Methodenartikel

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

8.9K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/65272

⸱

18. August 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Zusammenfassung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Zusammenfassung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden von Neutrophilen als Reaktion auf bakterielle Infektionen oder traumatische Gewebeschäden freigesetzt, spielen aber auch eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen und sterilen Entzündungen. Es handelt sich um netzartige Strukturen, die aus doppelsträngigen DNA-Filamenten, Histone und antimikrobiellen Proteinen bestehen. Einmal freigesetzt, können NETs extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten. Darüber hinaus sind NETs an der homöostatischen Regulation beteiligt, indem sie die Adhäsion und Koagulation von Blutplättchen stimulieren. Die dysregulierte Produktion von NETs wurde jedoch auch mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Sepsis oder Autoimmunerkrankungen, was sie zu einem vielversprechenden Ziel für therapeutische Interventionen macht. Neben der Elektronenmikroskopie ist die Visualisierung von NETs mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung derzeit eine der wenigen bekannten Methoden, um NET-Wechselwirkungen im Gewebe nachzuweisen. Daher wurden verschiedene Färbemethoden zur Visualisierung von NETs eingesetzt. In der Literatur werden verschiedene Färbeprotokolle beschrieben, und wir haben vier Schlüsselkomponenten identifiziert, die eine hohe Variabilität zwischen den Protokollen aufweisen: (1) die Art der verwendeten Antikörper, (2) die Verwendung von Autofluoreszenz-reduzierenden Mitteln, (3) Antigen-Retrieval-Methoden und (4) Permeabilisierung. Daher wurden in dieser Arbeit in vitro Immunfluoreszenz-Färbeprotokolle systemisch angepasst und verbessert, um sie für verschiedene Spezies (Maus, Mensch) und Gewebe (Haut, Darm, Lunge, Leber, Herz, Bandscheibe) anwendbar zu machen. Nach der Fixierung und Paraffineinbettung wurden 3 μm dicke Schnitte auf Objektträger montiert. Diese Proben wurden mit primären Antikörpern gegen Myeloperoxidase (MPO), citrulliniertes Histon H3 (H3cit) und neutrophile Elastase (NE) nach einem modifizierten Färbeprotokoll gefärbt. Die Objektträger wurden mit Sekundärantikörpern gefärbt und mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Ergebnisse wurden anhand eines Bewertungsbogens analysiert und Unterschiede semi-quantitativ erfasst.

Hier stellen wir ein optimiertes NET-Färbeprotokoll vor, das für verschiedene Gewebe geeignet ist. Wir verwendeten einen neuartigen Primärantikörper zur Färbung von H3cit und reduzierten die unspezifische Färbung mit einem Autofluoreszenz-reduzierenden Mittel. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NET-Färbung eine konstant hohe Temperatur und einen sorgfältigen Umgang mit den Proben erfordert.

Einleitung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) wurden erstmals 2004 von Brinkmann et al. als ein Weg des Zelltods visualisiert, der sich von Apoptose und Nekrose unterscheidet1. Auf diesem Weg geben Neutrophile ihr dekondensiertes Chromatin in den extrazellulären Raum ab, um große netzartige Strukturen zu bilden, die mit antimikrobiellen Proteinen bedeckt sind, die zuvor in den Granula oder dem Zytosol gespeichert waren. Zu diesen antimikrobiellen Proteinen gehören neutrophile Elastase (NE), Myeloperoxidase (MPO) und citrulliniertes Histon H3 (H3cit), die üblicherweise für den indirekten Immunfluoreszenznachweis von NETsverwendet werden 2. Diese Methode identifiziert nicht nur das quantitative Vorhandensein dieser Proteine; in der Tat hat es den Vorteil, NET-ähnliche Strukturen spezifisch zu detektieren. In den NETs kolokalisieren die genannten Proteine mit extrazellulärer DNA, was durch eine Überlappung der Fluoreszenzsignale jedes gefärbten Proteins und der extrazellulären DNA nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz zu den überlappenden Signalen, die auf die Kolokalisation von extrazellulärer DNA und Proteinen in NETs zurückzuführen sind, zeigen intakte Neutrophile keine Kolokalisation. Hier werden die NET-Komponenten in der Regel getrennt in den Granula, Zellkernen und Zytosol3 gelagert.

Seit ihrer ersten Entdeckung hat sich gezeigt, dass NETs bei zahlreichen Krankheiten, insbesondere bei Entzündungen, eine zentrale Rolle spielen. NETs zeigen antimikrobielle Funktionen während der Infektion, indem sie extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten 4,5. NETs wurden jedoch auch mit Autoimmunerkrankungen und hyperinflammatorischen Reaktionen wie systemischem Lupus erythematodes, rheumatischer Arthritis und allergischem Asthma in Verbindung gebracht 6,7,8. NETs fördern Vaso-Verschluss und Entzündung bei Atherosklerose, Thrombozytenadhäsion und es wird spekuliert, dass sie eine Rolle bei metastasierendem Krebs spielen 9,10,11. Dennoch wird angenommen, dass sie entzündungshemmende Eigenschaften haben, indem sie den proinflammatorischen Zytokinspiegel senken12. Während NETs in einem breiteren Forschungsfeld immer mehr an Interesse gewinnen, ist eine robuste NET-Detektionsmethode für die zukünftige Forschung von grundlegender Bedeutung.

Auch wenn die Visualisierung von NETs in verschiedenen Geweben mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung komplex ist und angepasst werden muss, ist sie neben der Elektronenmikroskopie derzeit eine der renommiertesten Methoden zur Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen NETs und Zellen und wird überwiegend in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben (FFPE) eingesetzt13,14. Der Vergleich der NET-Bildgebung ist jedoch schwierig, da verschiedene Labore ihre eigenen maßgeschneiderten Protokolle verwenden. Diese Protokolle unterscheiden sich in der Verwendung von Antikörpern, der Antigengewinnung oder der Permeabilisierungsmethode und sind oft für einen bestimmten Gewebetyp optimiert 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Nachdem Brinkmann et al. die erste methodische Studie mit immunfluoreszierender Visualisierung von NETs in FFPE-Gewebe veröffentlicht hatten, wollten wir dieses Protokoll für eine größere Vielfalt von Geweben und Spezies optimieren15. Um ein breit anwendbares Immunfluoreszenzprotokoll zu etablieren, testeten wir verschiedene modifizierte Protokolle aus Studien, die Immunfluoreszenzmethoden in FFPE-Gewebe zum Nachweis von NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 verwendeten. 26,27. Darüber hinaus haben wir einen neuen H3cit-Antikörper für eine spezifischere extrazelluläre Färbung ausprobiert28. Wir stellen die Hypothese auf, dass durch die systematische Anpassung aktueller Färbeprotokolle an verschiedene Spezies und Gewebe die In-vitro-Bildgebung verbessert werden kann, was zu einer besseren Darstellung der Interaktion zwischen Neutrophilen und NETs sowohl lokal als auch systemisch führt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Diese Studie umfasste Mausgewebe aus Experimenten, die von der Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, genehmigt wurden (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Bei den verwendeten Geweben handelte es sich um Maus, Lunge und Dickdarm aus einem septischen Modell und verbrannte Haut. Wir haben 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse verwendet. Bei allen Versuchen wurde die europäische Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere befolgt. Die anonymisierten menschlichen Proben umfassten Gewebe von neonataler Enterokolitis, verbrannter Haut, Gallengangsatresie, Spondylodiszitis und Myokard. Nach Angaben der Ethikkommission für medizinische Forschung Hamburg bedurften die Proben keiner Einverständniserklärung, die Studie wurde jedoch von der Kommission genehmigt (WF-026/21).

1. Proben-Fixierung

  1. Verwenden Sie das folgende Protokoll, das von Abu Abed und Brinkmann abgeleitet wurde, für die Probenfixierung, Dehydratisierung, Paraffineinbettung, Schnitte und Einbettung 3,15.
    1. Bereiten Sie eine 4%ige Formaldehydlösung vor, indem Sie 40 g Paraformaldehyd (PFA) in 800 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (TBS) auflösen.
    2. Die Mischung bei 60 °C unter einem Abzug rühren, bis sich das PFA aufgelöst hat. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur (RT) und stellen Sie das Volumen mit TBS auf 1.000 ml ein.
    3. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. 2-3 Wochen bei 4 °C oder bis zu 1 Jahr bei −20 °C lagern.
  2. Zur Fixierung der Probe wird frisches Gewebe in TBS-Puffer gelegt und in Stücke zerlegt, die kleiner als 20 mm x 30 mm x 3 mm sind. Tauchen Sie die Gewebeschnitte für 12-24 h in 4%ige Paraformaldehydlösung.
    HINWEIS: Das ursprüngliche Protokoll verwendete eine 2%ige PFA-Lösung und eine Fixierungszeit von 8-20 Stunden. Mit dieser Methode waren einige Gewebeschnitte nach 20 h nicht vollständig fixiert, so dass die PFA-Konzentration auf 4% PFA erhöht wurde.
  3. Überführen Sie die Proben in beschriftete Tissue-Processing-Kassetten. Verwenden Sie lösungsmittelbeständige Marker oder Bleistifte für die Beschriftung.
  4. Beginnen Sie mit der Dehydrierung der Probe, indem Sie die Kassetten 1 h lang in 70%iges Ethanol tauchen. Dann in 80 % Ethanol, 90 % Ethanol, 96 % Ethanol und zweimal in 100 % Ethanol eintauchen, wobei jeder Schritt 1 Stunde dauert.
  5. Zweimal in 100%iges Xylol (Dimethylbenzol) und dann zweimal für jeweils 1 h in 60 °C Paraffin eintauchen.
  6. Verwenden Sie Einbettformen für die Montage und lassen Sie das Paraffin erstarren, bevor Sie die Form entfernen.
  7. Verwenden Sie ein Mikrotom zum Schneiden von 3 μm dicken Gewebeschnitten.
  8. Legen Sie die geschnittenen Abschnitte mit einer Pinzette in ein 37 °C warmes Wasserbad und lassen Sie sie auf der Oberfläche schwimmen, um die Gewebeschnitte zu dehnen.
  9. Legen Sie die Abschnitte auf selbstklebende Objektträger (Materialtabelle) und lassen Sie sie über Nacht in einer 40 °C heißen Wärmekammer trocknen.

2. Rehydrierung der Probe

  1. Zur Entparaffinierung werden die Objektträger in einem Objektträgergestell gestapelt und zweimal für jeweils 5 Minuten in das Xylol-Ersatzmedium Limonen (Materialtabelle) und einmal für 5 Minuten in ein 1:1-Limonen/Ethanol-Gemisch getaucht.
    ACHTUNG: Limonen ist bei 50 °C brennbar und kann allergische Reaktionen hervorrufen. Unter einem Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden. Von offenem Feuer fernhalten.
  2. Rehydrieren Sie die Proben in einer absteigenden Ethanolreihe, indem Sie das Objektträgergestell zweimal in 100 % Ethanol und einmal in 96 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol und 70 % Ethanol für jeweils 5 Minuten eintauchen.
  3. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in deionisiertes Wasser (DI-Wasser), um das restliche Ethanol zu entfernen.

3. Autofluoreszenz-Blockierung und Antigen-Rückgewinnung

  1. pH 6 Citrat Target Retrieval Solution (TRS) (Table of Materials) gemäß dem Datenblatt vorbereiten. Dieses TRS ist 10-fach konzentriert. Daher 1:10 mit DI-Wasser verdünnen. In einem Färbeglas aus Kunststoff auf 96 °C vorheizen.
    HINWEIS: TRS bricht die Methylenbrücken, die während der Probenfixierung gebildet werden, um die Antigenepitope freizulegen. Dadurch können die Primärantikörper an ihr Zielantigen binden. Konzentriertes TRS 8 Monate lang bei 2-8 °C lagern. Bereiten Sie immer frisches TRS zu.
  2. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Objektträgergestell und legen Sie sie in eine feuchte Kammer. Pipettieren Sie ein bis zwei Tropfen Autofluoreszenzreduktionsmittel (Materialtabelle) auf jede Probe. 5 Minuten inkubieren.
    HINWEIS: Das Autofluoreszenzreduktionsmittel blockiert die inhärente Autofluoreszenz des Gewebes, die durch endogene Fluorophore und Fixiermittel verursacht wird. Lagern Sie das Autofluoreszenz-Reduktionsmittel bis zu 1 Jahr bei RT.
    HINWEIS: Arbeiten Sie nur mit kleinen Gewebeabschnitten, um ein Austrocknen der Proben oder eine Überschreitung der Inkubationszeit zu vermeiden.
  3. Stapeln Sie die Objektträger wieder in das Objektträgergestell und spülen Sie sie 1 Minute lang in 60%igem Ethanol mit einer Aufwärts- und Abwärtsbewegung, bis das gesamte unbenutzte Autofluoreszenz-reduzierende Reagenz abgewaschen ist.
  4. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in DI-Wasser.
  5. Für die Antigengewinnung werden die Objektträger mit dem vorgewärmten TRS in ein Färbegefäß gegeben. 10 min bei 96 °C im Wasserbad inkubieren.
    HINWEIS: Das 96 °C warme Wasserbad kann durch eine Mikrowelle oder einen Dampfgarer ersetzt werden, wenn der TRS auf 96 °C vorgeheizt ist und eine Inkubationszeit von 10 Minuten bei 96 °C gewährleistet ist.
  6. Nehmen Sie das Färbeglas heraus und lassen Sie es ca. 60-90 Minuten lang langsam auf RT abkühlen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier für bis zu 4 Stunden pausiert werden, wobei die Folien im TRS verbleiben.
  7. Entferne die TRS, aber bewahre die Objektträger im Glas auf. Zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween (TBST, pH 7,4) jeweils 3 Minuten lang spülen, um alle übrig gebliebenen TRS-Rückstände abzuwaschen.
  8. Für die Permeabilisierung wird 0,2 % Triton in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 hergestellt und in das Färbegefäß gefüllt, um die Proben 10 Minuten lang zu permeabilisieren.
    HINWEIS: Die Permeabilisierung verbessert die Bindung der primären Antikörper an die intrazellulären Zielproteine in den fixierten Proben.
  9. Spülen Sie die Objektträger erneut zweimal in TBST für jeweils 3 min.
  10. Bereiten Sie die Nasskammer vor und legen Sie die Objektträger aus. Wischen Sie überschüssiges Wasser mit Papiertaschentüchern von den Objektträgern ab. Umkreisen Sie jede Probe mit einem hydrophoben Barrierestift, um zu verhindern, dass die Antikörperlösung abläuft.
    HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht austrocknen. Am besten ist es, mit kleinen Abschnitten zu arbeiten.

4. Blockierung der unspezifischen Antikörperbindung

  1. Nehmen Sie gebrauchsfertige Blockierungslösung mit Eselsserum (Materialtabelle) und pipettieren Sie einen Tropfen auf jede Probe. 30 Minuten bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Dieser Blockierungsschritt minimiert die Bindung des sekundären Antikörpers an unspezifische Bindungsstellen auf der Probe. Nach der Blockierung dieser unspezifischen Epitope und dem Auftragen des Primärantikörpers bindet der Sekundärantikörper an den Primärantikörper und interagiert nicht mit der Oberfläche des Gewebes. Dieses gebrauchsfertige Blockierungsreagenz wird 6 Monate lang bei 2-8 °C gelagert.
  2. Entfernen Sie überschüssige Blockierungslösung von Objektträgern, indem Sie die Kante der Objektträger gegen eine harte Oberfläche klopfen. Spülen Sie sie nicht aus.

5. Primärer Antikörper

  1. Primärantikörper im Antikörperverdünnungspuffer verdünnen (Materialtabelle). Verwenden Sie für jede Probe ca. 100 μl der endgültigen Lösung. Für den NE- und H3cit-Antikörper (R8) und die Isokontrolle auf eine Konzentration von 5 μg/ml verdünnen. Für MPO und die entsprechende Isokontrolle verwenden Sie 10 μg/ml. Bereiten Sie ein Röhrchen für jeden Primärantikörper und eines für jeden Isocontrol-Antikörper vor.
    HINWEIS: H3cit (R8)/MPO oder NE/MPO und ihre Isokontrollen können für die NET-Färbung kombiniert werden. Für die Kombination von H3cit (R8)/MPO wird auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für H3cit (R8) und 10 μg/ml für MPO auf ein Endvolumen von 100 μl pro Probe verdünnt. Bei NE/MPO auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für NE und 10 μg/ml für MPO auf ein Endvolumen von 100 μl pro Probe verdünnen. Verwenden Sie für die Isokontrolle die gleiche Konzentration wie für jeden entsprechenden Antikörper. Verwenden Sie für jeden verwendeten Antikörper immer eine neue Pipettenspitze. Primärantikörper können bei 4 °C für 1-2 Wochen und bei −20 °C oder −80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  2. Verwenden Sie mit zwei Proben auf einem Objektträger eine für die Isocontrol-Antikörper und eine für die MPO/H3cit- oder MPO/NE-Antikörperverdünnung. Verwenden Sie ca. 100 μl für jede Probe und verteilen Sie die Antikörperlösung gleichmäßig.
    HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht austrocknen. Achten Sie darauf, dass Sie die Isokontroll- und Primärantikörper nicht verwechseln.
  3. Über Nacht in einer Feuchtkammer bei 4 °C lagern.
  4. Klopfen Sie am nächsten Tag die überschüssige Primärantikörperlösung von den Objektträgern ab und stapeln Sie die Objektträger in einer Küvette. Dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBST spülen, um die verbleibende Primärantikörperlösung abzuwaschen.

6. Sekundärer Antikörper

  1. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung vor. Verwenden Sie zwei verschiedene fluoreszierende Sekundärantikörper: Esel-Anti-Ziege für MPO und Esel-Anti-Kaninchen für die H3cit-Färbung. Verdünnen Sie sie jeweils auf eine Konzentration von 7,5 μg/ml mit Antikörper-Verdünnungspuffer (Materialtabelle).
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Doppelfärbung zwei fluoreszierende Antikörper mit unterschiedlichen Anregungsbereichen und minimaler spektraler Überlappung. Kombinieren Sie beide Sekundärantikörper und verdünnen Sie sie auf eine Endkonzentration von 7,5 μg/ml für jeden Antikörper, um ein Endvolumen von 100 μl pro Probe zu erhalten. Schützen Sie die Antikörper vor Licht. Die Sekundärantikörper können bei 2-8 °C für 6-8 Wochen oder bei -80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  2. Bewahren Sie die Objektträger in der Nasskammer auf und geben Sie 100 μl der Sekundärantikörperlösung auf jede Probe. Lassen Sie sie 30 Minuten bei RT und lichtgeschützt inkubieren.
  3. Klopfen Sie die überschüssige Sekundärantikörperlösung ab und stapeln Sie die Objektträger im Objektträgergestell. Dreimal für jeweils 5 Minuten in ein mit PBS gefülltes Färbegefäß eintauchen, um alle verbleibenden ungebundenen Antikörper abzuwaschen.
  4. Bereiten Sie die DAPI-Lösung (4',6-Diamidino-2-phenylindol) (Materialtabelle) vor und verdünnen Sie sie mit DI-Wasser auf eine Konzentration von 1 μg/ml. Tauchen Sie das Objektträgergestell in ein Färbegefäß mit DAPI-Lösung und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
    HINWEIS: DAPI wird als Fluoreszenzfärbung für doppelsträngige DNA verwendet. Die vorbereitete DAPI-Lösung kann mehrfach verwendet werden. Bewahren Sie die vorbereitete DAPI-Lösung bei RT auf. Das DAPI-Konzentrat kann bei −20 °C bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  5. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in ein Färbegefäß mit PBS, um die überschüssige DAPI-Lösung abzuwaschen.

7. Montieren und Lagern der Proben, mikroskopische Analyse

  1. Montieren Sie die Proben mit Deckgläsern und Eindeckmedium (Materialtabelle).
    HINWEIS: Verwenden Sie nur kleine Mengen des Eindeckmediums und wischen Sie das überschüssige Medium mit feuchten Taschentüchern ab. Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie es, versehentlich Medien von den Deckgläsern oder Objektträgern abzuwischen. Vermeiden Sie Blasenbildung und drücken Sie mit Wattestäbchen vorsichtig auf die Deckgläser, um Blasen von den Objektträgern zu entfernen.
  2. Verwenden Sie für die Bildgebung ein Weitfeldmikroskop oder ein konfokales Mikroskop.
    HINWEIS: Machen Sie zuerst ein Bild von der Isokontrolle. Verringern Sie die Belichtungszeit für die Fluoreszenzfilter (mit Ausnahme des Blaufilters für DAPI), bis fast kein Signal mehr detektiert werden kann. Verwenden Sie dann diese Einstellung, um die entsprechenden Beispiele zu untersuchen. Suchen Sie nach Bereichen, in denen mit Hilfe des Fluoreszenzkanals ein Fluoreszenzsignal in jeder einzelnen Probe detektiert werden kann. Nach der Aufnahme eines Bildes des Bereichs erzeugt das Programm ein zusammengesetztes Bild aller Kanäle und zeigt die verschiedenen Fluoreszenzsignale als Überlappung verschiedener Farben an. Das Bild kann dann für die Co-Lokalisierung mit Bildgebungssoftware wie ImageJ weiter analysiert werden.
  3. Lagern Sie die Objektträger bis zu 6 Monate bei 4 °C.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Bevor wir mit unserer Protokolloptimierung begannen, identifizierten wir die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Färbung, indem wir in PubMed nach Studien suchten, die FFPE-Gewebe für die Immunfärbung von NETs verwendeten, und ihre Protokolle verglichen. Die erfolgversprechendsten Protokollunterschiede wurden als Schlüsselschritte für die Protokolloptimierung identifiziert, während Schritte, die größtenteils miteinander korrespondierten, nicht verändert wurden (Tabelle 1).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

In dieser Arbeit zielten wir darauf ab, die bestehenden Protokolle für die Bildgebung von NETs an weitere Gewebetypen anzupassen und zu optimieren, beginnend mit dem eigentlichen Färbeprozess. Der erste kritische Schritt für diese Methode ist die Auswahl der am besten geeigneten Antikörper. Für NE haben wir einen NE-Antikörper von einem Mauswirt auf menschlichem Gewebe getestet, der im Vergleich zu NE von einem Kaninchenwirt keine zuverlässige Färbung zeigte. Darüber hinaus schlugen Thålin et al. H3cit (R8) als spezifisc...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BO5534) ins Leben gerufen. Wir danken Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer und PD Dr. Ingo Königs für die Bereitstellung von Mustern. Darüber hinaus danken die Autoren dem Team der UKE Microscopy Imaging Facility (Core Facility, UKE Medical School) für die Unterstützung bei der Immunfluoreszenzmikroskopie.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
         Verdünnung
Anti-Neutrophilen-Elastase-Antikörper 100µ gabcamAb 68672 1:100
Anti-Histon H3 (Citrullin R2 + R8 + R17) Antikörper  100µ gabcamAb 51031:50
Anti-Myeloperoxidase Antikörper [2C7] anti-human 100 µ gabcamAb 259891:50
Anti-Myeloperoxidase Antikörper [2D4] Anti-Maus 50 µ gabcamAb 908101:50
Axiovision Mikroskopie-Software Zeiss4.8.2.
Blockierungslösung mit Eselsserum (GEBRAUCHSFERTIG) 50mlGeneTex 
DeckgläserMarienfeld0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrat pH6 (x10)DakoS2369
DAPI 25 mgRoth6335.11:25000
DCS Antikörperverdünnung 500 mLDCS-DiagnostikDCS AL120R500
Esel Ameisenziege Cy3JacksonImmunoResearch705-165-1471:200
Esel Anti Kaninchen AF647JacksonImmunoResearch711-605-1521:200
Esel Anti Kaninchen Cy3JacksonImmunoResearch711-165-1521:200
Fluoromount-G EindeckmediumInvitrogen00-4958-02
GlasschiebegestellRothH552.1
Mensch/Maus MPO AntikörperR& D SystemsAF 3667 1:20
Hydrophober PenKISKERMKP-1
Isokontrolle Kaninchen IgG Polyklonal 5mgabcamAb 374151:2000 und 1:250
MaxBlock Autofluoreszenz Reducing Reagent Kit (RUO) 100 mlMaxvisionMB-L
MikroskopiekameraZeissAxioCamHR3
MikrowelleBoschHMT84M421
Maus IgG1 NegativregelungDakoX0931 Aglient1:50 und 1:5
Normal Goat IgG SteuerungR& D SystemsAB-108-C 1:100
PBS Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (10x)Sigma-AldrichP-3813
PMP FärbeglasRoth2292.2
Rekombinantes Anti-Histon H3 (Citrullin R8) Antikörper 100µ gabcamAb 2194061:100
Rekombinantes Kaninchen-IgG, monoklonal [EPR25A] - Isotyp-Kontrolle 200µ gabcamAb 1727301:300
ROTI HistolRoth  6640
SuperFrost Plus ObjektträgerR. Langenbrinck03-0060
TBS Tris gepufferte Kochsalzlösung (x10)Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
WasserbadMemmert830476
Wasserbad ReiskocherreishungerRCP-30
NasskammerWeckert Labortechnik600016
Zeiss WeitfeldmikroskopZeissAxiovert 200M
UhrGTX30972 Uhr Uhr

Referenzen

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639(2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115(2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159(2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713(2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824(2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7(2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834(2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38(2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097(2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296(2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Schlagwörter

Antigen RetrievalGewebef rbungReduktion der Autofluoreszenzcitrulliniertes Histon H3Myeloperoxidase Antik rperNeutrophilen ElastaseWeitfeld FluoreszenzmikroskopieParaffineingebettetes Gewebe

Verwandte Artikel