Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Zusammenfassung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Zusammenfassung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden von Neutrophilen als Reaktion auf bakterielle Infektionen oder traumatische Gewebeschäden freigesetzt, spielen aber auch eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen und sterilen Entzündungen. Es handelt sich um netzartige Strukturen, die aus doppelsträngigen DNA-Filamenten, Histone und antimikrobiellen Proteinen bestehen. Einmal freigesetzt, können NETs extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten. Darüber hinaus sind NETs an der homöostatischen Regulation beteiligt, indem sie die Adhäsion und Koagulation von Blutplättchen stimulieren. Die dysregulierte Produktion von NETs wurde jedoch auch mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Sepsis oder Autoimmunerkrankungen, was sie zu einem vielversprechenden Ziel für therapeutische Interventionen macht. Neben der Elektronenmikroskopie ist die Visualisierung von NETs mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung derzeit eine der wenigen bekannten Methoden, um NET-Wechselwirkungen im Gewebe nachzuweisen. Daher wurden verschiedene Färbemethoden zur Visualisierung von NETs eingesetzt. In der Literatur werden verschiedene Färbeprotokolle beschrieben, und wir haben vier Schlüsselkomponenten identifiziert, die eine hohe Variabilität zwischen den Protokollen aufweisen: (1) die Art der verwendeten Antikörper, (2) die Verwendung von Autofluoreszenz-reduzierenden Mitteln, (3) Antigen-Retrieval-Methoden und (4) Permeabilisierung. Daher wurden in dieser Arbeit in vitro Immunfluoreszenz-Färbeprotokolle systemisch angepasst und verbessert, um sie für verschiedene Spezies (Maus, Mensch) und Gewebe (Haut, Darm, Lunge, Leber, Herz, Bandscheibe) anwendbar zu machen. Nach der Fixierung und Paraffineinbettung wurden 3 μm dicke Schnitte auf Objektträger montiert. Diese Proben wurden mit primären Antikörpern gegen Myeloperoxidase (MPO), citrulliniertes Histon H3 (H3cit) und neutrophile Elastase (NE) nach einem modifizierten Färbeprotokoll gefärbt. Die Objektträger wurden mit Sekundärantikörpern gefärbt und mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Ergebnisse wurden anhand eines Bewertungsbogens analysiert und Unterschiede semi-quantitativ erfasst.

Hier stellen wir ein optimiertes NET-Färbeprotokoll vor, das für verschiedene Gewebe geeignet ist. Wir verwendeten einen neuartigen Primärantikörper zur Färbung von H3cit und reduzierten die unspezifische Färbung mit einem Autofluoreszenz-reduzierenden Mittel. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NET-Färbung eine konstant hohe Temperatur und einen sorgfältigen Umgang mit den Proben erfordert.

Einleitung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) wurden erstmals 2004 von Brinkmann et al. als ein Weg des Zelltods visualisiert, der sich von Apoptose und Nekrose unterscheidet¹. Auf diesem Weg geben Neutrophile ihr dekondensiertes Chromatin in den extrazellulären Raum ab, um große netzartige Strukturen zu bilden, die mit antimikrobiellen Proteinen bedeckt sind, die zuvor in den Granula oder dem Zytosol gespeichert waren. Zu diesen antimikrobiellen Proteinen gehören neutrophile Elastase (NE), Myeloperoxidase (MPO) und citrulliniertes Histon H3 (H3cit), die üblicherweise für den indirekten Immunfluoreszenznachweis von NETs^{verwendet we....}

Protokoll

Diese Studie umfasste Mausgewebe aus Experimenten, die von der Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, genehmigt wurden (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Bei den verwendeten Geweben handelte es sich um Maus, Lunge und Dickdarm aus einem septischen Modell und verbrannte Haut. Wir haben 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse verwendet. Bei allen Versuchen wurde die europäische Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere befolgt. Die anonymisierten menschlichen Proben umfassten Gewebe von neonataler Enterokolitis, verbrannter Haut, Gallengangsatresie, Spondylodiszitis und Myokard. Nach Angaben der Ethikkommis....

Ergebnisse

Bevor wir mit unserer Protokolloptimierung begannen, identifizierten wir die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Färbung, indem wir in PubMed nach Studien suchten, die FFPE-Gewebe für die Immunfärbung von NETs verwendeten, und ihre Protokolle verglichen. Die erfolgversprechendsten Protokollunterschiede wurden als Schlüsselschritte für die Protokolloptimierung identifiziert, während Schritte, die größtenteils miteinander korrespondierten, nicht verändert wurden (Tabelle 1).

Diskussion

In dieser Arbeit zielten wir darauf ab, die bestehenden Protokolle für die Bildgebung von NETs an weitere Gewebetypen anzupassen und zu optimieren, beginnend mit dem eigentlichen Färbeprozess. Der erste kritische Schritt für diese Methode ist die Auswahl der am besten geeigneten Antikörper. Für NE haben wir einen NE-Antikörper von einem Mauswirt auf menschlichem Gewebe getestet, der im Vergleich zu NE von einem Kaninchenwirt keine zuverlässige Färbung zeigte. Darüber hinaus schlugen Thålin et al. H3cit (R8) als spezifisc.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
			Verdünnung
Anti-Neutrophilen-Elastase-Antikörper 100µ g	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histon H3 (Citrullin R2 + R8 + R17) Antikörper  100µ g	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase Antikörper [2C7] anti-human 100 µ g	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase Antikörper [2D4] Anti-Maus 50 µ g	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Mikroskopie-Software	Zeiss	4.8.2.
Blockierungslösung mit Eselsserum (GEBRAUCHSFERTIG) 50ml	GeneTex
Deckgläser	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrat pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS Antikörperverdünnung 500 mL	DCS-Diagnostik	DCS AL120R500
Esel Ameisenziege Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Esel Anti Kaninchen AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Esel Anti Kaninchen Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Eindeckmedium	Invitrogen	00-4958-02
Glasschiebegestell	Roth	H552.1
Mensch/Maus MPO Antikörper	R& D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophober Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Kaninchen IgG Polyklonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 und 1:250
MaxBlock Autofluoreszenz Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Mikroskopiekamera	Zeiss	AxioCamHR3
Mikrowelle	Bosch	HMT84M421
Maus IgG1 Negativregelung	Dako	X0931 Aglient	1:50 und 1:5
Normal Goat IgG Steuerung	R& D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP Färbeglas	Roth	2292.2
Rekombinantes Anti-Histon H3 (Citrullin R8) Antikörper 100µ g	abcam	Ab 219406	1:100
Rekombinantes Kaninchen-IgG, monoklonal [EPR25A] - Isotyp-Kontrolle 200µ g	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus Objektträger	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris gepufferte Kochsalzlösung (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Wasserbad	Memmert	830476
Wasserbad Reiskocher	reishunger	RCP-30
Nasskammer	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Weitfeldmikroskop	Zeiss	Axiovert 200M

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