Summary
本协议描述了一种大型动物运动试验模型，用于评估心血管系统在临床前环境中评估新疗法效率的功能能力。它与临床运动测试相当。
Abstract
尽管在治疗方面取得了进展，但心血管疾病仍然是全世界死亡和发病的最大原因之一。基于基因治疗的治疗性血管生成是一种有前途的方法，用于治疗有明显症状的患者，尽管有最佳的药物治疗和侵入性操作。然而，许多有前途的心血管基因治疗技术未能在临床试验中达到预期。一种解释是用于衡量疗效的临床前终点和临床终点不匹配。在动物模型中，重点通常放在易于量化的终点上，例如从组织学切片计算的毛细血管的数量和面积。除了死亡率和发病率外，临床试验的终点是主观的，例如运动耐量和生活质量。然而，临床前和临床终点可能测量应用疗法的不同方面。然而，开发成功的治疗方法需要这两种类型的终点。在诊所，主要目标始终是缓解患者的症状并改善他们的预后和生活质量。为了从临床前研究中获得更好的预测数据，终点测量必须与临床研究中的测量更好地匹配。在这里，我们介绍了临床相关的猪跑步机运动测试方案。本研究旨在：（1）提供可靠的猪运动测试，可用于评估基因疗法和其他新疗法的安全性和功能有效性，以及（2）更好地匹配临床前和临床研究之间的终点。
Introduction
慢性心血管疾病是全世界死亡和发病的重要原因1,2。尽管目前的治疗方法对大多数患者有效，但由于弥漫性慢性疾病或合并症等原因，许多人仍然无法从目前的治疗中受益。此外，在一些患者中，可用的治疗并不能缓解心脏症状，尽管进行了最佳药物治疗，他们的心血管疾病仍会进展3。因此，显然需要为严重的心血管疾病开发新的治疗方案。
在过去的几年中，已经发现了新的分子途径和操纵这些靶点的方法，使基因疗法，细胞疗法和其他新疗法成为治疗严重心血管疾病的现实选择4。然而，在有希望的临床前结果之后，许多心血管应用未能满足临床试验的期望。尽管临床试验疗效不佳，但一些试验已经建立了新疗法的良好安全性5,6,7,8,9。因此，为患者带来新的心血管疗法将需要改进的方法和更好的临床前模型、研究环境和可以预测临床疗效的临床前研究的终点。
在动物模型中，重点通常放在易于量化的终点上，例如从组织学切片计算的毛细血管的数量和面积，或从静息和药理应激下的左心室成像参数。在临床试验中，许多终点更加主观，例如运动耐量或症状缓解4。因此，临床前研究和临床试验中的终点很可能测量应用疗法的不同方面。例如，血管数量的增加并不总是与更好的灌注、心脏功能或运动耐量相关。然而，开发成功的治疗方法需要两种类型的终点10。尽管如此，主要目标始终是缓解症状并改善患者的预后和生活质量。为了实现这一目标，终点测量必须在临床前和临床研究之间更好地匹配4。
心肺健康反映了循环和呼吸系统在持续体力活动期间提供氧气的能力，因此它量化了个体的功能能力。功能能力是关键的预后标志，因为它是心血管和全因死亡风险的强有力的独立预测指标11。心肺健康的改善与死亡风险降低有关12。运动测试适用于评估心血管疾病的有氧表现和治疗反应。根据可用性，在自行车测力计或跑步机上进行测试。通常使用每分钟工作量的逐渐增加，避免突然增加;这导致线性生理反应。运动测试中最重要的变量包括总运动时间、达到的代谢当量 （MET）、心率以及 QRS 波群（Q、R 和 S 波）和 T 波（ST 段）之间心电图 （ECG） 线的变化。临床压力测试成本低，易于获得13.由于这些原因，压力测试，如6分钟步行测试，已被广泛用于临床，也应该用于新疗法的临床前评估。
据我们所知，没有描述良好的大型动物模型来评估基因疗法或其他新疗法的功能疗效。因此，临床相关的运动测试为评估这些新疗法在临床前环境中的效率提供了一个极好的视角。
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Protocol
所有实验均得到东芬兰大学动物实验委员会的批准。该协议描述了一种临床相关的猪跑步机运动测试，以评估心脏病新疗法的安全性和有效性。本研究使用体重25-80公斤的雌性家猪。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 设置跑道
- 设置跑道，使动物只能向一个方向移动。使用门和舱口防止动物后退。跑道的平面图如图 1 所示，跑道示例如图 2 所示。
- 确保跑步机（见 材料表）有足够的空间来改变倾斜度。
- 确保跑步机的宽度可调，以防止动物在跑步过程中转动。
- 使用透明塑料制作跑步机的前壁。这可以防止动物从跑步机上跑开，但仍然允许动物透过墙壁看到。
注意：动物必须能够透过前墙看到，因为我们的经验表明，如果猪看到墙的另一侧的猪同伴，它们就会更有动力奔跑。 - 将心电监护仪和除颤器（见 材料表）放在跑步机旁边。
注意：在压力测试期间可能发生致命的心律失常，特别是如果猪有心肌缺血14,15,16。 - 确保跑道包括一个饮水点，动物可以在跑步后喝水和降温。
2.猪在试验前的适应期
- 在开始实验之前，将动物安置2周。
- 在适应环境的第一周，确保动物习惯他们的处理者和新的住房环境，不包括跑道。
- 在适应期的第二周，确保动物习惯跑道。
- 开始习惯，让动物熟悉跑道。首先，保持所有大门打开，以便动物可以在赛道上自由行走并探索环境。
- 当动物对赛道比较熟悉时，打开跑步机，让动物一次跑一小段时间，比如7分钟。运行时间的长度必须每天延长。
注意：记得在适应期间奖励动物。例如，在本研究中，猪获得了无盐爆米花的奖励。
3.运动试验
注意：猪应在运动测试前至少 2 小时禁食或在跑步前只喂一小部分食物。
- 打开跑步机并将坡度设置为5%-10%。
- 一旦动物在跑步机上，以 2 公里/小时的启动速度启动跑步机。
- 每 60 秒将速度提高 0.5 公里/小时，直到达到 5 公里/小时。总运行时间为15分钟。
- 如果动物无法以最大速度全程奔跑，请执行以下步骤。
- 如果猪没有跑到选定的速度，从后面轻轻地推它，因为这可能会给动物一种感觉，它需要跑得更快而不会减速。
- 尝试轻轻推动动物最多三次;之后，一次将速度减慢 0.5 公里/小时，直到猪能够处理速度。不要减速到2公里/小时以下。
- 如果动物即使以低速也拒绝跑步，请关闭跑步机并停止测试。
4. 运动测试期间的心电图监测
- 将心电图电极（见 材料表）放置在跑步过程中运动最小的解剖位置，例如肩胛骨或胸部。
注意：使用专为运动测试设计的心电图电极，以获得更好的皮肤粘附。请记住从放置ECG电极的区域剃掉头发。 - 记录跑步过程中的心率变化。
注意：我们的经验表明，ST段分析通常由于移动和其他伪影而变得复杂。节律监测也可以使用植入式循环记录器或起搏器来完成。
5. 数据收集
- 记录每次更改速度时的运行距离、总时间和速度。
注意：现代跑步机可能会收集许多其他数据，因此必须熟悉跑步机手册以充分发挥设备的潜力。 - 注意动物行为的可能变化，例如跛行。
注意：如果需要，请联系兽医并确保动物接受必要的镇痛。将动物从未来的锻炼中移开，直到它完全恢复。
6. 术后护理
- 确保动物可以进入供水点。
- 例如，用零食或玩具奖励动物。
- 跑步后监测动物30分钟是否有可能的不良反应。
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Representative Results
必须具有与大型动物合作的经验才能成功使用此协议。研究人员需要能够评估动物是否由于疲劳或缺乏动力而停止奔跑。记录速度和距离可能有助于评估这一点，像往常一样，缺乏动力的动物完全停止奔跑，而疲劳的动物在放慢速度后继续奔跑（图3）。如有必要，如果结果似乎不可靠，可以在第二天重复该方案。
腺相关病毒（AAV）处理动物的代表性时间表如图 4所示。时间表可能因研究环境而异，特别是关于圣化时间点。在计划实验时注意适应期。
可以将结果与其他器官结构和功能测量（例如心脏回声）进行比较，以了解运动耐量与这些其他测量值的关系。例如，跑步距离的变化与射出分数的变化相关。由于射血分数低，动物在整个运动测试中无法全速奔跑（图5）。分析的变量可能因研究设置而异。该协议可以比较总跑步距离、速度变化、MET、心率变化和心律失常。
在运动测试期间记录心电图（图6）。由于伪影，ST段分析很困难。在整个运动测试过程中，可以通过心电图测量心率间隔的变化。
图 1：跑道的平面图。动物不奔跑的地方标有（A）。一次一只动物通过走廊（B）被引导到跑步机[区域（C）]。区域（A）和（B）之间的大门关闭，以确保一次只有一只动物进入跑道，其他动物留在（A）区域。其他动物必须留在（A区），因为跑步机上的动物可以看到（A）区的其他动物，这激励它们跑步。跑步机和区域（B）之间的门是关闭的，以确保动物不能从跑步机上退下来。跑步机从 （D 区） 运行，动物在跑步后通过区 （D） 返回 （A） 区。在本例中，在（A）区安装了一个饮水点，动物可以在跑步后饮水和降温。符号：黑色箭头表示旋转方向，四分之一圆表示门。请点击此处查看此图的大图。
图2：跑道的代表性图像 。 （A）只有一条可用路线对动物的重要性。（B）跑步机，应具有可调节的宽度，以防止动物在跑步过程中转动。（C）除奔跑的动物外，还用于容纳另一只动物的封闭空间。当动物看到自己物种的成员时，它们更有动力奔跑。（D）动物用水点的例子，动物可以在压力测试后冷却和饮用。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：跑步距离和速度 。 （A）四头健康猪总跑距离的代表性数据。试验动物的平均总跑距离为970 m，总距离的标准差为80 m。 （B）猪间速度变化数据。速度以 0.5 公里/小时的间隔减慢，直到猪能够处理速度。 请点击此处查看此图的大图。
图4：代表性时间表。 请注意，研究之间的时间点可能有所不同。然而，值得注意的是，由于适应期，动物应在开始实验前 3 周到达实验动物中心。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：运行距离与射血分数变化的相关性。 跑步距离变化与射出分数变化的相关性。静止时的射出分数通过双翼辛彭法测量。射血分数与基线的变化与起搏器诱发的心力衰竭猪的奔跑距离变化相关，r = 0.2831，p = 0.0284，R2 = 0.0801。尽管 r和 R 2 较低，但左心室射血分数百分比 （LVEF%） 的变化往往会影响跑步距离。需要注意的是，有几个因素会影响测量变量，从而影响结果。 请点击此处查看此图的大图。
图6：健康猪的代表性心电图磁带。 顶部心电图面板显示运动测试开始后 3 分钟的心电图。底部的心电图条显示运行10分钟后的心电图。心电图可用于评估试验动物心率的差异。顶部心电图面板的心率为每分钟 176 次，底部心电图条的心率为每分钟 250 次。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这种大型动物运动试验模仿了临床中使用的试验，缩小了临床前研究和临床试验之间终点的差距。它可用于评估严重心血管疾病的新疗法的疗效，例如闭塞性动脉硬化，心力衰竭和缺血性心脏病。本协议中应用的时间点可能因测试的治疗而异。该方案已基于与大型动物合作的长期经验进行标准化，可用于评估心血管基因治疗和其他新型治疗方法的安全性和有效性。
猪的心脏和心血管系统与人体的生理、解剖学和功能相似。因此，猪经常被用来模拟心血管疾病的机制和治疗程序17。我们猪研究的随访时间长达12个月18;然而，随着动物在漫长的随访期间的成长，处理这些动物变得越来越具有挑战性。
该方法由各种关键步骤组成，这些步骤对于测试的成功至关重要，并且之后无法纠正。首先，猪的跑步动机存在个体差异。在整个测试过程中，让动物有动力跑步并保持足够的动力至关重要。这确保了所有时间点都是可比的。保持猪的奔跑动机需要对其个体行为特征有特定的了解。动物在运动测试前必须适应跑步机和测试环境。猪被教导在跑步机上，它们的成功表现会得到奖励。增加跑步动力的另一种方法是将其他测试动物保持在跑步者的视野中。
避免典型的解剖缺陷，例如不同的腿部问题，很重要。最常见的解剖缺陷是蹄部疾病、先天性肢体畸形以及事故引起的问题，如撕裂伤、肩胛骨损伤、骨折和伤口。这些主要是由于栖息地，事故，遗传因素和喂养异常19。腿部无力导致行走不协调，无法参加运动测试。此外，如果在研究过程中出现腿部无力，则必须将动物排除在测试之外。腿部问题可以通过选择腿部结构完整的猪来避免。在研究过程中，可以通过猪舍的良好条件来预防腿部受伤。必须避免坚硬、腐蚀性的表面，并保持总体卫生。猪必须适度喂食，以免体重增加太快，因为这会拉伤它们的腿。此外，猪必须小心地放在猪圈中，以免发生意外，并且应该有足够的刺激，例如玩具，这样它们的咀嚼就不会针对其他猪。
在运动测试期间，用3导联心电图或植入式循环记录器记录心电图。它不如 12 导联心电图准确，但仍然可以评估多个变量，例如心律失常和心率。几种类型的错误和干扰可以伪造心电图。例如，电极连接不正确、皮肤和电极接触不良以及骨骼肌收缩都可能导致错误。在整个测试过程中，电极必须牢固地保持在原位。这是具有挑战性的，因为皮肤在跑步过程中会变热并出汗。皮肤和电极之间的接触可以通过剃毛、消毒和去除死皮细胞来改善。此外，肌肉运动会导致影响心电图的伪影13。这可能会挑战对ST段的解释。此外，心电图导联会干扰跑步。然而，这些问题可以通过将心电图导联线牢固地敲击在皮肤上来减少。心电图也可以用植入式循环记录仪或起搏器进行注册。使用植入式循环记录仪解决了3导联心电图使用的许多问题。然而，安装植入式循环记录器是一种具有风险的侵入性操作，例如感染。
研究人员必须在整个测试过程中观察动物的行为，以确保程序的整体安全性。例如，疲惫、严重疲劳、恶心、意识丧失、严重呼吸困难或皮肤发绀是终止运动试验的原因。此外，研究人员必须观察心电图的变化，例如心律失常。然而，凭借训练有素的人员和足够的大型动物工作经验，目前的运动方案可以常规用于临床前研究，以产生临床相关数据，这些数据应该使新治疗方法的临床过渡在临床益处方面更加成功。
Poole等人20 发表了动物运动指南和心血管研究的训练方案。在这些方案中，猪在热身后在跑步机上运动约30分钟。在这30分钟内，测试动物的目标心率区是最大心率的65%-75%。通过改变跑步机的速度或坡度来修改心率。Poole等人的方案和本手稿中提出的15分钟运动测试有多个相似之处，例如适应期，跑步机要求，所选测试动物的体重以及运动后奖励动物的积极强化。在这两种方案中，测试动物的生长都可能超过跑步机的容量，从而限制了随访时间。
Poole等人描述的方案与本手稿中提出的运动测试之间的主要区别在于测试的目的。Poole等人描述的协议旨在引发人类中注意到的经典训练适应。因此，它侧重于中等强度的运动，而 15 分钟的运动测试方法旨在做出接近最大的努力来更好地评估心肺健康。当主观运动水平约为最大心率的 90% 时，即可实现这一点13.15分钟的运动测试模仿诊所使用的测试，逐渐增加运动水平，直到接近最大值。由于协议目的的不同，试验动物的运动频率不同。普尔等人描述，猪每周最多可以跑四次，以达到更好的心血管适应。15分钟的运动测试评估基因疗法和其他新疗法的功能疗效，这就是为什么所需的频率显着降低并且取决于治疗的要求。 图 4 描述了这些要求的一个示例。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢国家实验动物中心的Minna Törrönen，Riikka Venäläinen，Heikki Karhunen和Inkeri Niemi在动物工作方面的帮助。这项研究得到了芬兰科学院、ERC和CardioReGenix EU Horizon资助的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Defibrillator | Zoll M series | TO9K116790 | All portable defribrillators will work |
| Defibrillator pads | Philips | M3713A | All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator |
| ECG electrodes | Several providers | Prefer ECG electrodes designed for exercise tests | |
| Loop recorder | Abbott Oy | DM3500 | Optional for rhythm monitoring |
| Patient monitor | Schiller Argus LCM Plus | 7,80,05,935 | All portable ecg monitors will work |
| Pigs | Emolandia Oy | ||
| Treadmill | NordicTrack | All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test. The treadmill should be as long and wide as possible. | |
| Ultrasound system | Philips EPIQ 7 ultrasound | ||
| Various building materials | Several providers | For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2 | |
| Various treats for the animals |
References
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