes-Koordinaten und die mittlere Form, indem Sie in die Konsole plotAllSpecimens(ProcCoord) eingeben.
  5. Segmentierung von ROIs
    HINWEIS: Um das Gehirn zu segmentieren und eine 3D-Rekonstruktion zu erhalten, identifizieren Sie das Gehirngewebe in jedem Schnitt manuell. Das gleiche Verfahren kann auf bestimmte ROIs angewendet werden, wie z. B. die Riechkolben, den Kortex usw.
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Hauptfenster > Projektansicht und wählen Sie Objekt > Beschriftungsfeld erstellen.
    2. Wählen Sie das Objekt Beschriftungsfeld aus und klicken Sie auf die Option Segmentierungseditor in den Eigenschaften.
    3. Fügen Sie unter Materialien ein neues Material hinzu und benennen Sie es bei Bedarf in Gehirn um.
    4. Wählen Sie unter Auswahl die Option Aktueller Schnitt, um das Gewebe zu segmentieren, das dem Gehirn in jedem Schnitt entspricht.
    5. Wählen Sie mit den Optionen in Tools das Gehirngewebe in jedem Segment aus. Für diesen Fall sind der Zauberstab und der Pinsel am besten geeignet.
    6. Sobald die Auswahl in jedem Segment getroffen wurde, klicken Sie auf In Auswahl hinzufügen.
    7. Wenn die Auswahl in allen Segmenten abgeschlossen ist, kehren Sie zur Projektansicht im Hauptfenster zurück, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Beschriftungsfeld , um Oberfläche generieren auszuwählen, und klicken Sie dann auf Anwenden.
    8. Sobald Sie die Oberfläche erhalten haben, exportieren Sie sie, indem Sie Oberfläche extrahieren anwenden.
    9. Um das Volumen der segmentierten Strukturen zu erhalten, wählen Sie im Hauptfenster > in der Projektansicht das Objekt aus, das die Beschriftung enthält, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie > Volumenanteil messen und analysieren. Klicken Sie dann auf Übernehmen.

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Ergebnisse

Hier wird ein grundlegendes Protokoll vorgestellt, um hochauflösende Bilder von neugeborenen Mäusegehirnen zu erhalten. Die Köpfe wurden nach dem Eintauchen in Lugols Lösung gescannt. Trotz ihrer geringen Größe können die wichtigsten anatomischen Strukturen des Gehirns wie Riechkolben, Kortex, Mittelhirn, Kleinhirn und Hinterhirn unterschieden werden (Abbildung 1).

Mit diesen Bildern als Input können verschiedene Analysen durchgeführt werden. Eine Reihe von Landma...

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Diskussion

In dieser Arbeit wird ein prägnantes Protokoll zum Scannen von neonatalem Hirngewebe von Mäusen mittels Mikro-CT mit einem Kontrastmittel vorgestellt. Darüber hinaus enthält es einfache Verfahren zur Erzielung quantitativer und qualitativer Ergebnisse. Aufbauend auf diesen Methoden können weitere alternative oder ergänzende Analysen durchgeführt werden.

Wie im Protokoll gezeigt, können Mikro-CT-Bilder auf unterschiedliche Weise analysiert werden. In früheren Studien schätzte unsere Gruppe die ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Wei Liu für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wird von ANPCyT PICT 2017-2497 und PICT 2018-4113 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  &Mikro; CT 35Scanco Medical AGBitte beachten Sie, dass Scanco die     CT 35 nicht mehr. Ihr kleinster Scanner ist jetzt der  &Mikro; GT 45 
AvizoVisualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 MäuseBioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Konische RöhrenDaiggerCH-CI4610-1856
FlussmittelschrankEscoAC2-458 
Glasbecher GlasscoGL-229.202.10
GlasflascheSimaxCFB017
GlastrichterHDAVI1108
HClCarlo Erba403872Manipulieren Sie unter einem Flussmittelschrank und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (Maske, Glas und Handschuhe)
I2Cicarelli804211Bei der Vorbereitung von I2KI unter einem Flussmittelschrank manipulieren und persönliche Schutzausrüstung (Maske, Glas und Handschuhe) verwendenKI
CicarelliPA131542.1210Bei der Zubereitung von I2KI unter einem Flussmittelschrank manipulieren und persönliche Schutzausrüstung (Maske, Glas und Handschuhe) verwendenMagnetrührwerk
Arcano4925
NaOHCicarelli1580110Manipulieren Sie unter einem Flussmittelschrank und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (Maske, Glas und Handschuhe)
OrbitalschüttlerBiomintBM021
Paraformaldehyd Biopack2000959400Manipulieren Sie unter einem Flussmittelschrank und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (Maske, Glas und Handschuhe)
Paton-SpatelGlasscoGL-377.303.01
PBSBiopack2000988800
Kunststoff-PasteurpipetteDaigger9153
R R ProjektDas Paket geomorph für R wurde im Protokoll (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html
)Scissors Belmed
NatriumazidBiopack2000163500
ThermometerDaigger7650

Referenzen

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