Summary
تم وصف إجراء لدراسة ديناميكيات استقلاب الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في الخلايا باستخدام تنسيق لوحة متعددة الآبار والتصوير المناعي الآلي للكشف عن تخليق وتوزيع mtDNA وتحديده. يمكن استخدام هذا أيضا للتحقيق في آثار مثبطات مختلفة ، والضغوط الخلوية ، وإسكات الجينات على استقلاب mtDNA.
Abstract
تتطلب الغالبية العظمى من العمليات الخلوية إمدادا مستمرا بالطاقة ، والناقل الأكثر شيوعا هو جزيء ATP. تنتج الخلايا الحقيقية النواة معظم جزيئات ATP في الميتوكوندريا عن طريق الفسفرة التأكسدية. الميتوكوندريا عضيات فريدة من نوعها لأن لها جينوم خاص بها يتضاعف وينتقل إلى الجيل التالي من الخلايا. على عكس الجينوم النووي ، هناك نسخ متعددة من جينوم الميتوكوندريا في الخلية. تعد الدراسة التفصيلية للآليات المسؤولة عن تكرار وإصلاح وصيانة جينوم الميتوكوندريا ضرورية لفهم الأداء السليم للميتوكوندريا والخلايا بأكملها في ظل الظروف العادية والمرضية. هنا ، يتم تقديم طريقة تسمح بالقياس الكمي عالي الإنتاجية لتوليف وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في الخلايا البشرية المزروعة في المختبر . يعتمد هذا النهج على الكشف المناعي لجزيئات الحمض النووي المركبة بنشاط والتي تم تصنيفها بواسطة دمج 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) والكشف المتزامن عن جميع جزيئات mtDNA مع الأجسام المضادة للحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور الميتوكوندريا بأصباغ أو أجسام مضادة محددة. إن زراعة الخلايا في شكل متعدد الآبار واستخدام مجهر مضان آلي يجعل من السهل دراسة ديناميكيات mtDNA ومورفولوجيا الميتوكوندريا في ظل مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية في وقت قصير نسبيا.
Introduction
بالنسبة لمعظم الخلايا حقيقية النواة، تعتبر الميتوكوندريا عضيات أساسية؛ لأنها تلعب دورا مهما في العديد من العمليات الخلوية. أولا وقبل كل شيء ، الميتوكوندريا هي موردي الطاقة الرئيسيين للخلايا1. تشارك الميتوكوندريا أيضا في تنظيم التوازن الخلوي (على سبيل المثال ، الأكسدة والاختزال داخل الخلايا2 وتوازن الكالسيوم3) ، وإشارات الخلية4,5 ، وموت الخلايا المبرمج6 ، وتوليف المركبات الكيميائية الحيوية المختلفة 7,8 ، والاستجابة المناعية الفطرية9. يرتبط ضعف الميتوكوندريا بحالات مرضية مختلفة وأمراض بشرية10.
يعتمد عمل الميتوكوندريا على المعلومات الوراثية الموجودة في جينومين منفصلين: الجينوم النووي والميتوكوندريا. يشفر جينوم الميتوكوندريا عددا صغيرا من الجينات مقارنة بالجينوم النووي ، لكن جميع الجينات المشفرة بالحمض النووي mtDNA ضرورية لحياة الإنسان. يتم ترميز آلية بروتين الميتوكوندريا اللازمة للحفاظ على mtDNA بواسطة nDNA. تم بالفعل تحديد المكونات الأساسية لرد الميتوكوندريا ، وكذلك بعض عوامل التكوين الحيوي للميتوكوندريا (تمت مراجعتها في البحث السابق11،12). ومع ذلك ، لا تزال آليات تكرار الحمض النووي للميتوكوندريا وصيانتها بعيدة عن الفهم. على عكس nDNA ، يوجد جينوم الميتوكوندريا في نسخ متعددة ، مما يوفر طبقة إضافية لتنظيم التعبير الجيني للميتوكوندريا. لا يعرف الكثير حاليا عن توزيع وفصل mtDNA داخل العضيات ، إلى أي مدى يتم تنظيم هذه العمليات ، وإذا كانت كذلك ، فما هي البروتينات المشاركة13. يعد نمط الفصل أمرا بالغ الأهمية عندما تحتوي الخلايا على مجموعة مختلطة من الحمض النووي mtDNA من النوع البري والمتحول. قد يؤدي توزيعها غير المتكافئ إلى توليد خلايا تحتوي على كمية ضارة من mtDNA المتحور.
حتى الآن ، تم تحديد عوامل البروتين اللازمة لصيانة mtDNA بشكل أساسي عن طريق الطرق الكيميائية الحيوية أو التحليلات المعلوماتية الحيوية أو من خلال الدراسات المرتبطة بالمرض. في هذا العمل ، من أجل ضمان فرصة كبيرة لتحديد العوامل التي نجت من تحديد الهوية سابقا ، يتم وصف استراتيجية مختلفة. تعتمد الطريقة على وضع العلامات على mtDNA أثناء النسخ المتماثل أو الإصلاح باستخدام 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) ، وهو نظير نيوكليوزيد للثيميدين. يتم دمج BrdU بسهولة في خيوط الحمض النووي الوليدة أثناء تخليق الحمض النووي ، وبشكل عام ، يستخدم لمراقبة تكرار الحمض النوويالنووي 14. ومع ذلك ، فقد تم تحسين الإجراء الذي تم تطويره هنا للكشف عن BrdU المدمج في mtDNA باستخدام التألق المناعي للأجسام المضادة ل BrdU.
يسمح هذا النهج بالقياس الكمي عالي الإنتاجية لتخليق mtDNA وتوزيعه في الخلايا البشرية المزروعة في المختبر. من الضروري وجود استراتيجية عالية الإنتاجية لإجراء الاختبارات في ظل ظروف تجريبية مختلفة في وقت قصير نسبيا ؛ لذلك ، يقترح في البروتوكول استخدام تنسيق متعدد الآبار لزراعة الخلايا والمجهر الفلوري الآلي للتصوير. يتضمن البروتوكول نقل خلايا هيلا البشرية مع مكتبة siRNA والمراقبة اللاحقة لتكرار mtDNA أو إصلاحه باستخدام وضع العلامات الأيضية للحمض النووي المركب حديثا مع BrdU. يتم الجمع بين هذا النهج مع التلوين المناعي للحمض النووي بمساعدة الأجسام المضادة للحمض النووي. يتم تحليل كلتا المعلمتين باستخدام المجهر الفلوري الكمي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور الميتوكوندريا بصبغة معينة. لإثبات خصوصية البروتوكول ، تم اختبار تلطيخ BrdU على خلايا خالية من mtDNA (خلايا rho0) ، وعلى خلايا HeLa عند إسكات عوامل صيانة mtDNA المعروفة ، وعلى خلايا HeLa بعد العلاج بمثبط تكرار mtDNA. تم قياس مستويات mtDNA أيضا بطريقة مستقلة ، وهي qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحضير خليط siRNA
- قبل يوم واحد من بدء التجربة ، خلايا البذور (على سبيل المثال ، HeLa) على طبق 100 مم بحيث تصل إلى التقاء 70٪ -90٪ في اليوم التالي.
ملاحظة: يجب إجراء جميع العمليات في ظل ظروف معقمة في غرفة التدفق الصفحي. - تحضير الكمية المناسبة من siRNA المخفف إلى تركيز 140 نانومتر في وسط Opti-MEM (انظر جدول المواد). يمكن استخدام صفيحة 96 بئرا كخزان.
- أضف 5 ميكرولتر من محلول siRNA (أو وسيط Opti-MEM لعينات التحكم) إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا السوداء ذات 384 بئرا.
ملاحظة: اعتمادا على عدد عينات siRNA التي تم اختبارها ، يمكن استخدام ماصة إلكترونية أو متعددة القنوات. - قم بإعداد الكمية المناسبة من محلول كاشف نقل RNAiMAX (انظر جدول المواد) في وسط Opti-MEM. أضف 1 ميكرولتر من RNAiMAX لكل 100 ميكرولتر من الوسط.
- أضف 10 ميكرولتر من محلول كاشف النقل إلى كل بئر من لوحة 384 بئرا. الطريقة الأكثر ملاءمة وأسرع للقيام بذلك هي باستخدام موزع الكاشف.
- احتضان siRNA مع كاشف النقل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. تحضير الخلايا للنقل
- أثناء الحضانة (الخطوة 1.6) ، قم بنضح الوسط باستخدام جهاز شفط (انظر جدول المواد) ، واغسل الخلايا ب 3 مل من PBS.
- أضف 1.5 مل من التربسين المخفف 1: 2 في برنامج تلفزيوني ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحقق مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت ؛ إذا كان الأمر كذلك ، أضف 3 مل من وسط DMEM مع 10٪ FBS. الخلايا جيدا ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. خذ ما لا يقل عن 150 ميكرولتر من التعليق ، وعد الخلايا في غرفة عد الخلايا (انظر جدول المواد).
- تحضير معلق الخلية بتركيز مناسب (35000 / مل لخط هيلا) في وسط DMEM مع 10٪ FBS والبنسلين والستربتومايسين.
3. نقل الخلايا
- أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 384 بئرا باستخدام موزع الكاشف. سيؤدي ذلك إلى زرع 700 خلية لكل بئر.
- احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم وضعها في الحاضنة لمدة 72 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).
4. تأسيس BrdU
- قم بإعداد محلول 90 ميكرومتر من BrdU (انظر جدول المواد) في وسط DMEM مع 10٪ FBS.
- عند 56 ساعة بعد نقل siRNA (16 ساعة قبل تثبيت الخلية) ، أضف 10 ميكرولتر من محلول BrdU 90 ميكرومتر إلى كل بئر من لوحة 384 بئر (تركيز BrdU النهائي هو 20 ميكرومتر).
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن ؛ لذلك ، من الأفضل استخدام موزع الكاشف أو الماصة الإلكترونية أو ماصة متعددة الموزعات. تذكر تحضير آبار التحكم دون إضافة BrdU. - احتضان الخلايا لمدة 16 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).
5. وضع العلامات على الميتوكوندريا
- قم بإعداد محلول 20 ميكرومتر من BrdU في DMEM مع 10٪ FBS ، وأضف إليه محلول صبغة تتبع الميتوكوندريا (انظر جدول المواد) بتركيز 1.1 ميكرومتر.
- في 15 ساعة بعد بدء دمج BrdU (1 ساعة قبل تثبيت الخلية) ، أضف 10 ميكرولتر من محلول صبغة تتبع الميتوكوندريا (انظر جدول المواد) إلى كل بئر من لوحة 384 بئر (تركيز الصبغة النهائي هو 200 نانومتر).
ملاحظة: استخدم موزع كاشف أو ماصة إلكترونية أو ماصة متعددة الموزعات. تذكر الاحتفاظ بآبار التحكم دون إضافة BrdU ولكن مع إضافة صبغة تتبع الميتوكوندريا. - احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).
6. تثبيت الخلية
ملاحظة: يتم إجراء جميع عمليات الغسيل بشكل أكثر ملاءمة باستخدام غسالة الصفائح الدقيقة ، بينما تتم إضافة الكواشف بسرعة أكبر باستخدام موزع الكاشف.
- باستخدام غسالة الألواح الدقيقة (انظر جدول المواد) ، اشطف كل بئر مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من PBS. بعد الغسيل الثاني ، اترك 25 ميكرولتر من PBS في البئر.
ملاحظة: ترك برنامج تلفزيوني في البئر يقلل من احتمال انفصال الخلايا أثناء إضافة السائل في الخطوة التالية. يتم الانتهاء من جميع عمليات الغسيل مع ترك برنامج تلفزيوني ؛ لذلك ، يجب دائما تحضير المحلول المضاف في الخطوة التالية بتركيز 2x حيث ستتم إضافته بحجم متساو مع PBS المتبقي. - إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد 8٪ في PBS مع 0.4٪ Triton X-100 و Hoechst 33342 بتركيز 4 ميكروغرام / مل (التركيزات النهائية للكواشف الفردية هي 4٪ و 0.2٪ و 2 ميكروغرام / مل على التوالي) (انظر جدول المواد).
- احتضان اللوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
7. الحجب
- شطف كل بئر أربع مرات مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير ، اترك 25 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في البئر.
- أضف 25 ميكرولتر من 6٪ BSA في PBS (تركيز BSA النهائي هو 3٪) لكل بئر.
- احتضان اللوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
8. إضافة الأجسام المضادة الأولية
- قم بنضح BSA باستخدام غسالة microplate ، واترك 10 ميكرولتر من المحلول في البئر.
- أضف 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي المحضر في 3٪ BSA في PBS. استخدم مضاد BrdU عند 0.8 ميكروغرام / مل ومضاد الحمض النووي عند 0.4 ميكروغرام / مل (التركيزات النهائية للأجسام المضادة هي 0.4 ميكروغرام / مل و 0.2 ميكروغرام / مل ، على التوالي) (انظر جدول المواد).
- احتضان الطبق في الظلام عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
9. إضافة الأجسام المضادة الثانوية
- شطف كل بئر أربع مرات مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير ، اترك 10 ميكرولتر من PBS في البئر.
- أضف 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية 4 ميكروغرام / مل المحضر في 6٪ BSA في PBS (التركيز النهائي هو 2 ميكروغرام / مل). استخدم الأجسام المضادة الخاصة بالنمط المتماثل (IgG1 المضاد للفأر و IgM المضاد للفأر) المترافقة مع الفلوروكرومات مثل Alexa Fluor 488 و Alexa Fluor 555 (انظر جدول المواد).
- احتضان اللوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- شطف كل بئر أربع مرات مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير ، اترك 50 ميكرولتر من PBS في البئر.
- أغلق اللوحة بغشاء لاصق مانع للتسرب (انظر جدول المواد) ، وقم بتخزينها في الظلام عند 4 درجات مئوية. يجب إجراء التصوير في غضون 2 أسابيع.
10. التصوير
ملاحظة: يجب إجراء التصوير باستخدام مجهر آلي واسع المجال ؛ يجب أن يكون المجهر مزودا بمرحلة حركية مزودة بعناصر تحكم لتصوير المناطق الفردية من اللوحة تلقائيا.
- تحقق من إعدادات التركيز البؤري التلقائي في مناطق الزاوية من اللوحة (الآبار A1 ، A24 ، P24 ، P1) وفي المنتصف.
ملاحظة: للتصوير ، يوصى باستخدام هدف مسافة عمل قصيرة 20x (انظر جدول المواد) بأعلى فتحة رقمية ممكنة. - استنادا إلى الرسوم البيانية للكثافة التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج التصوير في وضع العرض المباشر ، حدد وقت تعريض طويل بما فيه الكفاية لقنوات التألق الفردية بحيث لا تكون الصورة الناتجة مفرطة التشبع.
- اضبط العدد المناسب من الطائرات للتصوير على المحور z.
ملاحظة: مجال الرؤية عند التكبير 20x كبير بما يكفي بحيث لا تكون جميع الخلايا في نفس مستوى التركيز ، لذلك يجب إجراء المقطع z لعرض جميع الخلايا في مستوى التركيز الصحيح. عادة ، خمس طائرات كافية. اعتمادا على توفر مساحة القرص ، يمكن حفظ مكدسات z الفردية أو توقعات الكثافة القصوى فقط. يعتمد تحليل الصورة الموضح في قسم النتائج التمثيلية على توقعات الكثافة القصوى. - حدد العدد المناسب من حقول العرض لعرضها لكل بئر.
ملاحظة: اعتمادا على الالتقاء ، يمكن تصوير ما يقرب من 60-300 خلية في مجال رؤية واحد. عادة ، بالنسبة لخلايا HeLa ذات التقاء 60٪ -90٪ ، فإن تصوير خمسة مجالات رؤية سيسمح للمرء بالتحليل من 500 خلية إلى أكثر من 1000 خلية. - حدد الآبار المراد تصويرها ، وابدأ التصوير.
11. التحليل الكمي للصور
ملاحظة: يمكن إجراء التحليل الكمي للصور المكتسبة باستخدام برنامج مفتوح المصدر مثل Cell Profiler15. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم إجراء التحليل باستخدام برنامج ScanR 3.0.0 (انظر جدول المواد).
- ابدأ التحليل عن طريق إجراء تصحيح الخلفية لجميع الصور من جميع القنوات الفلورية. اعتمادا على حجم الكائنات التي تم تحليلها ، حدد حجم المرشح المناسب: 80 بكسل لنوى الخلية و 4 بكسل لبقع BrdU و mtDNA.
- ابدأ في تقسيم الصورة عن طريق إنشاء قناع للكائن الرئيسي بناء على نسبة شدة إشارة التألق إلى خلفية القناة المقابلة لنواة الخلية.
- قم بإنشاء أقنعة للكائنات الفرعية التي تمثل بقع BrdU و mtDNA ، على التوالي ، باستخدام قنوات التألق المناسبة للهياكل المحددة.
ملاحظة: يتم تعيين كل كائن فرعي لأقرب كائن رئيسي (نواة الخلية). - اضبط المعلمات المراد قياسها أثناء التحليل ، وقم بقياس شدة وحدات البكسل الفردية داخل كل قناع لجميع قنوات التألق.
ملاحظة: من الضروري أيضا حساب عدد الكائنات الفرعية المخصصة لنواة خلية معينة ومساحة كل كائن فرعي. - تحديد المعلمات المشتقة المراد حسابها بناء على البيانات التي تم الحصول عليها. للحصول على شدة التألق الكلية لقناة BrdU أو mtDNA ، قم بتلخيص شدة جميع الكائنات الفرعية المخصصة لنواة خلية معينة. للحصول على متوسط شدة التألق ، قسم إجمالي شدة التألق على مجموع مساحة الكائنات الفرعية المخصصة لنواة خلية معينة.
ملاحظة: للتأكد من أن الكائن الفرعي الذي تم إنشاؤه (BrdU أو mtDNA spot) موجود بالفعل في الميتوكوندريا ، من الضروري بوابتها بناء على شدة التألق من صبغة تتبع الميتوكوندريا. - قم بإجراء مزيد من التحليل للبيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج ScanR باستخدام البرنامج الإحصائي R 4.2.216 جنبا إلى جنب مع الحزم التالية: dplyr 17 و data.table 18 و ggplot219 و ggpubr20. هذه الخطوة اختيارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر مخطط لإجراء الدراسة عالية الإنتاجية لديناميكيات تخليق وتوزيع mtDNA في الشكل 1. يتيح استخدام تنسيق لوحة متعددة الآبار التحليل المتزامن للعديد من الظروف التجريبية المختلفة ، مثل إسكات الجينات المختلفة باستخدام مكتبة siRNA. تسمح الظروف المستخدمة لوضع العلامات على جزيئات الحمض النووي المركبة حديثا باستخدام BrdU بالكشف عن الحمض النووي المسمى BrdU في الميتوكوندريا لخلايا HeLa (الشكل 2A) ولكن يمكن استخدامها أيضا كشروط انطلاق لإعداد الفحص لأنواع الخلايا الأخرى. يجب اختيار وقت الحضانة مع BrdU لخطوط الخلايا الفردية على أساس تجربة الدورة الزمنية (الشكل التكميلي 1). في الدراسة الحالية ، تم استخدام خلايا HeLa ، لأن فحص siRNAs يتطلب خلايا يمكن نقلها بكفاءة عالية. الأهم من ذلك ، أن الإشارة التي تم الحصول عليها باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل BrdU محددة ، حيث لا يمكن ملاحظتها إلا في الخلايا المعالجة ب BrdU (الشكل 2). تم تأكيد خصوصيات وضع العلامات المضادة ل BrdU والمضادة للحمض النووي باستخدام خلايا rho0 التي تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندريا21 (الشكل التكميلي 2). كما هو متوقع ، في هذه الخلايا ، بغض النظر عن علاج BrdU ، لم يتم الكشف عن أي إشارة في الميتوكوندريا لكل من مضادات BrdU أو للأجسام المضادة للحمض النووي (الشكل 2B). أشار تحديد كمية إشارة الفلورسنت من الأجسام المضادة المضادة ل BrdU إلى أن خلايا rho0 المعالجة ب BrdU أظهرت نفس المستوى المنخفض من التألق مثل الخلايا غير المعالجة BrdU ، في حين أن إشارة الخطوط الأبوية A549 و HeLa كانت ، في المتوسط ، أعلى بمقدار 50 ضعفا (الشكل 2C).
من أجل إظهار فائدة الطريقة المعروضة هنا في دراسة تخليق وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا ، أجريت تجربة عولجت فيها خلايا هيلا ب 2 ′ ، 3 ′-dideoxycytidine (ddC) ، وهو مثبط لتخليق mtDNA22 ، وتم إسكات التعبير عن الجينات المعروفة بأنها ضرورية لتكرار mtDNA باستخدام siRNA (الشكل 3). أدى علاج الخلايا مع ddC إلى تثبيط كامل لدمج BrdU ، في حين أن siRNAs المستخدمة كان لها تأثيرات متنوعة. أدى تخفيض تنظيم طائرة هليكوبتر توينكل (TWNK)23 إلى أقوى تثبيط لدمج BrdU. لوحظ تأثير أضعف لبروتين TFAM24 ، في حين أدى إسكات غاما بوليميراز الحمض النووي الميتوكوندريا (POLG)25 إلى انخفاض معتدل في دمج BrdU مقارنة بالخلايا المعالجة ب siRNA للتحكم السلبي (الشكل 3A ، B). يسمح استخدام الأجسام المضادة للحمض النووي في الإجراء بمراقبة توزيع mtDNA في الخلية في ظل الظروف التجريبية المحددة. أدى تخفيض تنظيم TFAM إلى تغييرات جذرية في توزيع mtDNA. تم اكتشاف عدد أقل من بقع mtDNA مقارنة بالخلايا الضابطة ، ولكن تلك التي بقيت كانت لها كثافة مضان عالية جدا (الشكل 3 أ). أظهر القياس الكمي لمتوسط إشارة التألق من الجسم المضاد للحمض النووي زيادة عدة أضعاف عند إسكات TFAM مقارنة بالحالات الأخرى التي تم اختبارها (الشكل 3C).
تم التحقق من خصوصية نتائج التصوير عن طريق قياس مستويات mtDNA والتعبير الجيني بمساعدة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) (الشكل 4). تم وصف الطريقة بالتفصيل في مكان آخر26. أدى العلاج مع ddC إلى انخفاض قوي جدا في مستويات mtDNA. لوحظ تأثير أضعف في حالة إسكات TFAM و TWNK ، في حين أن نقل الخلايا باستخدام POLG siRNA كان له تأثير متواضع للغاية على رقم نسخة mtDNA (الشكل 4 أ). أكد القياس الكمي لتعبير TFAM و TWNK انخفاضا فعالا في تعبيرهما إلى ~ 15٪ -20٪ من مستويات التحكم ، على عكس POLG ، الذي تم تخفيض تعبيره على مستوى mRNA إلى 30٪ (الشكل 4B).
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لخطوات البروتوكول. أشرطة المقياس للصور المجهرية هي 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الكشف المحدد عن دمج BrdU في mtDNA بواسطة الأجسام المضادة ل BrdU. صور عينة من (A) HeLa و (B) A549 و A549 rho0 الخلايا المعرضة للتلطيخ المناعي بأجسام مضادة ل BrdU (خضراء) ومضادة للحمض النووي (أحمر). تمت معالجة الخلايا أو لم يتم علاجها بمحلول BrdU. تم تمييز الحمض النووي (الأزرق) ب Hoechst ، وتم تصور الميتوكوندريا (السماوية) بصبغة تتبع الميتوكوندريا. يتم عرض صورة مدمجة لجميع القنوات الفلورية الأربعة. يمثل شريط المقياس 10 ميكرومتر. (ج) نتيجة القياس الكمي للإشارة من الأجسام المضادة المضادة ل BrdU. تم إجراء التحليل لأربعة نسخ بيولوجية مستقلة. في كل مرة ، تم تحليل 100 خلية مختارة عشوائيا لكل حالة تجريبية (N = 400 خلية). في المتوسط ، تم الكشف عن 18 بؤرة BrdU لكل خلية. تمثل المربعات الربعين الأول والثالث من النطاق الربيعي (IQR) ، ويتم تمثيل الوسيط بخط أفقي ، وتحدد الشعيرات الحد الأدنى والحد الأقصى ، ويتم تعريف القيم المتطرفة على أنها 1.5 × IQR. تم إجراء اختبار إحصائي كروسكال واليس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نتائج تثبيط تخليق mtDNA ، بما في ذلك تقليل كفاءة دمج BrdU والتأثير على توزيع النيوكليويدات. (أ) صور مضان عينة لخلايا هيلا المعالجة لمدة 72 ساعة باستخدام ddC أو siRNA ، والتي تقلل من تنظيم البروتينات المشاركة في تضاعف mtDNA . تمت معالجة الخلايا باستخدام BrdU لمدة 16 ساعة قبل التثبيت. تم تلطيخ الحمض النووي النووي (الأزرق) ب Hoechst ، وتم استخدام الأجسام المضادة المضادة ل BrdU (الأخضر) والمضادة للحمض النووي (الأحمر) ، وتم تمييز الميتوكوندريا بصبغة تتبع الميتوكوندريا. يتم عرض صورة مدمجة لجميع القنوات الفلورية الأربعة. يمثل شريط المقياس 10 ميكرومتر. (B ، C) القياس الكمي لإشارات التألق من (B) الأجسام المضادة ل BrdU و (C) الأجسام المضادة للحمض النووي. تم إجراء التحليل لأربعة نسخ بيولوجية مستقلة. في كل مرة ، تم تحليل 650 خلية مختارة عشوائيا لكل حالة تجريبية (N = 2600 خلية). في المتوسط ، تم الكشف عن 18 بؤرة BrdU و 46 بؤرة mtDNA لكل خلية. تمثل المربعات الربعين الأول والثالث من النطاق الربيعي (IQR) ، ويتم تمثيل الوسيط بخط أفقي ، وتحدد الشعيرات الحد الأدنى والحد الأقصى ، ويتم تعريف القيم المتطرفة على أنها 1.5 × IQR. تم إجراء اختبار إحصائي كروسكال واليس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحقق من كفاءة تثبيط تخليق mtDNA وفعالية siRNAs المختبرة. عولجت خلايا هيلا لمدة 72 ساعة باستخدام ddC أو siRNAs المشار إليها ثم تعرضت لعزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي. (أ) نتائج تحليل مستوى mtDNA باستخدام qPCR. (ب) تحليل qPCR لتغيرات التعبير الجيني في ظل الظروف المشار إليها. تمثل الأشرطة القيم المتوسطة لأربعة تكرارات بيولوجية مستقلة. تمثل أشرطة الخطأ SEM ؛ تم إجراء اختبار إحصائي ANOVA ؛ تم إجراء اختبار t للمقارنة الزوجية مع عينات Untr (غير المعالجة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: ديناميات دمج BrdU في mtDNA لخلايا HeLa. يتم عرض نتائج تجربة الدورة الزمنية التي تم فيها تحضين الخلايا ب 20 ميكرومتر BrdU لفترة معينة. يتم عرض وسائل أربعة مكررات مستقلة لكل نقطة زمنية ؛ تم تحليل 900 خلية مختارة عشوائيا في كل نسخة متماثلة. تمثل الأشرطة وسيلة لأربعة مكررات. تم إجراء اختبار إحصائي ANOVA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: التحقق من صحة خلايا A549 rho0. (أ) التحليل الكهربائي لمنتجات qPCR من تضخيم شظايا الحمض النووي لجينات ND1 المشفرة ب mtDNA وجينات B2M المشفرة بالحمض النووي النووي. تم استخدام إجمالي الحمض النووي من خلايا A549 أو A549 rho0 كقوالب في التفاعل. (ب) نتائج تحليل مستوى mtDNA باستخدام qPCR. تمثل الأشرطة القيم المتوسطة لأربعة تكرارات بيولوجية مستقلة. تمثل أشرطة الخطأ SEM ؛ تم إجراء اختبار T. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تاريخيا ، تم استخدام وضع علامات الحمض النووي عن طريق دمج BrdU والكشف عن الأجسام المضادة في تكرار الحمض النووي النووي وأبحاث دورة الخلية14،27،28. حتى الآن ، تضمنت جميع بروتوكولات الكشف عن الحمض النووي المسمى BrdU خطوة تمسخ الحمض النووي (حمضي أو حراري) أو هضم الإنزيم (DNase أو البروتيناز) لتمكين التعرض للحواتم وتسهيل اختراق الأجسام المضادة. تم تطوير هذه البروتوكولات للحمض النووي المعبأ بإحكام. ومع ذلك ، فإن التنظيم المختلف ل mtDNA مكن من تطوير إجراء دون خطوة التمسخ. وقد أدى ذلك إلى تبسيط الإجراء وجعله أكثر ملاءمة للتطبيقات عالية الإنتاجية. حقق هذا النهج نتائج ممتازة لأن حذف خطوة التمسخ يؤدي إلى اكتشاف الحمض النووي المسمى BrdU فقط خارج النواة (الشكل 2 والشكل 3). وبالتالي ، يمكن تجنب الإشارة القوية من الحمض النووي النووي ، والتي تكون موجودة دائما عند تضمين خطوة تمسخ والتي قد تسبب مشكلة خطيرة عن طريق إخفاء الإشارة من mtDNA29 المسمى BrdU ، باستخدام هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يضمن عدم وجود تمسخ قاسي الحفاظ بشكل أفضل على الهياكل الخلوية ولا يؤثر على كفاءة تلطيخ البقع الفلورية مثل صبغة تتبع Hoechst أو الميتوكوندريا (الشكل 2 والشكل 3).
تعتمد ديناميكيات دمج BrdU في mtDNA على خط الخلية. يوصى بإجراء تجربة دورة زمنية على دمج BrdU عند استخدام خط خلية جديد. حددت هذه الدراسة 16 ساعة كوقت حضانة BrdU الأمثل لخطوط خلايا HeLa. ومع ذلك ، نظرا للتنوع البيولوجي في خطوط HeLa من مختبرات مختلفة30 ، يقترح إجراء تجربة دورة زمنية BrdU على متغير HeLa المعين الذي يخطط المرء للعمل معه.
يسمح الجمع بين العلامات المضادة ل BrdU والمضادة للحمض النووي في هذا البروتوكول بمراقبة تخليق mtDNA والدراسة المتزامنة لتوزيع mtDNA في الخلية. يمكن ملاحظة ذلك جيدا في الخلايا الصامتة TFAM (الشكل 3). يؤدي خفض مستوى TFAM إلى انخفاض في تخليق mtDNA (انخفاض إجمالي إشارة مضادة ل BrdU) وإلى تجميع نيوكليويدات الميتوكوندريا ، والذي يتجلى في زيادة كبيرة في متوسط إشارة مضان mtDNA (الشكل 3). وتجدر الإشارة إلى أنه في هذه الحالة ، فإن الزيادة في متوسط شدة مضان mtDNA ناتجة عن التوزيع المتغير للنيوكليويدات الميتوكوندريا ولا تعكس تنظيم مستويات mtDNA ؛ في الواقع ، يتم تقليل مستويات mtDNA ، كما يتضح من تحليل PCR الكمي (الشكل 4A). تم الحصول على نتائج مفاجئة للخلايا المنقولة باستخدام POLG siRNA (الشكل 3). يمكن للمرء أن يتوقع أن نقل الخلايا مع POLG الذي يستهدف siRNA ، وهو بوليميراز الحمض النووي المتماثل في الميتوكوندريا ، من شأنه أن يقلل بشكل كبير من دمج BrdU في mtDNA. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، كان التأثير على دمج BrdU ضئيلا (الشكل 3) ، كما تم تأكيده بشكل أكبر من خلال قياس مستويات mtDNA باستخدام qPCR (الشكل 4A). يمكن أن يفسر سوء تنظيم تعبير POLG هذه النتيجة المتناقضة على ما يبدو عند نقل الخلايا باستخدام siRNA المطبق (الشكل 4B). هذا يسلط الضوء على عيب محتمل لاستخدام siRNA للدراسات الوظيفية ويشير إلى أن هناك حاجة للتحقق من صحة إسكات الجينات.
بشكل عام ، تم تطوير اختبار لدراسة ديناميكيات استقلاب mtDNA في الخلايا المستزرعة التي تستخدم شكل لوحة متعددة الآبار والتصوير المناعي للكشف عن وقياس تكرار mtDNA وإصلاحه وتوزيعه. تسمح هذه الطريقة بالدراسة المتزامنة للعديد من الظروف التجريبية المختلفة. يمكن استخدامه للتحقيق في آثار مثبطات مختلفة ، والضغوط الخلوية ، وإسكات الجينات على استقلاب mtDNA. في حين أن الفحص لديه إمكانات عالية للاستخدام في دراسة استقلاب mtDNA في سياقات فسيولوجية ومرضية مختلفة ، تجدر الإشارة إلى أن الفحص لا يسمح بتمييز تخليق mtDNA المرتبط بالإصلاح. يجب مراعاة ذلك عند تفسير النتائج والتخطيط للتجارب الوظيفية اللاحقة. والجدير بالذكر أن الفحص لديه المزيد من إمكانات التطوير. على سبيل المثال ، لا يتم اكتشاف نيوكليويدات الميتوكوندريا غير النشطة (أو غير النشطة للإصلاح) باستخدام الأجسام المضادة ل BrdU. لذلك ، فإن تطبيق الأجسام المضادة للحمض النووي يمكن من تحديد مستويات حالة mtDNA ، وعدد النيوكليويدات الصامتة للتكرار ، وتوزيع النيوكليويدات في الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا (رقم المنحة / الجائزة: 2018/31 / D / NZ2 / 03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
