Eine dreidimensionale Technik zur Visualisierung mitochondrialer ultrastruktureller Veränderungen in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie mitochondriale Cristae rekonstruiert werden, um eine 3D-Bildgebung mit hoher Genauigkeit, hoher Auflösung und hohem Durchsatz zu erreichen.

Abstract

Das Verständnis der dynamischen Eigenschaften der Ultrastruktur der Zellorganellen, die nicht nur reich an unbekannten Informationen ist, sondern auch aus einer dreidimensionalen (3D) Perspektive anspruchsvoll ist, ist für mechanistische Studien von entscheidender Bedeutung. Die Elektronenmikroskopie (EM) bietet eine gute Abbildungstiefe und ermöglicht die Rekonstruktion hochauflösender Bildstapel, um die ultrastrukturelle Morphologie von Zellorganellen auch auf der Nanometerskala zu untersuchen. daher gewinnt die 3D-Rekonstruktion aufgrund ihrer unvergleichlichen Vorteile an Bedeutung. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) bietet eine Hochdurchsatz-Bilderfassungstechnologie, die es ermöglicht, große Strukturen in 3D aus demselben interessierenden Bereich in aufeinanderfolgenden Schichten zu rekonstruieren. Daher wird die Anwendung von REM in der großflächigen 3D-Rekonstruktion zur Wiederherstellung der echten 3D-Ultrastruktur von Organellen immer häufiger. In diesem Protokoll schlagen wir eine Kombination aus seriellen Ultradünnschnitt- und 3D-Rekonstruktionstechniken vor, um mitochondriale Cristae in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zu untersuchen. Die Details, wie diese Techniken durchgeführt werden, werden in diesem Protokoll Schritt für Schritt beschrieben, einschließlich der Osmium-Thiocarbohydrazid-Osmium (OTO)-Methode, der seriellen Ultradünnschnitt-Bildgebung und der Visualisierungsanzeige.

Introduction

Mitochondrien sind eines der wichtigsten Organellen in der Zelle. Sie dienen als zentraler Knotenpunkt der zellulären Bioenergetik und des Stoffwechsels ^1,2 und spielen eine entscheidende Rolle bei Krebs³. Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC) ist aufgrund seiner schnellen Ausbreitung und hohen Sterblichkeitsrate eine der am schwierigsten zu behandelnden Krebsarten⁴. Die mitochondriale Dysfunktion, die hauptsächlich durch Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie verursacht wird 3,5,6,7, wurde mit den Krankheitsmechan....

Protocol

1. Vorbereitung des Materials

1. 2 x 10⁶ Panc02-Zellen in 12 ml DMEM-Medium (10 % fötales Kälberserum und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin) kultivieren und 48 Stunden lang bei 37 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft aufbewahren.
2. Panc02-Zellen werden gesammelt, 2 Minuten lang bei 28 x g zentrifugiert und dann der Überstand verworfen. Stellen Sie sicher, dass die Probe eine angemessene Größe hat (1 x 10⁷ Zellen), da sonst die folgenden Fixierungs- und Dehydratisierungsschritte nicht gut funktionieren.
3. Fügen Sie 1 ml 2,5%iges Glutaraldehyd als Fixierm....

Results

Während der Zellkultur (Abbildung 1A) teilten wir die Pankreaskarzinomzellen zunächst in eine Kontrollgruppe, die mit vollständigem Kulturmedium kultiviert wurde, eine (1S,3R)-RSL3⁴⁸ (RSL3, ein Ferroptoseaktivator, 100 nM) Gruppe und eine RSL3 (100 nM) plus Ferrostatin-1⁴⁹ (Fer-1, ein Ferroptose-Inhibitor, 100 nM) Gruppe. Durch die oben genannten experimentellen Schritte nahm das Rasterelektronenmikroskop 38 (ergänzende Abbildung 1), 43 (ergänz.......

Discussion

Die hier vorgestellte Methode ist eine nützliche Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Anwendung der 3D-Rekonstruktionstechnik, bei der Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitungstechnologie auf das Stapeln und Segmentieren von 2D-Tomographiebildern angewendet werden, die aus seriellen ultradünnen Schnitten erzeugt werden. Dieses Protokoll hebt eine Einschränkung von 2D-Bildern hervor, die durch die 3D-Visualisierung der Organellen-Ultrastruktur behoben werden kann, was die Vorteile einer starken Reproduzierbarkeit der S.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Aceton	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging		2020.2
Asparaginsäure	MCE	HY-42068
Dulbeccos modifizierter Adler' s Medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fötales Rinderserum	Gibco	10437010
Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyd	Alfa Aesar	A10500.22
Blei Nitrat	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmiumtetroxid	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	Europäische Sammlung authentifizierter Zellkulturen
Penicillin-Streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxidharz	SPI	CHEM GS02660
Kaliumferrocyanid	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazid	Merck	223220
Ultramikrotom	LEICA	EMUC7
Uranylacetat	RHAWN	R032929