Methodenartikel

Entwicklung eines Fütterungs-Assay-Systems zur Bewertung der insektiziden Wirkung von sekundären Pflanzenstoffen auf Helicoverpa armigera

DOI:

10.3791/65278

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26. Mai 2023

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1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt den obligatorischen Fütterungstest, um die potenziell toxische Wirkung eines sekundären Pflanzenstoffs auf die Larven der Lepidoptera-Insekten zu bewerten. Dabei handelt es sich um einen hochgradig skalierbaren Insekten-Bioassay, mit dem sich die subletale und letale Dosis, die abschreckende Wirkung und die physiologische Wirkung leicht optimieren lassen. Dies könnte für das Screening umweltfreundlicher Insektizide verwendet werden.

Zusammenfassung

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Helicoverpa armigera, ein Lepidoptera-Insekt, ist ein polyphager Schädling mit weltweiter Verbreitung. Dieses pflanzenfressende Insekt ist eine Bedrohung für Pflanzen und die landwirtschaftliche Produktivität. Als Reaktion darauf produzieren Pflanzen mehrere sekundäre Pflanzenstoffe, die sich negativ auf das Wachstum und Überleben des Insekts auswirken. Dieses Protokoll demonstriert eine obligatorische Fütterungstestmethode, um die Wirkung eines sekundären Pflanzenstoffs (Quercetin) auf das Wachstum, die Entwicklung und das Überleben von Insekten zu bewerten. Unter kontrollierten Bedingungen wurden die Neugeborenen bis zum zweiten Instar mit einer vordefinierten künstlichen Diät gehalten. Diese Larven durften sich 10 Tage lang von einer Kontroll- und Quercetin-haltigen Kunstnahrung ernähren. Das Körpergewicht, das Entwicklungsstadium, das Fraßgewicht und die Sterblichkeit der Insekten wurden an abwechselnden Tagen aufgezeichnet. Die Veränderung des Körpergewichts, der Unterschied im Fütterungsmuster und die Entwicklungsphänotypen wurden während der gesamten Testzeit bewertet. Der beschriebene obligatorische Fütterungsassay simuliert eine natürliche Art der Aufnahme und kann auf eine große Anzahl von Insekten hochskaliert werden. Es ermöglicht die Analyse der Wirkung von sekundären Pflanzenstoffen auf die Wachstumsdynamik, den Entwicklungsübergang und die allgemeine Fitness von H. armigera. Darüber hinaus kann dieser Aufbau auch verwendet werden, um Veränderungen von Ernährungsparametern und verdauungsphysiologischen Prozessen zu bewerten. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methodik für Fütterungs-Assay-Systeme, die in toxikologischen Studien, beim Screening von insektiziden Molekülen und zum Verständnis chemischer Effekte bei Pflanzen-Insekten-Interaktionen eingesetzt werden können.

Einleitung

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Die biotischen Faktoren, die die Produktivität der Pflanzen beeinflussen, sind hauptsächlich Krankheitserreger und Schädlinge. Mehrere Schadinsekten verursachen 15 % bis 35 % der landwirtschaftlichen Ernteverluste und beeinträchtigen die wirtschaftliche Nachhaltigkeit1. Insekten, die zu den Ordnungen Coleoptera, Hemiptera und Lepidoptera gehören, sind die Hauptordnungen der verheerenden Schädlinge. Die hochgradig anpassungsfähige Natur der Umwelt hat den Schmetterlingen bei der Entwicklung mehrerer Überlebensmechanismen geholfen. Unter den Schmetterlingsinsekten kann sich Helicoverpa armigera (Baumwollkapselwurm) von etwa 180 verschiedenen Nutzpflanzen ernähren und deren Fortpflanzungsgewebe erheblich schädigen2. Weltweit hat der Befall mit H. armigera zu einem Verlust von rund 5 Milliarden US-Dollar geführt3. Baumwolle, Kichererbsen, Taubenerbsen, Tomaten, Sonnenblumen und andere Nutzpflanzen sind Wirte für H. armigera. Es vervollständigt seinen Lebenszyklus an verschiedenen Teilen der Wirtspflanze. Die Eier der Mottenweibchen schlüpfen auf den Blättern, gefolgt von ihrer Ernährung im vegetativen Gewebe während der Larvenstadien. Das Larvenstadium ist aufgrund seiner gefräßigen und sehr anpassungsfähigen Natur am zerstörerischsten 4,5. H. armigera zeigt eine globale Verbreitung und ein Vordringen in neue Territorien aufgrund seiner bemerkenswerten Eigenschaften wie Polyphagie, ausgezeichnete Wanderfähigkeiten, höhere Fruchtbarkeit, starke Diapause und das Aufkommen von Resistenzen gegen bestehende Insektenbekämpfungsstrategien6.

Verschiedene chemische Moleküle aus Terpenen, Flavonoiden, Alkaloiden, Polyphenolen, cyanogenen Glucosiden und vielen anderen werden häufig zur Bekämpfung des H. armigera-Befalls verwendet7. Die häufige Anwendung chemischer Moleküle hat jedoch aufgrund der Aufnahme ihrer Rückstände nachteilige Auswirkungen auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit. Außerdem wirken sie sich nachteilig auf verschiedene Schädlingsfresser aus, was zu einem ökologischen Ungleichgewicht führt 8,9. Daher besteht die Notwendigkeit, sichere und umweltfreundliche Optionen für chemische Moleküle zur Schädlingsbekämpfung zu untersuchen.

Natürliche insektizide Moleküle, die von Pflanzen produziert werden (sekundäre Pflanzenstoffe), können als vielversprechende Alternative zu chemischen Pflanzenschutzmitteln eingesetzt werden. Zu diesen sekundären Pflanzenstoffen gehören verschiedene Sekundärmetaboliten, die zu den Klassen Alkaloide, Terpenoide und Phenole gehören 7,10. Quercetin ist eines der am häufigsten vorkommenden Flavonoide (phenolische Verbindung), die in verschiedenen Getreidesorten, Gemüse, Obst und Blättern enthalten sind. Es zeigt eine abschreckende und insektizide Wirkung gegen Insekten; Es ist auch nicht schädlich für natürliche Feinde von Schädlingen11,12. Somit demonstriert dieses Protokoll den Fütterungsassay mit Quercetin, um seine toxische Wirkung auf H. armigera zu bewerten.

Es wurden verschiedene Bioassay-Methoden entwickelt, um die Wirkung natürlicher und synthetischer Moleküle auf die Nahrungs-, Wachstums-, Entwicklungs- und Verhaltensmuster eines Insekts zu bewerten13. Zu den häufig verwendeten Methoden gehören der Blattscheiben-Assay, der Choice-Fütterungs-Assay, der Tröpfchen-Fütterungs-Assay, der Kontakt-Assay, der Diät-Covering-Assay und der obligate Fütterungs-Assay13,14. Diese Methoden werden danach klassifiziert, wie Pestizide auf Insekten angewendet werden. Der obligate Fütterungstest ist eine der am häufigsten verwendeten, empfindlichsten, einfachen und anpassungsfähigsten Methoden, um wahrscheinliche Insektizide und ihre tödliche Dosis zu testen14. In einem obligaten Fütterungsassay wird das interessierende Molekül mit einer künstlichen Nahrung vermischt. Dies sorgt für Konsistenz und Kontrolle über die Zusammensetzung des Futters und führt zu robusten und reproduzierbaren Ergebnissen. Wichtige Variablen, die die Fütterungstests beeinflussen, sind das Entwicklungsstadium des Insekts, die Wahl des Insektizids, Umweltfaktoren und die Probengröße. Die Dauer des Assays, das Intervall zwischen zwei Datenaufzeichnungen, die Häufigkeit und Menge der gefütterten Nahrung, die Gesundheit der Insekten und die Handhabungsfähigkeit der Bediener können das Ergebnis der Fütterungsassays ebenfalls beeinflussen14,15.

Ziel dieser Studie ist es, den obligatorischen Fütterungsassay zu demonstrieren, um die Wirkung von Quercetin auf das Überleben und die Fitness von H. armigera zu bewerten. Die Bewertung verschiedener Parameter, wie z.B. das Körpergewicht der Insekten, die Sterblichkeitsrate und Entwicklungsstörungen, wird Einblicke in die insektizide Wirkung von Quercetin geben. In der Zwischenzeit wird die Messung von Ernährungsparametern, einschließlich der Effizienz der Umwandlung von aufgenommener Nahrung (ECI), der Effizienz der Umwandlung von verdauter Nahrung (ECD) und der ungefähren Verdaulichkeit (AD), die antifeedativen Eigenschaften von Quercetin hervorheben.

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Protokoll

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Die Larven von H. armigera wurden vom ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR) in Bangalore, Indien, erworben. Für die vorliegende Studie wurden insgesamt 21 Second-Instar-Larven verwendet.

1. Zubereitung einer künstlichen Diät auf Kichererbsenbasis

HINWEIS: Eine Liste der Zutaten, die für die Zubereitung einer künstlichen Diät erforderlich sind, ist in Tabelle 1 aufgeführt.

  1. Alle Fraktionen werden separat in einem Becherglas abgewogen, wie in Tabelle 1 aufgeführt, und mit einem Spatel/Magnetrührer eine homogene Mischung hergestellt.
  2. Fraktion C bei ca. 100 °C in der Mikrowelle 5 min kochen, zu Fraktion A geben und gründlich mischen.
  3. Nach gründlichem Mischen die gemischte Fraktion etwas abkühlen lassen, bevor man Fraktion B hinzufügt (Fraktion B enthält hitzelabile Bestandteile).
  4. In eine durchsichtige Petrischale aus Polystyrol (150 mm x 150 mm) geben.

2. Zubereitung von quercetinhaltiger künstlicher Diät

  1. Wiegen Sie die entsprechende Menge (1.000 ppm) Quercetinhydrat (siehe Materialtabelle) ab und lösen Sie es ordnungsgemäß in der Mindestmenge organischer Lösungsmittel wie Ethanol (2 mg/ml), Dimethylsulfoxid (DMSO; 30 mg/ml) oder Dimethylformamid (DMF) auf. Hier wird DMSO zum Lösen von Quercetin eingesetzt.
  2. Gelöstes Quercetin in Fraktion B geben, gefolgt von Zugabe in die Mischung der Fraktionen A und C (das von Fraktion B reduzierte Wasservolumen entspricht dem Volumen des zugegebenen DMSO).
  3. Geben Sie ein gleiches Volumen des organischen Lösungsmittels, das zum Auflösen von Quercetin verwendet wird, in die Kontrolldiät.
    HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung der Zubereitung von künstlichen und quercetinhaltigen Diäten.

3. Aufzucht und Pflege der H. armigera-Kultur

HINWEIS: Verwenden Sie entsprechend gereinigte und sterilisierte Materialien für die Aufzucht und Pflege von Insekten. Gehen Sie vorsichtig mit den Insekten um, indem Sie alle Sterilitäts- und sicherheitsrelevanten Standardarbeitsanweisungen 16,17,18 befolgen.

  1. Bewahren Sie die Eier von H. armigera in der Zuchtkammer (mit Musselintuch abgedecktes Plastikglas) unter den in Schritt 3.3 beschriebenen Bedingungen auf. Übertragen Sie dann frisch geschlüpfte Neugeborene vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf eine frisch zubereitete künstliche Diät auf Kichererbsenbasis.
  2. Verwenden Sie eine künstliche Ernährung für die Aufzucht der Larven und 20 % (w/v) Saccharoselösung mit 1 % (w/v) Multivitamin (siehe Materialtabelle) für erwachsene Motten19,20.
    HINWEIS: Da die dritte und ältere Larve von H. armigera eine kannibalische Tendenz zeigen, ist es notwendig, jede Larve in einem separaten Fläschchen aufzuziehen.
  3. Halten Sie die Temperatur bei 25 ± 1 °C und die relative Luftfeuchtigkeit bei 70 % im Insektenkulturraum mit einer 16 h Licht:8 h dunklen Photoperiode21.
  4. Züchten Sie eine Generation von Insekten im Labor, um die Homogenität zu gewährleisten, und verwenden Sie sie dann für den Fütterungstest.
  5. Erhöhen Sie optional die Temperatur des Insektenkulturraums auf 28 °C, um das Wachstum von Larven und Puppen zu beschleunigen22.

4. Aufbau für den Fütterungsassay

  1. Sammeln Sie 21 Sekunden Instar-Larven für jeden Satz (Kontrolle und Behandlung) und halten Sie sie ca. 1-3 Stunden lang von der Nahrung fern.
  2. Schneiden Sie die Kontroll- und Quercetin-haltige Nahrung in kleine Stücke, notieren Sie das Gewicht der verabreichten Nahrung und den Körper des Insekts und geben Sie die Insekten vorsichtig in Kulturfläschchen um. Lassen Sie die Insekten sich von der jeweiligen Nahrung ernähren.
    HINWEIS: Dies sollte als Tag 0 des Fütterungstests betrachtet werden.
  3. Notieren Sie das Gewicht des Insektenkörpers, die erhaltene Nahrung, die nicht gefressene Nahrung und den Frass an abwechselnden Tagen (Tag 2, 4, 6, 8 und 10) bis zum 10. Tag der Untersuchung.
  4. Lassen Sie sie nach Tag 10 mit ihrer jeweiligen Ernährung füttern, um weitere Entwicklungs- und morphologische Veränderungen zu beobachten.
    ANMERKUNG: Die Entwicklungsveränderungen durch: (1) Larven-Puppen-Zwischenprodukte, wie z. B. den hinteren Puppenhalbkörper mit Larven-Kutikulaflecken, einer Kopfkapsel und Brustbeinen; (2) Prepupae mit einem vollständig geschwärzten Körper; (3) untermaßige Puppen mit Körperschrumpfung; (4) Puppenmotte intermediär Motten mit der alten Puppenhaut. Zu den morphologischen Veränderungen gehören missgebildete erwachsene Motten mit abnormen Körpern, verdrehten Flügeln und gelenkigen Beinen. Diese Veränderungen werden dann mit Insekten verglichen, die mit der Kontrollnahrung gefüttert wurden.
  5. Frieren Sie die Insekten an Tag 10 ein, wenn die Untersuchung von Entwicklungs- und morphologischen Defekten nicht erforderlich ist.
    HINWEIS: Bevor die Larven eingefroren werden, müssen sie mindestens 3 Stunden lang von der Nahrung befreit werden, um Futterreste aus dem Verdauungstrakt zu entfernen.

5. Datenerfassung und -analyse

  1. Wählen Sie in der GraphPad Prism-Software (siehe Materialtabelle) eine XY-Datentabelle aus dem Dialog "Willkommen oder Neue Tabelle" aus und geben Sie darin die Anzahl der Insekten ein, die Werte nebeneinander in den Unterspalten replizieren. Geben Sie dann der X-Achse den Titelnamen als Anzahl der Tage an, und geben Sie in den Gruppen A und B den Titelnamen als Kontroll- bzw. Quercetin-Behandlung an. Kontrollieren Sie das Körpergewicht jedes Insekts und behandeln Sie es, um das Körpergewichtsdiagramm zu erstellen.
    HINWEIS: Die Analyse in GraphPad kann je nach Stichprobengröße und Anzahl der Behandlungen variieren.
  2. Vergleichen Sie das Körpergewicht der Insekten zwischen der Kontroll- und der Behandlungsgruppe mit einem studentischen t-Test (α = 0,05).
  3. Zählen Sie die lebenden und toten Larven und Puppen an Tag 10, um mit der Grafiksoftware eine Kaplan-Meier-Kurve für den Überlebensprozentsatz zu zeichnen.
  4. Zählen Sie die Anzahl der Puppen und berechnen Sie den Prozentsatz der Verpuppung mit der angegebenen Formel:
  5. Prozentsatz der Verpuppung (%) = (Anzahl der gebildeten Puppen/Gesamtzahl der Larven) x 100
  6. Vergleichen Sie die Larvenentwicklung in Bezug auf die Nährwertindizes23 mit den folgenden Formeln: ECI (%) = (Gewichtszunahme der Larven/Gewicht des gefressenen Futters) x 100
    ECD (%) = (Gewichtszunahme der Larven/[Gewicht des gefressenen Futters - Gewicht des Frass]) x 100
    AD (%) = ([Gewicht des gefressenen Futters - Gewicht des Futters]/Gewicht des gefressenen Futters) x 100

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Ergebnisse

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Insektenlarven, die mit einer Diät gefüttert wurden, die 1.000 ppm Quercetin enthielt, zeigten eine signifikante Abnahme des Körpergewichts von ~57% im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 2A). Die Verringerung des Körpergewichts führte zu einer reduzierten Körpergröße der mit Quercetin behandelten Larven (Abbildung 2B). Es wurde eine deutliche Verringerung der Fressrate der mit Quercetin gefütterten Larven im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet (

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Diskussion

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Labor-Bioassays sind nützlich, um Ergebnisse vorherzusagen und vergleichende Toxizitätsdaten für mehrere Verbindungen in kurzer Zeit zu vertretbaren Kosten zu erstellen. Der Fütterungsbioassay hilft bei der Interpretation der Wechselwirkungen zwischen Insekten-Insektizid und Insekten-Pflanze-Insektiziden. Es handelt sich um eine effiziente Methode zur Messung der Toxizität einer Vielzahl von Substanzen, die den Prozess der Bestimmung der letalen Dosis 50 (LD50), der letalen Konzentration 50 (LC50) o...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklärten, dass kein Interessenkonflikt bestehe.

Danksagungen

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SM, YP und VN würdigen das Stipendium, das von der University Grants Commission, Government of India, New Delhi, vergeben wird. RJ dankt dem Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien, und dem CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, Indien, für die finanzielle Unterstützung im Rahmen der Projektcodes MLP036626, MLP101526 und YSA000826.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agar AgarHimediaRM666Verfestigungsmittel
AscorbinsäureHimediaCMS1014Vitamin-C-Quelle
Bengalisches GrammNANA Protein- und Kohlenhydratquelle
CaseinSigmaC-5890Proteinquelle
CholesterinSisco Research Laboratories34811Fettsäurequelle
Cholin ChloridHimediaGRM6824Ammoniumsalz
DMSOSigma67-68-5Solvent
GraphPad Prism v8.0https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Methyl ParabenHimediaGRM1291Antimykotikum
Multivitamin-KapselGalaxoSmithKlineNAVitaminquelle
QuercetinSigmaQ4951-10GPhytochemische
SorbinsäureHimediaM1880Antimikrobielle Mittel
StreptomycinHimediaCMS220Antibiotikum
Vitamin E KapselNukind HealthcareNAVitamin E Quelle
HefeextraktHimediaRM027Aminosäurequelle

Referenzen

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