Isolierung und Kultivierung von primären Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem Arthritisgewebe

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch eine Hyperplasie der Synovialfunktion gekennzeichnet ist und zur Zerstörung der Gelenke führt ^1,2. Geweberesidente Makrophagen und Fibroblasten sind in gesunden Synovialen vorhanden, um die gemeinsame Homöostase aufrechtzuerhalten. Bei RA-Patienten vermehren sich synoviale Fibroblasten (SFs), und Immunzellen, einschließlich Monozyten, infiltrieren in die Synovial- und Gelenkflüssigkeit, Prozesse, die mit Entzündungen verbunden^sind 1,3,4. Synoviale Makrophagen (SMs), zu denen residente Makrophagen und von Monozyten im peripheren Blut abgeleitete Makrophagen gehören, und SFs sind aberrant aktiviert und spielen eine wichtige Rolle in der RA-Pathogenese. Neuere Studien deuten darauf hin, dass Zell-Zell-Interaktionen zwischen SMs und SFs sowohl zur Exazerbation als auch zur Remission von RA ^5,6 beitragen.

Um die RA-Pathogenese zu verstehen, wurden mehrere Nagetiermodelle der entzündlichen Arthritis verwendet, darunter K/BxN-Serumtransfer-Arthritis, Kollagen-induzierte Arthritis und Kollagen-Antikörper-induzierte Arthritis. Zellbasierte Assays sind in der Regel erforderlich, um molekulare Funktionen bei Arthritis zu klären. Daher wurden Primärzellen aus Tiermodellen der Arthritis isoliert. Die Methode zur Isolierung von SFs aus murinem Arthritisgewebe ist gut etabliert, und diese Zellen haben zur Aufklärung der molekularen Mechanismen in der Arthritis-Pathogenese beigetragen ^7,8. Auf der anderen Seite wurden Makrophagen aus dem Knochenmark, aus Blutmonozyten gewonnene Makrophagen und Makrophagenzelllinien häufig als Makrophagenressourcen für Arthritisstudien verwendet ^9,10. Da Makrophagen Funktionen erwerben können, die mit ihrer Mikroumgebung verbunden sind, fehlen den allgemeinen Quellen von Makrophagen möglicherweise die spezifischen Reaktionen auf Arthritisgewebe. Darüber hinaus ist es schwierig, durch Sortierung genügend Synovialzellen zu erhalten, da die murine Synovialflüssigkeit selbst in Arthritismodellen ein sehr kleines Gewebe ist. Die mangelnde Verwendung von Synovialmakrophagen für In-vitro-Studien war eine Einschränkung in Arthritisstudien. Die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung und Expansion von Synovialmakrophagen wäre ein Vorteil für die Aufklärung pathologischer Mechanismen bei RA.

Bei der vorherigen Methode zur Isolierung von SFs wurden SMs verworfen⁷. Darüber hinaus wurde über eine Methode zur Isolierung und Expansion residenter Makrophagen aus einigen Organen berichtet¹¹. Daher wurden bestehende Protokolle in Kombination modifiziert. Die Modifikation zielt darauf ab, die Primärkultur sowohl von SMs als auch von SFs mit hoher Reinheit zu erreichen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, sowohl SMs als auch SFs aus murinem Arthritisgewebe zu isolieren und zu expandieren.

Tierversuche wurden vom Tierversuchskomitee der Universität Ehime genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche der Universität Ehime (37A1-1*16) durchgeführt.

1. Vorbereitung von Instrumenten, Reagenzien und Nährmedium

1. Bereiten Sie das Nährmedium wie folgt vor: Ergänzen Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % antibiotisch-antimykotischer Lösung (Anti-Anti).
2. Bereiten Sie das Verdauungsmedium wie folgt vor: Ergänzen Sie das Nährmedium mit 1 mg/ml Kollagenase Typ IV. Passen Sie die Kollagenasekonzentration kurz vor der Anwendung an.
3. Verdünnen Sie Kollagen Typ I-C auf eine Konzentration von 0,15 mg/ml mit 1 mM HCl-Lösung. Kulturschalen (Durchmesser 40 oder 60 mm) mit der verdünnten Kollagenlösung überfluten. Nach 6-12 h bei Raumtemperatur die Kollagenlösung aus dem Geschirr nehmen und bei Raumtemperatur trocknen. Die mit Kollagen überzogenen Schalen sind mindestens 1 Woche bei Raumtemperatur haltbar. Waschen Sie das vorbeschichtete Geschirr vor Gebrauch mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Medium.
4. Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente wie Scheren, Pinzetten mit gezackten Spitzen und Pinzetten mit feiner Spitze vor. Vor Gebrauch in 70%igem Ethanol einweichen.

2. Präparation von Synovitis-Gewebe bei Mäusen ( Abbildung 1A)

1. Bereiten Sie eine Maus mit entzündlicher Arthritis in den Hinterpfoten vor.
   HINWEIS: Für^{dieses Protokoll wurden} weibliche C57BL/6-Mäuse (18-20 g), 7-8 Wochen nach der Geburt, mit Kollagen-Antikörper-induzierter Arthritis (CAIA) oder K/BxN-Serumtransfer-Arthritis (STA) verwendet. Die Isolierung von SMs aus nicht geschwollenem (d. h. gesundem) Gewebe könnte schwierig sein, da die Anzahl der Zellen nicht ausreicht.
2. Betäuben Sie die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 16 mg/kg Xylazin. Reinigen Sie die Mäuse mit 70%igem Ethanol.
3. Schneiden Sie die Brustregion mit einer Schere auf, um das Herz freizulegen. Schneiden Sie die rechte Ohrmuschel des Herzens mit einer Schere ab und stechen Sie dann eine 23-G-Schmetterlingsnadel über die Herzspitze in die linke Herzkammer, gefolgt von einem Rückfluss von 15-20 ml sterilem PBS mit einer Spritze, um peripheres Blut manuell zu entfernen (ca. 1 ml/2 s).
4. Schälen Sie die Hinterpfoten, indem Sie die Haut mit einer Schere aufschneiden und die Haut mit einer Pinzette mit gezackten Spitzen herausziehen.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt wird die Verwendung einer Pinzette für die Handhabung von Proben empfohlen. Berühren Sie das geschälte Gewebe nicht mit den Fingern, um das Anhaften von Mäusehaaren zu vermeiden.
5. Verschieben Sie die Zehengrundgelenke durch Ziehen, gefolgt von einem Durchtrennen der Bänder der Gelenke mit einer Schere, um die Zehen zu entfernen.
6. Schneide die Sehnen der Unterschenkelmuskulatur in der Nähe des Knöchels mit einer Schere durch. Fassen Sie die Sehne mit einer Pinzette und schälen Sie die Muskeln proximal im Unterschenkel ab, um das Schienbein freizulegen. Entferne das Wadenbein.
7. Auskugeln des Kniegelenks durch Ziehen, anschließendes Durchtrennen der Gelenkbänder mit einer Schere, um das Schienbein mit der geschwollenen Hinterpfote zu lösen. Bewahren Sie die Proben in eiskaltem Nährmedium (0,3 ml/^cm2) auf, bis Sie sie bis Schritt 3.1 verarbeiten.

3. Verdauung von Synovitis-Gewebe ( Abbildung 1B)

1. Saugen Sie das Nährmedium ab, vermeiden Sie die Probe und fügen Sie dann frisches Nährmedium (0,3 ml/cm²) hinzu. Wiederholen Sie den Waschvorgang drei- bis viermal.
   HINWEIS: Ab diesem Schritt sollte die Handhabung der Proben aseptisch in einem sauberen Labortisch oder einer Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.
2. Verschieben Sie alle Gelenke der Proben, indem Sie mit einer feinen Pinzette im Nährmedium unter einem Stereomikroskop (bei 10-20-facher Vergrößerung) ziehen. Eine Pinzette mit feiner Spitze ist in diesem Schritt praktisch. Entferne das Schienbein und so viele Gefäße, Sehnen und Bänder wie möglich. Achte darauf, dass du dir die Knochen nicht brichst, wenn du dich verrenkst.
3. Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen pro Probe vor. Übertragen Sie die ausgerenkten Knochen mit Weichteilen mit einer Pinzette in das erste 15-ml-Röhrchen. Geben Sie 4 ml Verdauungsmedium pro Probe, das aus beiden Hinterpfoten gewonnen wurde, in das Röhrchen.
4. Um Restzellen und Gewebefragmente zu sammeln, wird das Medium, in dem sich die Probe befand, in das zweite 15-ml-Röhrchen überführt. Das Medium wird bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Pellet mit 1 ml Verdauungsmedium resuspendiert und die Zell- und Gewebefragmentlösung in das erste 15-ml-Röhrchen überführt, das fast das gesamte Gewebe enthält (insgesamt 5 ml Verdauungsmedium/Hinterpfoten).
5. Die Probe wird für 60-120 min bei 37 °C unter Schütteln in einem Hybridisierungsofen aufgeschlossen.
   HINWEIS: Der optimale Zeitpunkt für die Verdauung der Proben sollte festgelegt werden. Die Zeit ist abhängig vom Grad der Schwellung in den Knöcheln und Kollagenasen. In den meisten Fällen sind 60-120 min ausreichend. Nach 60 Minuten Inkubation wird ein Teil der aufgeschlossenen Probe durch Pipettieren entnommen und unter dem Mikroskop beobachtet. Wenn die Verdauung unzureichend ist, sollte die Inkubation fortgesetzt und die Verdauung alle 30 Minuten überprüft werden.
6. Pipetieren Sie die Lösung gut. Die Zelllösung wird durch ein Zellsieb (40 μm Porengröße) in ein 50-ml-Röhrchen filtriert.
7. Geben Sie 10 ml Nährmedium durch das Zellsieb in das 50-ml-Röhrchen. Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
8. Nach dem Entfernen des Überstandes mit 10 ml Nährmedium resuspendieren. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Nach dem Entfernen des Überstandes mit 2 ml Nährmedium resuspendieren.

Abbildung 1: Verfahren der Probenahme von murinem Arthritisgewebe und Kollagenase-Verdauung . (A) (i) Hinterpfote der Maus mit entzündlicher Arthritis. ii) Entfernung der Haut an der Hinterpfote. (iii) Luxation der Zehengrundgelenke und Entfernung der Zehen. (iv) Durchtrennen der Sehnen im Knöchel. (v) Entfernung der Muskeln in den Unterschenkeln. (vi) Luxation des Kniegelenks. (b) links; Herausgeschnittene Beine in Nährmedium. Rechts; ausgerenkter Tarsus und Metatarsus im Nährmedium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Isolierung von synovialen Fibroblasten ( Abbildung 2A)

1. Säen Sie alle Zellsuspensionen, die Sie von beiden Knöcheln erhalten haben, auf die kollagenbeschichtete Schale.
   HINWEIS: Wenn Sie Knöchel mit schwacher oder mäßiger Schwellung verwenden, um die Zellen zu erhalten, wird eine Schale mit einem Durchmesser von 40 mm angewendet. Die mit Kollagen beschichtete Schalengröße kann auf eine Schale mit einem Durchmesser von 60 mm geändert werden, wenn beide Knöchel stark geschwellt sind.
2. Nährmedium (ca. 222 μl/^cm2) hinzufügen. 1 h bei 37 °C in befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO 2 inkubieren_.
3. Sammeln Sie nicht adhärente Zellen mit einer Pipette (Verwendung in Schritt 5.1). Waschen Sie die mit Kollagen überzogene Schale mit Nährmedium und sammeln Sie das Medium. Kultivieren Sie die adhärenten Zellen in frischem Medium (Abbildung 2B,i). Die meisten Zellen, die schnell an der kollagenbeschichteten Schale haften, weisen eine fibroblastoide (spindelförmige) Morphologie auf.
4. Passage subkonfluenter Zellen durch Behandlung mit 0,05 % Trypsin in Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS). Bei dieser Methode ist die Kontamination anderer Zellen begrenzt, wenn auch in der anfänglichen Expansion. Wenn mehr gereinigte fibroblastenähnliche Zellen benötigt werden, führen Sie eine wiederholte Passage durch, um die Reinheit zu verbessern. Es wird jedoch auch die Ausdehnung des Zytoplasmas der Zellen bei Adhäsion beobachtet (Abbildung 2B,ii). Da übermäßige Passagen den Verlust naiver Eigenschaften in den Zellen beeinflussen, verwenden Sie Zellen mit weniger als 5 Passagen.

5. Isolierung von Synovialmakrophagen ( Abbildung 2A)

1. Säen Sie alle nicht adhärenten Zellen aus Schritt 4.4 auf Schalen (Durchmesser von 40 oder 60 mm), die nicht mit Kollagen beschichtet wurden.
   HINWEIS: Zu den nicht adhärenten Zellen gehören Makrophagen, andere Lymphozyten und Restfibroblasten aus Synovitisgewebe.
2. Die Bulk-Zellen werden 1 Tag lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ kultiviert.
3. Um nicht adhärente Lymphozyten zu entfernen, saugen Sie das Nährmedium ab und fügen Sie dann frisches Nährmedium hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal (Abbildung 2B,iii).
4. Die adhärenten Bulk-Zellen werden 1-2 Wochen lang in einem Kulturmedium kultiviert, wobei das Medium alle 2 Tage gewechselt wird, wobei die Konfluenz beibehalten wird (Abbildung 2B,iv).
   HINWEIS: Die Anzahl der SMs nimmt unter Co-Kulturbedingungen mit SFs langsam zu. Daher sollte die Co-Kulturperiode nach Bedarf angepasst werden.
5. Zweimal mit PBS oder HBSS waschen. Mit 0,05 % Trypsin in HBSS (ca. 55 μl/^cm2) für 3 min bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ behandeln. Fibroblasten lösen sich durch Trypsinbehandlung leicht von der Kulturschale, und Makrophagen zeigen eine Resistenz gegen die Trypsinbehandlung. Verwenden Sie diese Eigenschaft für die Auswahl von Synovialmakrophagen.
6. Das Nährmedium (ca. 222 μl/^cm2) wird vorsichtig zu 0,05 % Trypsin in HBSS gegeben. Gießen Sie das Medium nach diesem Schritt nicht mehr direkt auf die Zellen.
7. Um abgelöste Zellen zu entfernen, saugen Sie das Kulturmedium ab und fügen Sie dann vorsichtig frisches Nährmedium hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal. Die verbleibenden Zellen bleiben bis zur Verwendung auf der Schale in frischem Nährmedium (Abbildung 2B,v).
   HINWEIS: Nach einer Trypsin-Behandlung weisen adhärente Zellen makrophagenähnliche morphologische Merkmale auf.

Abbildung 2: Trennung von makrophagenreichen und fibroblastenreichen Fraktionen aus entzündlichem Arthritisgewebe. (A) Schema des Verfahrens zur Trennung von makrophagenreichen und fibroblastenreichen Zellen aus Arthritisgewebe. (B) Repräsentative Phasenkontrastbilder der Phasen des Verfahrens, (i) bis (v) in Abbildung 2A. Der Maßstabsbalken stellt 100 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 7-8 Wochen erlitten eine Kollagen-Antikörper-induzierte Arthritis. Makrophagen-ähnliche Zellen und Fibroblasten-ähnliche Zellen wurden unabhängig voneinander aus entzündlichem Arthritisgewebe gemäß dem oben beschriebenen Verfahren isoliert (Abbildung 2A,B). Makrophagen-ähnliche Zellen wurden unmittelbar nach Schritt 5.7 verwendet. Fibroblasten-ähnliche Zellen wurden nach Schritt 4.4 zunächst subkonfluent kultiviert und dann in eine neue Kulturschale überführt, gefolgt von der Verwendung. Um zu evaluieren, ob SMs und SFs erfolgreich isoliert werden konnten, wurden die folgenden Experimente durchgeführt.

Um die Reinheit der isolierten Zellen zu beurteilen, wurde die mRNA-Expression verschiedener Zellmarker mittels RT-qPCR analysiert. Cd68, Emr1, Itgam und Csf1r wurden als Pan-Makrophagen-Marker und Cdh11, Col6a1, Csf1 und Vcam1 als SF-Marker verwendet. Als Referenzgen 6,8 wurde Rplp0 verwendet. Alle Markergene wurden durch die Rplp0-Expression normalisiert. Beide Zelltyp-Marker wurden in den Makrophagen-ähnlichen Zellen analysiert, und Fibroblasten-ähnliche Zellen wurden aus Arthritis-Gewebe gewonnen. SF-Marker wurden in Fibroblasten-ähnlichen Zellen und Pan-Makrophagen-Marker in Makrophagen-ähnlichen Zellen exprimiert, was darauf hindeutet, dass makrophagenreiche und fibroblastenreiche Fraktionen aus Synovitis-Gewebe isoliert wurden (Abbildung 3A,B).

Um die Reinheit von Makrophagen zu bestimmen, wurden Oberflächenproteinmarker für Makrophagen und andere Zelltypen mittels Durchflusszytometrie analysiert. F4/80 und CD11b wurden für Makrophagenmarker, Ly6G für einen neutrophilen Marker und CD3 für einen T-Zell-Marker6 verwendet. Die Gating-Strategie wurde wie zuvor gezeigt6 verwendet. Mehr als 90 % der Zellen exprimierten CD45, CD11b und F4/80, während die Expression von Ly6G und CD3 weniger als 1 % betrug (Abbildung 4).

Abbildung 3: mRNA-Expression zelltypspezifischer Marker. (A) mRNA-Expression von Pan-Makrophagen-Markern (Cd68, Emr1, Itgam, Csf1r) in Synovialmakrophagen (SMs) und Synovialfibroblasten (SFs) mittels RT-qPCR (n = 4). (B) Expressionsniveaus von SF-Markern (Cdh11, Col6a1, Csf1, Vcam1) in SMs und SFs (n = 4). Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. ** zeigt p < 0,01 durch einen ungepaarten t-Test an. Die Daten stammen aus vier unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Zelltypspezifische Zelloberflächenproteinexpression. Repräsentative Histogramme, die in durchflusszytometrischen Analysen von Leukozyten-Oberflächenmarkern (CD45, CD11b, F4/80, Ly6g, CD3) in Synovialmakrophagen (SMs) gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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