Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Karina Garcia; André Alves; Teresa M. Ribeiro-Rodrigues; Flávio Reis; Sofia Viana

doi:10.3791/65206

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Methodenartikel

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

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DOI:

10.3791/65206

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2. Juni 2023

Karina Garcia¹^,²^,³^,⁴ , André Alves¹^,²^,³ , Teresa M. Ribeiro-Rodrigues¹^,²^,³ , Flávio Reis¹^,²^,³ , Sofia Viana¹^,²^,³^,⁴

¹Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, ²Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, ³Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), ⁴Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit demonstrieren wir ein optimiertes BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basiertes Protokoll zur Charakterisierung von Lipidtröpfchen in Lebergewebe. Durch die Verwendung von orthogonalen Projektionen und 3D-Rekonstruktionen ermöglicht der Fluorophor eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose und kann einen komplementären Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen zur Beurteilung der hepatischen Steatose darstellen.

Zusammenfassung

Lipidtröpfchen (LDs) sind spezialisierte Organellen, die die Lipidspeicherung vermitteln und eine sehr wichtige Rolle bei der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von Funktionsstörungen spielen, die durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht werden. Die Leber ist aufgrund ihrer entscheidenden Rolle im Fettstoffwechsel des Körpers ständig durch die intrazelluläre Anhäufung von LDs in Form von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Lebersteatose bedroht. Die histologische Charakterisierung von LDs basiert in der Regel auf lipidlöslichen Diazofarbstoffen, wie z. B. der Oil Red O (ORO)-Färbung, aber eine Reihe von Nachteilen erschweren die Verwendung dieser Analyse mit Leberproben durchweg. In jüngerer Zeit sind lipophile Fluorophore 493/503 aufgrund ihrer schnellen Aufnahme und Akkumulation in den neutralen Lipidtröpfchenkern für die Visualisierung und Lokalisierung von LDs populär geworden. Obwohl die meisten Anwendungen in Zellkulturen gut beschrieben sind, gibt es weniger Evidenz für den zuverlässigen Einsatz von lipophilen Fluorophorsonden als LD-Bildgebungswerkzeug in Gewebeproben. In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes Bordipyrromethen (BODIPY) 493/503 basiertes Protokoll für die Evaluierung von LDs in Leberproben aus einem Tiermodell der fettreichen Diät (HFD)-induzierten hepatischen Steatose vor. Dieses Protokoll umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die BODIPY 493/503-Färbung, die Bildaufnahme und die Datenanalyse. Wir zeigen eine erhöhte Anzahl, Intensität, Flächenzahl und Durchmesser von hepatischen LDs bei HFD-Ernährung. Mittels orthogonaler Projektionen und 3D-Rekonstruktionen war es möglich, den vollen Gehalt an neutralen Lipiden im LD-Kern zu beobachten, die als nahezu kugelförmige Tröpfchen auftraten. Darüber hinaus konnten wir mit dem Fluorophor BODIPY 493/503 Mikrovesikel (1 μm < d ≤ 3 μm), intermediäre Vesikel (3 μm < d ≤ 9 μm) und Makrovesikel (d > 9 μm) unterscheiden, was eine erfolgreiche Unterscheidung von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose ermöglicht. Insgesamt ist dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll ein zuverlässiges und einfaches Werkzeug für die hepatische LD-Charakterisierung und könnte einen ergänzenden Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen darstellen.

Einleitung

Lipidtröpfchen (LDs), die klassischerweise als Energiedepots angesehen werden, sind spezialisierte Zellorganellen, die die Lipidspeicherung vermitteln, und sie bestehen aus einem hydrophoben neutralen Lipidkern, der hauptsächlich Cholesterinester und Triglyceride (TGs) enthält und von einer Phospholipid-Monoschicht eingekapselt ^ist ^1,2,3.

Die LD-Biogenese findet im endoplasmatischen Retikulum (ER) statt, beginnend mit der Synthese von Triacylglycerin (TAG) und Sterolestern. Neutrale Lipide diffundieren in geringen Konzentrationen zwischen den Segel....