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Methodenartikel

Ein periprothetisches Gelenk-Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus

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DOI:

10.3791/65263

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2. Februar 2024

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1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Periprothetische Gelenkinfektionen (PJI), die durch gefährliche Krankheitserreger verursacht werden, sind in der klinischen Orthopädie weit verbreitet. Bestehende Tiermodelle können die tatsächliche Situation von PJI nicht genau simulieren. Hier haben wir ein Candida albicans-Biofilm-assoziiertes PJI-Mausmodell etabliert, um neue Therapeutika für PJI zu erforschen und zu entwickeln.

Zusammenfassung

Die periprothetische Gelenkinfektion (PJI) ist eine der häufigsten Infektionen, die durch Candida albicans (C. albicans) verursacht wird und zunehmend Chirurgen und Wissenschaftler beunruhigt. In der Regel bilden sich an der Infektionsstelle Biofilme, die C. albicans vor Antibiotika und Immunclearance schützen können. Die Operation, die die Entfernung des infizierten Implantats, das Debridement, die antimikrobielle Behandlung und die Reimplantation umfasst, ist der Goldstandard für die Behandlung von PJI. Daher ist die Etablierung von tierischen PJI-Modellen von großer Bedeutung für die Erforschung und Entwicklung neuer Medikamente oder Therapeutika für PJI. In dieser Studie wurde ein glatter Draht aus einer Nickel-Titan-Legierung, ein in orthopädischen Kliniken weit verbreitetes Implantat, in das Femurgelenk einer C57BL/6-Maus eingeführt, bevor die C. albicans in die Gelenkhöhle entlang des Drahtes inokuliert wurden. Nach 14 Tagen wurden reife und dicke Biofilme auf der Oberfläche von Implantaten unter dem Rasterelektronik-Mikroskop (REM) beobachtet. Eine signifikant reduzierte Knochentrabekel wurde in der H&E-Färbung der infizierten Gelenkproben gefunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Maus-PJI-Modell mit den Vorteilen einer einfachen Bedienung, einer hohen Erfolgsrate, einer hohen Wiederholbarkeit und einer hohen klinischen Korrelation etabliert wurde. Es wird erwartet, dass dies ein wichtiges Modell für klinische Studien zur Biofilm-bedingten PJI-Prävention von C. albicans sein wird.

Einleitung

Candida albicans (C. albicans) kommt kommensal in vielen Teilen des menschlichen Körpers vor1 und ist auch der häufigste opportunistische Erreger, der lebensbedrohliche invasive Pilzinfektionen verursacht, insbesondere bei immungeschwächten Patienten 2,3. C. albicans kann sich als polymorpher Pilz zwischen Hefe- und Myzelzuständen wandeln. Der Myzelzustand weist eine höhere Virulenz, stärkere Adhäsion und Invasion von Zellen und Geweben auf 4,5. Außerdem können C. albicans Biofilme auf den Oberflächen von biomedizinischen Materialien wie Zahnersatz, Katheter und Stents bilden 1,6,7. Die dichte dreidimensionale Struktur von Biofilmen schränkt die Infiltration von Antimykotika ein, exprimiert arzneimittelresistente Gene und reguliert den Stoffwechsel von Pilzzellen herunter, um der Clearance des Immunsystems zu widerstehen 6,7. Daher sind Biofilm-bedingte Infektionen in Kliniken eine große Herausforderung8.

Staphylococcus aureus, Koagulase-negative Staphylokokken und Enterobacter sind die Haupterreger von PJI9. Obwohl die Inzidenz von Pilz-PJI relativ gering ist (ca. 1 %)10, sind die Behandlungskosten von Pilz-PJI höher11, der Behandlungszyklus ist länger11 und die Behandlungserfolgsrate ist niedriger10 als bei bakterieller PJI. In den letzten Jahren hat die Inzidenz von Pilz-PJI von Jahr zu Jahr zugenommen10. Candida PJI macht 77%-84% der pilzlichen PJIaus 10,12, und C. albicans ist der häufigste in Candida (54%). Daher muss die PJI von Pilzen untersucht werden.

Derzeit wird PJI durch eine Revisionsoperation behandelt, indem (1) das infizierte Implantat entfernt wird, (2) ein Debridement, (3) eine antimikrobielle Behandlung und (4) eine Reimplantation durchgeführt wird. Nach einem gründlichen Debridement wird ein Antibiotikum mit Knochenzement eingesetzt, und der Patient wird mehr als 6 Wochen lang systemisch mit Antibiotika behandelt, um die Infektion effektiv zu kontrollieren, bevor ein neues Implantat eingesetzt wird13. Diese Methode kann jedoch Krankheitserreger im Gewebe nicht vollständig eliminieren, und rezidivierende Infektionen, die mit einer antimikrobiellen Langzeittherapie behandelt werden, entwickeln sich mit hoher Wahrscheinlichkeit bei arzneimittelresistenten Stämmen 14,15,16.

Die Etablierung von Tiermodellen für PJI ist wichtig für die Erforschung und Entwicklung neuer Medikamente oder Therapeutika für PJI. Bei der Entwicklung von PJI bilden sich große Tote um die Prothese herum, was zur Bildung von Hämatomen führt, die die Blutversorgung des umliegenden Gewebes weiter blockieren und die Wirkung von Antibiotika beeinträchtigen11,15. Aufgrund der Schwierigkeit, die Umgebung der Prothese nachzuahmen, können herkömmliche Tiermodelle die tatsächliche Situation von PJI17,18 nicht genau simulieren.

In dieser Arbeit wurde ein C. albicans-Biofilm-assoziiertes PJI-Modell in Mäusen konstruiert, indem ein klinisch weit verbreiteter Titan-Nickel-Draht verwendet wurde, um Gelenkimplantate zu simulieren19,20. Dieses PJI-Modell weist die Vorteile einer einfachen Bedienung, einer hohen Erfolgsrate, einer hohen Wiederholbarkeit und einer hohen klinischen Korrelation auf. Es wird erwartet, dass es ein wichtiges Modell für die Untersuchung der Prävention und Behandlung von C. albicans-Biofilm-assoziierten PJI sein wird.

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Protokoll

Die Tiere wurden von der Xi'an Jiaotong Universität gekauft. Alle Tierversuchsverfahren wurden vom Institutional Animal Ethics Committee der Xi'an Jiaotong University genehmigt (Zulassungsnummer: SCXK [Shaanxi] 2021-103). Die Mäuse wurden eine Woche lang mit 5 Mäusen pro Käfig gehalten. Sie erhielten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden vor der Durchführung der Studie bei Raumtemperatur (RT; 24 °C ± 1 °C) und Hell-Dunkel-Zyklus (12 h/12 h) gehalten.

1. Vorbereitung des Puffers und der Ausrüstung

  1. C. albicans Zellkultur
    1. Eine monoklonale Kolonie von C. albicans (SC5314) aus einem Hefeextrakt-Peptondextrose (YPD)-Plattenmedium mit einer Impfschleife in 5 ml YPD-Flüssigmedium (YPD + 50 μg/ml Carbenicillin) inokuliert.
    2. C. albicans-Zellen anschließend bei einer Drehzahl von 220 U/min bei 30 °C über Nacht schütteln.
    3. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 400 x g für 5 Minuten bei RT. Resuspendieren Sie die C. albicans-Zellen in normaler Kochsalzlösung und verdünnen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 106 Zellen/ml, indem Sie die Trübung visuell so einstellen, dass sie der 0,5 McFarland entspricht.
  2. Zubereitung von normaler Kochsalzlösung
    1. Wiegen Sie 0,9 g Natriumchlorid und lösen Sie es in 100 ml deionisiertem Wasser auf, um 0,9 % normale Kochsalzlösung herzustellen.
  3. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten
    1. Autoklavieren (121 °C, 30 min) der chirurgischen Instrumente (Schere, Pinzette, hämostatische Pinzette, Nadelhalter, Nahtnadeln) und Draht aus Titan-Nickel-Legierung (ca. 0,5 mm Durchmesser) vor Gebrauch.

2. Etablierung des Maus-PJI-Modells

  1. 30 C57BL/6-Mäuse (männlich, 15-20 g) werden nach dem Zufallsprinzip in 3 Gruppen (10 Mäuse/Gruppe) unterteilt, nämlich in die Kontrollgruppe, die Blindimplantatgruppe (Titan-Nickel-Draht-Implantation ohne C. albicans-Infektion ) und die PJI-Gruppe (Titan-Nickel-Draht-Implantation mit C. albicans-Infektion ).
  2. Betäuben Sie die Mäuse mit 1-4% Isofluran-Inhalation, bevor Sie die Haare an der linken Hintergliedmaße entfernen und mit Jod desinfizieren. Der Verlust des Aufrichtungsreflexes und das Ausbleiben einer Reaktion auf die Zehenstimulation bestätigt die Tiefe der Anästhesie. Tragen Sie während der Anästhesie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit der Hornhaut zu verhindern und die Wärme während der Operation und Genesung wieder aufzufüllen.
  3. Bei den Mäusen in der Kontrollgruppe ist keine Behandlung durchzuführen. Gewähren Sie ihnen freien Zugang zu Wasser und Nahrung.
  4. Bei den Mäusen in der Blank-Implantat-Gruppe und der PJI-Gruppe wird ein 5 mm langer Längsschnitt am Knie jeder linken Hintergliedmaße mit einer #10-Klinge oder einem sterilen Rasierer gemacht, um die Gelenke freizulegen.
  5. Ein 5 mm langes Loch in den Oberschenkelmarkkanal bohren, indem eine sterile Spritzennadel (26 G) eingeführt wird.
  6. Führen Sie einen glatten Draht aus einer Nickel-Titan-Legierung (0,5 mm Durchmesser, 5 mm Länge) in das Loch ein, bevor Sie ihn mit einer Schere schneiden (Abbildung 1).
  7. Bei den Mäusen in der Blindimplantatgruppe werden 2 μl YPD-Medium tropfenweise entlang des Drahtes aus Nickel-Titan-Legierung zugegeben, bevor die Wunde Schicht für Schicht mit einem Nylonnaht (0,15 mm Durchmesser) verschlossen wird.
  8. Bei den Mäusen in der PJI-Gruppe werden 2 μl C. albicans-Zellen (1 × 106 Zellen/ml) tropfenweise in den Gelenkspalt der Mäuse entlang des Drahtes aus Nickel-Titan-Legierung geimpft, bevor die Wunde Schicht für Schicht mit einer Nylonnaht verschlossen wird.
  9. Unterbringe die Mäuse 14 Tage lang mit freiem Zugang zu Wasser und Futter. Meloxicam als subkutane Injektion (4 mg/kg) alle 24 h für bis zu 3 Tage verabreichen.
  10. Nach 14 Tagen werden die Mäuse mit 3% Isofluran betäubt, bevor die Mäuse durch Zervixluxation eingeschläfert werden.

3. Bewertung des PJI-Modells

  1. Abklärung von Infektionen in wichtigen Organen
    1. Sammle die Nieren, die Leber und die Milz von den Mäusen nach dem Einschläfern.
    2. Geben Sie 500 μl sterile normale Kochsalzlösung in jedes Organ und mahlen Sie das Gewebe auf einem Homogenisator bei 4 °C.
    3. 100 μl des in Schritt 3.1.2 hergestellten Homogenats auf eine YPD-Platte geben, bevor es mit einem gebogenen Stab gleichmäßig verteilt wird.
    4. Die YPD-Platten werden für 48 h invertiert in einen 37 °C warmen Inkubator gelegt.
    5. Beobachte und zähle die Anzahl der Völker visuell.
  2. Beobachtung von C. albicans und Biofilmen auf den Implantaten
    1. Schneiden Sie die Haut über dem Gelenk der Mäuse vorsichtig mit einer Schere ab, bevor Sie das Implantat mit einer Pinzette auffangen.
    2. Halten Sie die Implantate 48 Stunden lang in einer 2,5%igen Glutaraldehyd-Lösung zur Fixierung bei 4 °C.
    3. Spülen Sie die Implantate dreimal mit sterilem PBS, bevor Sie sie 3 Stunden lang in 1%ige Osmiumsäurelösung tauchen.
    4. Spülen Sie die Implantate dreimal mit sterilem PBS, bevor Sie sie zur Dehydrierung 15 Minuten lang in 50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanollösungen eintauchen.
    5. Lassen Sie die Implantate dreimal 30 Minuten lang in tert-Butanol eintauchen, bevor Sie die Implantate gefriertrocknen.
    6. Befestigen Sie die Implantatproben auf dem Probentisch, beschichten Sie das Implantat mit Gold (10-nm-Beschichtung) und beobachten Sie es unter einem Rasterelektronikmikroskop (REM) im Hochvakuum und bei 1,5 kV.
  3. Pathologische Analyse des Oberschenkelgewebes
    1. Sammle das Oberschenkelgewebe mit einer Schere, nachdem du die Mäuse eingeschläfert hast.
    2. Das Oberschenkelgewebe wird 48 h lang bei 4 °C in 4%ige Paraformaldehydlösung zur Fixierung getaucht.
    3. Legen Sie das Oberschenkelgewebe 1 Woche lang in 10% Formalin.
    4. Dehydrieren Sie das Femurgewebe, indem Sie es 15 Minuten lang in 50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanollösungen eintauchen.
    5. Betten Sie das dehydrierte Femurgewebe in Paraffin ein, bevor Sie das Gewebe mit einem Mikrotom in 4-μm-Proben schneiden.
    6. Färben Sie die Oberschenkelabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin, indem Sie vor der pathologischen Analyse ein Standardprotokoll befolgen21.

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Ergebnisse

Die Übertragung der Proben auf ein Plattenmedium und die Zählung der Kolonien nach der Inkubation über Nacht wird üblicherweise verwendet, um die lokale Erregerlast in der Nähe der Läsion zu beurteilen22,23. In unserer Studie war die mikrobielle Kultur von Leber-, Nieren- und Milzproben negativ, was darauf hindeutet, dass das Modell in dieser Studie bei den Mäusen nur zu einer lokalen Infektion statt zu einer systemischen Infektion führte23

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Diskussion

Die Infektion, die durch die Kontamination von chirurgischen Instrumenten oder der chirurgischen Umgebung während der Operation verursacht wird, ist die Hauptursache für die meisten Implantatinfektionen 24,25,26,27. Daher wurde in dieser Arbeit ein Maus-C. albicans-Biofilm-bezogenes PJI-Modell konstruiert. Im Vergleich zum traditionellen PJI-Modell, bei dem sterile, in Kochsalzlösung s...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die den Anschein erwecken könnten, dass sie die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben.

Danksagungen

Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch die Natural Science Foundation of Shaanxi Province (Fördernummer 2021SF-118) und die National Natural Science Foundation of China (Fördernummern 81973409, 82204631).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0.5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 ° C KühlschrankElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
AnalysenwaagenShimadzuATX124
Autoklaven SterilisatorSANYOMLS-3750
CarbenicillinAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon aufrechtes optisches Mikroskop NikonEclipse Ts2-FL
GlukoseMacklin 
ImpfringThermo Scientific251586
IsofluranRWD20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
ParaformaldehydBeyotime BiotechnologyP0099
PeptonBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
RWD R550 Mehrkanal-Anästhesiegerät für Kleintiere RWDR550
SEMHitachiTM-1000
TemperaturinkubatorShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
ReinstwassergeneratorHeal ForceNW20VF
UltraschallgerätDo-ChromDS10260D
HefeextraktThermo Scientific Oxoid-LP0021B
D823520

Referenzen

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