Summary
I denne artikel beskrives en protokol for manuel tyramidsignalforstærkning (TSA) multiplex immunofluorescens (mIF) kombineret med billedanalyse og rumlig analyse. Denne protokol kan bruges med formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) sektioner til farvning af to til seks antigener pr. dias afhængigt af den diasscanner, der er tilgængelig i laboratoriet.
Abstract
Tumormikromiljøet (TME) består af en overflod af forskellige celletyper, såsom cytotoksiske immunceller og immunmodulerende celler. Afhængigt af dets sammensætning og interaktionerne mellem kræftceller og peritumorale celler kan TME påvirke kræftprogressionen. Karakteriseringen af tumorer og deres komplekse mikromiljø kan forbedre forståelsen af kræftsygdomme og kan hjælpe forskere og klinikere med at opdage nye biomarkører.
Vi har for nylig udviklet flere multiplex immunofluorescens (mIF) paneler baseret på tyramid signal amplifikation (TSA) til karakterisering af TME i kolorektal cancer, hoved og hals pladecellekarcinom, melanom og lungekræft. Når farvningen og scanningen af de tilsvarende paneler er afsluttet, analyseres prøverne på en billedanalysesoftware. Den rumlige position og farvningen af hver celle eksporteres derefter fra denne kvantificeringssoftware til R. Vi udviklede R-scripts, der giver os mulighed for ikke kun at analysere tætheden af hver celletype i flere tumorrum (f.eks. tumorens centrum, tumorens margen og stroma), men også at udføre afstandsbaserede analyser mellem forskellige celletyper.
Denne særlige arbejdsgang tilføjer en rumlig dimension til den klassiske tæthedsanalyse, der allerede rutinemæssigt udføres for flere markører. mIF-analyse kunne give forskere mulighed for at få en bedre forståelse af det komplekse samspil mellem kræftceller og TME og opdage nye prædiktive biomarkører for respons på behandlinger, såsom immuncheckpointhæmmere og målrettede terapier.
Introduction
Med udviklingen af målrettede terapier og immuncheckpointhæmmere er det blevet yderst vigtigt at karakterisere interaktionerne mellem kræftceller og deres tumormikromiljø bedre, og dette er i øjeblikket et vigtigt felt inden for translationel forskning. TME består af en overflod af forskellige celletyper med en balance mellem immuncytotoksiske celler rettet mod kræftcellerne og immunmodulerende celler, der kan favorisere tumorvækst og invasivitet 1,2,3,4. Karakteriseringen af dette komplekse miljø kan forbedre forståelsen af kræftsygdomme og kan hjælpe forskere og klinikere med at opdage nye prædiktive og prognostiske biomarkører for bedre at kunne vælge patienter til fremtidig behandling 5,6. For eksempel udviklede Galon og hans team Immunoscore, som er en reproducerbar scoringsmetode, der kan bruges som en prædiktiv biomarkør. Immunoscoren beregnes ved hjælp af densiteten af CD3+ og CD8+ T-celler i den invasive margen og i midten af tumoren 7,8.
I løbet af de sidste årtier er der udviklet kommercielle løsninger til mIF, men disse er ofte dyre og designet til specifikke antigenpaneler. For at overvinde behovet for specifikke paneler af antigener i akademisk og translationel forskning udviklede vi en omkostningseffektiv metode til at udføre mIF på FFPE-tumorsektioner, hvilket tillod farvning af to til seks antigener tilsat cellekernerne modfarvning på humane prøver og museprøver.
Når hele vævssektionerne er farvet og scannet med en fluorescensdiasscanner, kan prøverne analyseres af flere billedanalysesoftware, der understøtter store pyramidale datasæt. Endelig kan rådataene bruges i et miljø til statistisk databehandling og grafik som R-softwaren (v.4.0.2) for at udføre densitets- og rumbaserede analyser.
En protokol optimeret til fem-markørfarvning samt tricks og tip til optimering af nye paneler præsenteres i dette manuskript. Desuden forklares detaljerede trin i billedanalysen og R-funktionerne, der anvendes til den statistiske og rumlige analyse.
Protocol
Alle prøver, der anvendes i denne protokol, stammer fra en undersøgelse, der er godkendt af de lokale etiske komitéer og godkendt af den kompetente myndighed. Alle deltagere i undersøgelsen gav skriftligt informeret samtykke. Forsøget er registreret hos ClinicalTrials.gov (NCT03608046).
1. Multiplex immunofluorescens
- FFPE sektionering
- Fastgør vævet i 4% paraformaldehyd, og indlejr det faste væv i paraffin.
- Skær 5 μm sektioner, og læg dem på klæbende mikroskopglas.
- Tør lysbillederne natten over ved stuetemperatur (RT).
- Deparaffinisering og hæmning af endogene peroxidaser
- Afvoks vævene ved at nedsænke diasene i toluen (3x i 5 min hver) og methanol (3x i 5 min hver) under en stinkhætte.
- Hæm de endogene peroxidaser ved at nedsænke diasene i 3% hydrogenperoxid fortyndet i methanol i 20 minutter under en damphætte.
- Skyl objektglassene i destilleret (d) H2O (1x i 3 min).
- Multiplex immunofluorescens farvning
- Nedsænk diasene i en 300 ml farvningskrukke indeholdende 10 mM citrat (pH 6) eller EDTA (pH 9) buffer suppleret med 0,1% TritonX-100.
BEMÆRK: Den anvendte buffer (pH 6 eller pH 9) afhænger af det farvede antigen (se tabel 1). - Anbring farveglasset med låget lukket i en mikrobølgeovn i 3-5 minutter ved maksimal effekt (f.eks. 900 W), indtil bufferen begynder at koge.
BEMÆRK: Den optimale kogetid afhænger af mikrobølgeovnen og bufferens volumen. Justeringer kan være nødvendige for at finde den perfekte timing. For nogle skrøbelige antigener eller skrøbelige og mindre klæbende prøver (f.eks. Organoider og sfæroider) kan mikrobølgekogning være for hård. I dette tilfælde kan en trykkoger bruges i stedet. - Hold bufferen ved næsten kogetemperatur ved at sætte den lukkede farveglas i mikrobølgeovnen på lav effekt (f.eks. 90 W) i 15 minutter.
- Udfør det sidste trin i opvarmning ved at sætte mikrobølgeovnen på maksimal effekt i 90 s.
- Tag glasset ud af mikrobølgeovnen, og lad bufferen køle af i 15 minutter ved RT.
- Skyl objektglassene 3x i 5 min hver i dH2O og 1x i 5 min i tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween 20 (TBS-T).
- Fjern TBS-T ved at blotte diasene på et køkkenrulle
- Placer diasene (flade) på en farvekammerbakke eller mikroskopglasboks (se materialetabel).
- Omkrans vævet med en hydrofob pen.
- Bloker de ikke-specifikke bindingssteder ved at dække vævet med 5% bovint serumalbumin (BSA) opløst i TBS-T i 30 minutter.
- Fjern blokeringsbufferen ved at blotte diasene på et køkkenrulle.
BEMÆRK: Skyl ikke diasene efter blokeringstrinnet. - Vævet inkuberes i 60 minutter med det primære antistof (se tabel 1) fortyndet i 1 % BSA TBS-T ved at dække vævet med ca. 300 μL opløsning.
- Skyl diasene 3x i 3 minutter hver med TBS-T.
- Vævet inkuberes i 40 minutter med sekundært poly-HRP antistof (se tabel 1) ved at dække vævet med ca. 300 μl af opløsningen.
- Skyl lysbillederne 3x i 3 min med TBS-T.
- Vævet inkuberes i 10 minutter med fluorchrom-tyramidreagens (se tabel 1) fortyndet 200 gange i boratbuffer (0,1 M borat, pH 7,8, 3 M NaCl) extemporane, suppleret med 0,003%H2O2ved at dække vævet med ca. 300 μL af opløsningen.
- Skyl lysbillederne 3x i 3 min med TBS-T.
- Gentag trin 1.3.1-1.3.16, indtil al TSA-farvning er udført.
- Vævet inkuberes natten over ved 4 °C med det sidste primære antistof ( se tabel 1) fortyndet i 1 % BSA TBS-T.
BEMÆRK: Da inkubationen sker natten over, er det vigtigt at dække farvekammerbakken eller mikroskopets diasboks og tilføje dH2O på et papirhåndklæde i bunden af kassen (under diasene) for at sikre, at vævene ikke tørrer under inkubationen. - Skyl vævet 3x i 5 minutter hver med TBS-T.
- Inkuber vævet i 120 minutter med det sekundære antistof (direkte koblet med fluorochrom) fortyndet 200 gange i 1% BSA TBS-T.
- Skyl vævet 3x i 5 minutter hver med TBS-T.
- Plet kernerne ved at inkubere vævet i 5 minutter i bisbenzimid (20 mM) fortyndet 1.000 gange i 10% BSA TBS-T.
BEMÆRK: Bisbenzimid kan erstattes af DAPI, men sidstnævnte er mere giftigt og skal håndteres forsigtigt under en stinkhætte. - Skyl vævet 3x i 3 minutter hver i dH2O.
- Monter objektglassene ved hjælp af et fluorescensmonteringsmedium og borosilikatdækglas.
- Nedsænk diasene i en 300 ml farvningskrukke indeholdende 10 mM citrat (pH 6) eller EDTA (pH 9) buffer suppleret med 0,1% TritonX-100.
2. Diasscanning
- Digitaliser diasene ved at scanne dem på en fluorescensdiasscanner ved 20x forstørrelse (diasscannerdetaljer findes i materialetabellen).
BEMÆRK: En repræsentativ scanning af et optimalt multiplex er vist i figur 1.
3. Billedanalyse
- Importer scanningerne til en billedanalysesoftware (File > Open Image).
- Gå til fanen Klassificeringer , og vælg DenseNet AI V2-plugin .
- Træn DenseNet AI V2-pluginet til at genkende kerner ved at omgive omkring 500 kerner i et billede.
- Træn AI på flere andre dias fra samme batch og forskellige batcher af mIF-farvning ved at omgive flere kerner (50) på flere dias (ca. 10).
BEMÆRK: Detaljerede instruktioner om, hvordan du bruger AI-pluginet, findes i softwaremanualen. Brug af AI til kernedetektion er valgfri. Andre metoder til påvisning af kerner er tilgængelige afhængigt af den anvendte billedanalysesoftware. - Gem den trænede AI (klassificeringshandlinger > gem).
- Gå til fanen Anmærkninger , og opret en anmærkning for hver interesseregion (ROI), såsom midten af tumoren og tumorens margen, ved hjælp af Pen Annotation Tool.
- Fjern om nødvendigt områderne med folder og de områder, der ser slørede ud, med værktøjet til anmærkning af udelukkelse.
BEMÆRK: Hematoxylin-eosinfarvning af et afsnit ved siden af det, der anvendes til mIF, kan udføres før mIF-farvning for at sikre, at tumorceller er til stede i prøven og for at hjælpe anatomiopatologer med at bestemme ROI'erne. - Gå til fanen Analyse, og vælg HighPlex FL-algoritmen (Indstillinger Handlinger > Indlæs > HighPlex FL).
- Vælg fanen Valg af farvestof , og vælg det farvestof, der er af interesse.
- På fanen Nuklear detektion skal du gå til Nuklear segmenteringstype og vælge AI-brugerdefineret.
- I Nuclear Segmentation Classifier, skal du vælge den AI, der blev gemt i trin 3.5.
- På fanen Membran- og cytoplasmadetektion skal du vælge den maksimale cytoplasmaradius (i denne undersøgelse blev 1,5 brugt) og antallet af membranfarvestoffer.
- For hvert farvestof skal du vælge kernens positive tærskel, cytoplasmaets positive tærskel og membranens positive tærskel.
BEMÆRK: Tærsklen er forskellig for hver farvning og bør justeres for hvert parti dias og hvert antigenfarvet. Brug af værktøjet Vis indstillinger (Vis > Vis indstillinger) kan hjælpe med at vælge en passende tærskel ved hjælp af intensitetsværdien i slutningen af intensitetstoppestedet (til højre). - For hvert farvestof skal du vælge kerne-, membran- og cytoplasmaprocenten af fuldstændighedsværdier.
BEMÆRK: Denne parameter er vigtig for at undgå falsk positiv registrering, når to celler med forskellig farvning er tæt på hinanden (figur 2). - Gem algoritmen (Indstillinger Handlinger > Gem).
- Analyser ROI'erne (Analyser > annotationslag).
- Gå til fanen Resultater , og vælg alle dataene i Objektdata (ctrl + A).
- Eksporter dataene i .csv format (Højreklik > Eksporter > objektdata . Csv).
BEMÆRK: Denne tabel indeholder positionen (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) og positiviteten af hver markør for hver analyseret celle.
4. Bioinformatik ved hjælp af R
BEMÆRK: Et R-script med flere detaljer om følgende trin er tilgængeligt på GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline til analyse af multipleximmunofluorescensfarvninger. [github.com])
- Brug den eksporterede tabel til først at definere de forskellige celletyper baseret på colokaliseringsfarvningerne. Definer for eksempel cytotoksiske T-celler ved dobbeltpositive CD3 + / CD8 + celler.
- Rekonstruer derefter et forenklet billede af diaset på et prikplot ved hjælp af koordinaterne, der eksporteres fra billedanalysesoftwaren og ggplot2 (Figur 3). Ved hjælp af disse data kan flere typer analyser udføres:
- Analyse af tæthed
BEMÆRK: Den enkleste analyse er en densitetsanalyse.- Udfør en densitetsanalyse for alle celletyperne ved hjælp af hele diaset til biopsier eller et bestemt område af vævet. For eksempel beregne tætheden af CD3 + og CD8 + T-celler i midten af tumoren og tumorens margen (figur 4A-C).
- For at beregne disse tætheder skal du bruge billedanalysesoftware til at producere en bestemt dataramme pr. prøve med fænotypen og koordinaterne for hver celle. Gennem en klyngefunktion (k-nærmeste nabo) på R oprettes et polygonobjekt ved hjælp af grænserne for den studerede biopsi, og beregne tætheden af celletyperne af interesse inde i den.
BEMÆRK: Dette giver mulighed for at sammenligne tæthederne af forskellige celletyper mellem forskellige tilstande (såsom forskellige tidspunkter, behandlingstyper, vævstyper og respons på behandlingen) og lokaliseringer (tumorens centrum, tumormargin, stromafibrose og nekroseområde) afhængigt af den biologiske hypotese. På grund af den høje nærhed mellem kræftceller, peritumorale celler og tumorinfiltrerende celler kan billedanalysesoftwaren detektere dobbeltpositive celler som immun- og kræftceller på samme tid. I så fald skal man bioinformatisk rette op på dette problem ved at nævne, hvad disse dobbeltpositive celler er. I dette tilfælde blev CD3 + CD8 + cytokeratin + celler mærket som cytotoksiske celler, fordi cytokeratinpositiviteten skyldtes tumorcellerne omkring de infiltrerende lymfocytter.
- Varmekort
- Brug tætheden af hver celletype fra forskellige paneler og ved at anvende en normalisering (f.eks. Skaleringscentrering) tegne varmekort (figur 5), der repræsenterer cellemængden i populationen af prøver.
- Ved hjælp af hierarkisk uovervåget klyngedannelse baseret på celletæthed klynger patienter med lignende TME-sammensætninger og korrelerer disse klynger med kliniske parametre såsom behandlingsrespons og overlevelse.
BEMÆRK: Heatmaps og clusterization kan nemt udføres med R ComplexHeatmap-pakken9.
- Rumlig cellefordeling
- Beregn bioinformatisk afstandene mellem cellerne (f.eks. immun- og tumorceller; Figur 6A, B) baseret på cellekoordinaterne fra billedanalysen. Brug medianen og middelafstandene mellem de relevante celletyper til at sammenligne cellenærhed på tværs af alle prøverne i en kohorte.
- Rumlige beskrivende funktioner
- Brug krydstypen nærmeste nabo G-cross-funktion, tilgængelig via R-spatstatpakken10, til at bestemme sandsynligheden for en celle af interesse, X (f.eks. En tumorcelle), der møder den nærmeste celle, Y (f.eks. En T-celle), inden for en bestemt radius omkring celle X.
- Beregn arealet under den empiriske kurve for at opnå en numerisk værdi, der repræsenterer tumorinfiltrationen af CD3 + T-celler omkring tumorcellerne11 (figur 6C). Brug andre rumlige beskrivende funktioner såsom F-funktionen eller J-funktionen12.
- Immunoscore analyse
- Beregn immunscoren (I), udviklet af teamet af Galon7,8, ved hjælp af densiteten af CD3 + og CD8 + T-celler i midten af tumoren og tumorens invasive margen.
BEMÆRK: Scoren spænder fra I0 til I4. En lav tæthed af både CD3 + og CD8 + T-celler i midten og tumorens margen er forbundet med en score på I0, mens en høj densitet af CD3 + og CD8 + T-celler i begge regioner er forbundet med en score på I4. For nylig blev den prognostiske virkning af Immunocore valideret i en undersøgelse med prøver fra 2.681 fase I-III tyktarmskræftpatienter fra 14 centre i 13 lande7. For at blive beregnet kræver immunscore imidlertid en kirurgisk resekteret prøve, der indeholder både tumorens centrum og margin. For biopsier, som normalt mangler en margin, er der for nylig udviklet en biopsitilpasset immunscore13. - For at beregne den biopsitilpassede immunscore skal du konvertere værdien af CD3+- og CD8+-T-celletætheden til en percentil og derefter bruge den gennemsnitlige percentil af CD3+- og CD8+ T-celler til scoring i en af tre kategorier (dvs. lav, mellemliggende og høj)13.
- Beregn immunscoren (I), udviklet af teamet af Galon7,8, ved hjælp af densiteten af CD3 + og CD8 + T-celler i midten af tumoren og tumorens invasive margen.
- Analyse af hotspots
- Brug hotspotanalyse ved hjælp af quadratcount-funktionen (spatstat)10 til at sammenligne densiteterne af forskellige celletyper i det mest infiltrerede område af vævet. For eksempel er det muligt at beregne en "Immunoscore-lignende" score ved hjælp af værdien af CD3- og CD8 T-celletætheden af de mest infiltrerede firkanter i vævet (figur 7). Anvend denne metode til analyse af enhver celletype med en ikke-homogen fordeling over vævet.
- Analyse af tæthed
Representative Results
Efter denne protokol bør flere parametre undersøges for at sikre, at vævet er korrekt farvet. For det første skal TSA-farvningen vise et godt dynamisk område, når der anvendes lave eksponeringstider (typisk 2-100 ms) under scanningsprocessen. En lav eksponeringstid indebærer, at forstærkningen er udført korrekt under reaktionen med HRP. For antigener farvet med det sekundære antistof direkte kombineret med fluorochromen kan eksponeringstiden være meget længere, hvilket kan føre til fotoblegning (et fald i signalintensiteten på grund af en lang eksponeringstid). For det andet er det vigtigt at kontrollere, at hver farvning viser et højt SNR. Et højt baggrundssignal med et lavt antigensignal kan være en indikation af, at det primære antistof ikke er specifikt nok, at de endogene peroxidaser ikke blev inaktiveret korrekt, eller at et trin i protokollen ikke blev udført tilstrækkeligt. For det tredje, afhængigt af diasscanneren og de filtersæt, der bruges til scanningen, er det muligt at se overlapninger mellem to farver (f.eks. AF555, AF594 og AF647). Valg af de rigtige filtersæt på scanneren og den rigtige primære antistoffortynding er afgørende for at undgå mulige krydsdetektioner. Kvalitetskontrol består af påvisning af enkeltfarvede celler for hver markør på den scannede fil. Endelig er det også vigtigt at tilføje en positiv og negativ kontrol for hvert parti farvning. For immunceller er tonsillen en god positiv kontrol. Et repræsentativt resultat af optimal farvning er vist i figur 1.
Figur 1: Lokalt fremskreden rektal cancer farvet af multiplex immunofluorescens. Forkortelser: PD-1 = programmeret celledødsprotein 1; PD-L1 = Programmeret dødsligand 1; ROR-γ = RAR-relateret orphan receptor gamma; CD3 = klynge af differentiering 3; hPanCK = humant pan-cytokeratin. Hver antigenfarvning scannes i gråtoner, og farverne i figuren er pseudofarver. Lav forstørrelse af skalabjælke: 200 μm; Skalabjælke Høj forstørrelse: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nuclei og farvning påvisning af en lokalt avanceret rektal cancer ved hjælp af en billedanalyse software. Uden parameteren procentdel af fuldstændighed korrekt indstillet registrerer softwaren to CD8 + celler (grøn cirkel), fordi de er tæt på hinanden, men kun en celle er farvet. Brug af 70% fuldstændighed hjælper med at undgå denne falske positive registrering. Grøn = hPanCK; Gul = CD3; Orange = CD8. Skalabjælke: 100 μm Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Billedanalyse og R-dot-plot rekonstitution af en leverkolorektal cancermetastase. På multiplexfarvningen (venstre) er humant pan-cytokeratin i gult, CD3 er i grønt, CD8 er i lyseblå, og IDO er i orange. På prikplottet (højre) er humane pan-cytokeratin + celler i gul, CD3 + CD8 - celler er i grønt, CD3 + CD8 + celler er i blåt, og IDO + celler er i orange. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af en kirurgisk sektion af en HNSCC. (A) En kirurgisk sektion af en HNSCC. Kræftceller er synlige i grønt. Peritumorale celler visualiseres omkring tumorøerne (CD3 i gul og CD8 i lilla). (B) Tumorens centrum (i gult med en sort kant) beregnes bioinformatisk af k-nærmest-naboalgoritmen baseret på afstanden mellem tumorøerne fra et enkelt område. Omkring dette område beregnes en invasiv margen (lysegul med grå kant) vilkårligt 500 μm. (C) Invasive T-celler fremhæves med sorte prikker i midten af tumoren og grå prikker i den invasive margen. Andre T-celler er fremhævet med lysegrønne prikker. Vægtstang: 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Heatmap over tætheden af forskellige celletyper af lokalt avancerede rektal cancer biopsier. Varmekortet blev tegnet ved hjælp af uovervåget klyngedannelse af tæthederne af forskellige celletyper fra forskellige multiplexpaneler med ComplexHeatmap-pakken. Skalering og centrering blev brugt til normalisering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Afstande af CD4+ og CD8+ cellerne til hver IDO+ eller tumorcelle. Humane pan-cytokeratin + celler er i gul, CD3 + CD8 - celler er i grønt, CD3 + CD8 + celler er i blåt, og IDO + celler er i orange. (A) Den nærmeste afstand mellem tumorceller og hver CD8 + T-celle. (B) Barplots af afstandene mellem IDO+ celler og hver CD8+ T-celle (blå) eller CD4+ T-celle (grøn). (C) Eksempel på en prøve analyseret af G-cross-funktionen. Y-aksen viser sandsynligheden for, at en tumorcelle støder på en CD3+ lymfocyt i en radius fra 0-200 μm omkring tumorcellen. Tre kurver vises; den teoretiske kurve er i stiplet grønt (Poisson-fordeling), den korrigerede empiriske kurve med km-korrektion er i sort, og den korrigerede empiriske kurve med kantkorrektion er i stiplet rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Illustration af en quadratcount. Grænseberegning og quadratcount blev udført ved hjælp af spatstats-pakken. De mest infiltrerede firkanter (hotspots) kan bruges til downstream-statistikker. CD4 er i grønt, CD8 er i rødt, og tumorceller er i gult. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Antistoffortynding og optimering af antigenhentning. Kromogen påvisning af PD-1 ved anvendelse af tre forskellige fortyndinger og to forskellige antigenhentningsopløsninger af det primære antistof (citrat pH 6 og EDTA pH 9). Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primært antistof | Fortynding | Antigen hentning | Sekundært antistof | Fluorochrom | Position |
| PD-1 | 1/100 | EDTA (pH 9) | Anti-kanin | AF647 | 1 |
| PD-L1 | 1/1000 | EDTA (pH 9) | Anti-kanin | AF488 | 2 |
| ROR-γ | 1/200 | EDTA (pH 9) | Anti-mus | ATT0-425 | 3 |
| CD3 | 1/100 | Citrat (pH 6) | Anti-kanin | AF555 | 4 |
| hPanCK | 1/50 | Citrat (pH 6) | Anti-mus kombineret med AF750 | 5 | |
Tabel 1: Eksempel på et optimeret multiplexpanel. Forkortelser: PD-1 = programmeret celledødsprotein 1; PD-L1 = Programmeret dødsligand 1; ROR-γ = RAR-relateret orphan receptor gamma; CD3 = klynge af differentiering 3; hPanCK = humant pan-cytokeratin; AF = AlexaFluor; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre. CD3 bruges til at detektere T-lymfocytter; PD-1 bruges til at detektere udmattede lymfocytter; ROR- γ bruges til at detektere Th-17; og hPanCK bruges til at detektere tumorceller. Positionskolonnen angiver den rækkefølge, som det sekventielle multiplex skal udføres i.
Discussion
De vigtigste parametre, der skal tages i betragtning for at optimere multiplexfarvning, er fortyndingen, specificiteten og antigenhentningen, der anvendes til hvert primært antistof. Før du starter en multiplexprotokol, skal hvert primært antistofs optimale fortynding og optimale epitophentning (pH 6 eller pH 9) testes ved hjælp af kromogen farvning (DAB). Vi anbefaler at teste tre fortyndinger for hver antigenhentningsbuffer: den fortynding, der normalt specificeres af mærket, der kommercialiserer antistoffet, den samme fortynding delt to gange og den samme fortynding multipliceret to gange (figur 8). Valg af den rigtige fortynding er et meget vigtigt skridt til at verificere antistofspecificiteten og optimere signal-støjforholdet (SNR) for farvningen. Efter valg af den rigtige fortynding i DAB skal den samme fortynding testes for hvert primært antistof ved anvendelse af uniplex TSA. Når fortyndings- og epitophentningsbufferen er valgt for hver antigenfarvning, er det også vigtigt at indstille multiplexsekvensen korrekt; Specifikt farves nogle antigener bedre i den første position og andre i den sidste position. Vi anbefaler at teste multiplexmærkningen ved hjælp af alle mulige ordrepermutationer for at vælge, hvilken antigenfarvning der skal komme først, anden osv. Dette er også et meget vigtigt skridt, fordi nogle skrøbelige antigener kan nedbrydes efter flere runder af epitophentning, og nogle antigener er bedre farvet efter flere runder af epitophentning. For eksempel er SNR altid højere i den sidste position for CD3 og i den første position for PD-1-farvning. Desuden kan farvningen af flere co-lokaliserede antigener hindres af en paraplyvirkning (mætning af tyramidrereaktive steder). Dette kan dæmpes ved at nedsætte tyramidkoncentrationen. Når ekspressionen af et antigen er betinget af ekspressionen af et andet (CD8 kun til stede på CD3-ekspressive T-celler), anbefaler vi farvning af antigenet med det bredeste udtryk (CD3 i dette tilfælde) efter det andet. Endelig er det også et vigtigt skridt at vælge den rigtige fluorochrom til hver antigenfarvning i henhold til scannerens specificiteter for at undgå krydsdetektion.
De største fordele ved denne teknik er forstærkningen og signal-støj-forholdet opnået. Denne teknik kommer dog med en begrænsning, som er, at farvningen er sekventiel, og fluorkromerne er kovalent bundet til vævet. Ikke desto mindre er det efter at have udført alle tyramidsignalforstærkningsrunder også muligt at tilføje en sidste farvning med et sekundært antistof direkte kombineret med en fluorochrom (ingen TSA). I nogle paneler brugte vi denne metode til at tilføje farvning i 750-kanalen. Dette var nødvendigt, fordi ingen tyramid-AF750 var kommercielt tilgængelig på det tidspunkt. Bemærk, at eksponeringstiden (under scanningen) af antigenet farvet med AF750 vil være meget længere end for de andre antigener, der er farvet med TSA. I så fald anbefaler vi farvning af et stærkt udtrykt protein, såsom cytokeratin eller forøgelse af koncentrationen af det primære antistof. Ved at gøre det er det muligt at plette maksimalt fem til seks antigener pr. dias i en batch afhængigt af fluorescensscanneren.
I modsætning hertil bruger flere kommercielt tilgængelige teknikker seriel farvning med flere runder farvning, scanning og stripping eller fotoblegning for at forbedre antallet af antigener, der kan farves på en enkelt vævssektion. Disse teknikker er dog ofte tidskrævende, dyre, har ingen signalforstærkning, kræver avancerede beregningstrin for at flette de serielle scanninger korrekt og kan efter vores erfaring fremkalde irreversibel vævsskade på grund af de mange proceduretrin. Ikke desto mindre er det blevet rapporteret, at op til 30 antigener kunne farves på et enkelt væv ved hjælp af denne metode14.
Afslutningsvis er vores metode en robust, reproducerbar, brugervenlig og omkostningseffektiv immunhistofluorescensteknik, der kan bruges i ethvert laboratorium, der har en fluorescensdiasscanner. Ethvert kommercialiseret primært antistof, der er egnet til IHC, kan anvendes, og panelerne er ikke specifikke for kommercielle sæt. Billedanalysen kan udføres på flere forskellige programmer, herunder open source-programmer som QuPath og R. Vi mener dog, at denne metode endda kan forbedres i fremtiden for store antigenpaneler, hvilket giver mulighed for at udføre seriel farvning/scanning af det samme dias med forskellige antigenpaneler og med fordelen ved signalforstærkning.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Derouane F for hendes hjælp og støtte. Nicolas Huyghe er forsker støttet af et tilskud fra den belgiske nationale fond for videnskabelig forskning (Télévie/FNRS 7460918F).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
| anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
| anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
| anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
| anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
| anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
| ATTO-425 | ATTOtec | ||
| Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 - emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
| Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
| Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
| Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
| HALO software | Indicalabs | ||
| Hoescht | Sigma | 14533 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
| Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
| Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
| Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |
References
- Ge, P., et al. Profiles of immune cell infiltration and immune-related genes in the tumor microenvironment of colorectal cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109228 (2019).
- Fridman, W. H. The immune microenvironment as a guide for cancer therapies. Oncoimmunology. 1 (3), 261-262 (2012).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: Impact on clinical outcome. in Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Calu, V., et al. Key biomarkers within the colorectal cancer related inflammatory microenvironment. Scientific Reports. 11 (1), 7940 (2021).
- Havel, J. J., Chowell, D., Chan, T. A. The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 133-150 (2019).
- Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
- Mlecnik, B., et al. Integrative analyses of colorectal cancer show immunoscore is a stronger predictor of patient survival than microsatellite instability. Immunity. 44 (3), 698-711 (2016).
- Gu, Z., Eils, R., Schlesner, M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 32 (18), 2847-2849 (2016).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial Point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2022).
- Barua, S., et al. Spatial interaction of tumor cells and regulatory T cells correlates with survival in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 117, 73-79 (2018).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- El Sissy, C., et al. A diagnostic biopsy-adapted immunoscore predicts response to neoadjuvant treatment and selects patients with rectal cancer eligible for a watch-and-wait strategy. Clinical Cancer Research. 26 (19), 5198-5207 (2020).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
