Ein Open-Source-Framework für die Massenberechnung von Antikörper-basierten therapeutischen Molekülen

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung einer Softwareanwendung, mAbScale, für die Berechnung von Massen für monoklonale Antikörper-basierte Proteintherapeutika.

Abstract

Biotherapeutische Massen sind ein Mittel zur Überprüfung der Identität und der strukturellen Integrität. Die Massenspektrometrie (MS) von intakten Proteinen oder Proteinuntereinheiten bietet ein einfaches Analysewerkzeug für verschiedene Stadien der biopharmazeutischen Entwicklung. Die Identität des Proteins wird bestätigt, wenn die experimentelle Masse aus MS innerhalb eines vordefinierten Massenfehlerbereichs der theoretischen Masse liegt. Es gibt zwar mehrere Berechnungswerkzeuge für die Berechnung von Protein- und Peptidmolekulargewichten, aber sie wurden entweder nicht für die direkte Anwendung in biotherapeutischen Einrichtungen entwickelt, haben Zugriffsbeschränkungen aufgrund kostenpflichtiger Lizenzen oder erfordern das Hochladen von Proteinsequenzen auf Host-Server.

Wir haben eine modulare Massenberechnungsroutine entwickelt, die die einfache Bestimmung der durchschnittlichen oder monoisotopischen Massen und der elementaren Zusammensetzung von therapeutischen Glykoproteinen ermöglicht, einschließlich monoklonaler Antikörper (mAb), bispezifischer Antikörper (bsAb) und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC). Der modulare Charakter dieses Python-basierten Berechnungsframeworks wird es ermöglichen, diese Plattform in Zukunft auf andere Modalitäten wie Impfstoffe, Fusionsproteine und Oligonukleotide auszuweiten, und dieses Framework könnte auch für die Abfrage von Top-Down-Massenspektrometriedaten nützlich sein. Durch die Erstellung einer eigenständigen Open-Source-Desktop-Anwendung mit einer grafischen Benutzeroberfläche (GUI) hoffen wir, die Einschränkungen bei der Verwendung in Umgebungen zu überwinden, in denen proprietäre Informationen nicht in webbasierte Tools hochgeladen werden können. Dieser Artikel beschreibt die Algorithmen und die Anwendung dieses Werkzeugs, mAbScale, auf verschiedene antikörperbasierte therapeutische Modalitäten.

Introduction

In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich Biotherapeutika zu einer tragenden Säule der modernen Pharmaindustrie entwickelt. Die SARS-CoV2-Pandemie und andere lebensbedrohliche Erkrankungen haben den Bedarf an einer schnelleren und breiteren Entwicklung biopharmazeutischer Moleküle weiter erhöht ^1,2,3.

Das biotherapeutische Molekulargewicht ist in Kombination mit anderen analytischen Assays entscheidend für die Identifizierung des Moleküls. Die intakten und reduzierten Untereinheitenmassen werden während des gesamten Forschungs- und Entwicklungslebenszyklus als Teil von Kontrollstrategien verwendet, die darauf abzielen, die Qualität aufrechtzuerhalten, wie im QTPP (Quality Target Product Profile)⁴ beschrieben.

Die analytische Entwicklung in der biopharmazeutischen Industrie stützt sich in hohem Maße auf Massenmessungen für die Analyse intakter Massen und eine tiefgreifende Charakterisierung mittels Peptid-Mapping oder Multi-Attribut-Methode (MAM)-Überwachung. Im Mittelpunkt dieser Techniken, bei denen moderne Massenspektrometrie-Plattformen (MS) zum Einsatz kommen, steht die Fähigkeit, hochauflösende, genaue Massenmessungen (HR/AM) durchzuführen. Die meisten HR/AM-Geräte liefern Massengenauigkeiten im Bereich von 0,5 bis 5 ppm, die mit dem Massenbereich skaliert werden. Die Fähigkeit, Massen für intakte große Moleküle genau zu messen, ermöglicht die schnelle und sichere Identifizierung von Therapeutika mit großen Molekülen. Da die Isotopenauflösung unter typischen experimentellen Bedingungen für große Moleküle (>10 kDa) nicht erreicht werden kann, müssen für den Vergleich und die Identifizierung mittlere Massen berechnet werden ^5,6.

Ein typisches Massenspektrum eines intakten oder untergliedrigen Proteins stellt das gesamte Proteoformprofil dar, das zusammengesetzte Informationen über die verschiedenen molekularen Formen enthält, die sich aus posttranslationalen Modifikationen (PTM) und etwaigen primären Strukturunterschieden, wie z. B. Clips oder Sequenzvarianten, ergeben. Die relativ einfache Natur und der hohe Durchsatz dieser Messungen machen sie attraktiv für die Charakterisierung und als In-Prozess-Überwachungskontrollen ^7,8. Die Datenanalyse für diese Experimente erfordert in der Regel, dass der Benutzer den Suchraum für molekulare Formen (Bereich von PTMs oder anderen molekularen Formen) definiert. Für glykosylierte Proteine wird dieser Suchraum weitgehend durch die Heterogenität der Glykoformen bestimmt. Kombinationen aus mehreren PTMs, Disulfidbrückenkonfigurationen und anderen Variationen entlang der Primärstruktur machen die Berechnung aller möglichen Molekülformen zu einer mühsamen Aufgabe. Daher ist die manuelle Berechnung der möglichen Molekülformen ein zeit- und ressourcenintensiver Prozess mit einem hohen Potenzial für menschliche Fehler.

Hier stellen wir ein Massenberechnungstool vor, das unter Berücksichtigung der wichtigsten Eigenschaften biotherapeutischer Moleküle, wie z.B. mAbs, bsAbs, ADCs, etc., entwickelt wurde. Das Werkzeug ermöglicht die einfache Einbindung von Suchraumvariablen zur konsistenten Berechnung von Massen und Elementzusammensetzungen. Der modulare Charakter dieses Werkzeugs wird es ermöglichen, es weiterzuentwickeln und auf die Massenberechnung und das Massenanpassungssystem für andere Modalitäten anzuwenden.

Das GUI-Modul ermöglicht es dem Benutzer, die Eingabe für die Massenberechnung anzugeben, wie in Abbildung 1 gezeigt. Konkret gibt der Anwender einbuchstabige Aminosäuresequenzen für leichte und schwere Antikörperketten ein. Gängige Modifikationen für die N-terminale Zyklisierung mit schweren Ketten und das C-terminale Lysin-Clipping sind als Kontrollkästchen enthalten. Ferner kann die chemische Formel/Elementzusammensetzung über das entsprechende Chem Mod-Textfeld zu diesen Proteinketten addiert/subtrahiert werden. Dies gibt dem Benutzer die Flexibilität, eine elementare Zusammensetzung hinzuzufügen, die mehrere posttranslationale Modifikationen oder im Falle eines ADC eine kleinmolekulare Nutzlast enthält. Da die meisten therapeutischen mAbs so konstruiert sind, dass sie die Glykosylierungsstellen in der Leichtkette entfernen, ist die Glykosylierung in der Leichtkette optional und kann über ein Kontrollkästchen in der GUI angegeben werden.

Eine typische Variante der Analyse intakter Massen für Antikörper ist eine Analyse mit reduzierter Untereinheitsmasse, bei der die leichte Kette von der schweren Kette gelöst wird, indem die Disulfidbrücken zwischen den Ketten reduziert werden. Abhängig von der Stärke des verwendeten Reduktionsmittels können die Disulfidbindungen innerhalb der Kette gespalten werden oder nicht. Die Benutzer haben die Flexibilität, die Gesamtzahl der Disulfidbrücken in Abhängigkeit vom IgG-Subtyp oder im Falle eines Cystein-konjugierten ADC⁹ einzugeben.

Die Anwendung berechnet Massen nach dem Bottom-up-Verfahren, wobei zunächst die elementaren Zusammensetzungen für die einzelnen schweren Ketten und leichten Ketten berechnet werden. Als nächstes wird das Lys-Clipping der Schwerketten-N-terminalen Cyclisierung (HC) durch Anpassung der berechneten Elementzusammensetzungen berücksichtigt. Alle spezifizierten chemischen Modifikationen werden dann auf die schweren und/oder leichten Ketten aufgebracht. Abhängig von der Art der Analyse und den vom Anwender vorgegebenen Disulfidbindungsmustern wird die Anzahl der Wasserstoffe für die beiden Polypeptidketten angepasst. Die glykosylierten HC- und Leichtkettenmassen (LC) (optional) werden auf der Grundlage der Eingaben des Benutzers berechnet. Schließlich werden mehrere HC- und LC-Massen kombiniert, und die Disulfidbrückennummern werden automatisch für die Berechnung der intakten Masse aktualisiert.

Bei größeren Molekülen, wie z.B. intakten Proteinen, können monoisotopische Massen aufgrund des additiven Massendefekts bei der Verwendung von Massenspektrometern mit typischem Auflösungsvermögen nicht gemessen werden. Stattdessen werden Nenn- oder Durchschnittsmassen gemessen oder gemeldet 5,10,11,12,13. Die durchschnittlichen Elementmassen können je nach der Quelle, die für die kuratierten Massen verwendet wird, variieren^14,15. Die Unterschiede in den Elementmassen mögen zwar gering sein, können sich aber für die Berechnung des Molekulargewichts großer Moleküle zu signifikanten Werten summieren. Die durchschnittlichen Elementmassen, die standardmäßig in der Softwareanwendung verwendet werden, sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Für regulierte Umgebungen wie den Bereich der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung (F&E) ist es wichtig, konsistente Molekülmassen beizubehalten, da Änderungen der Massen Änderungen an der molekularen Einheit während der Zulassungsanträge bedeuten können. Um eine konsistente Verwendung von Elementmassen zu ermöglichen, ist ein Wörterbuch der Elementmassen als CSV-Textdatei (Comma-Separated Value) im Software-Tool enthalten: Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). In ähnlicher Weise ist eine kuratierte Liste von Glykanzusammensetzungen enthalten, die typischerweise auf mAbs zu sehen sind: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Beide Dateien werden im selben Ordner wie eine ausführbare Anwendung gespeichert und können vom Benutzer geändert werden, um eine bestimmte Elementmassenliste oder Glykanbibliothek zu verwenden.

Abbildung 1: GUI-Schnittstelle für die mAbScale-Anwendung. Das GUI-Modul ermöglicht es dem Benutzer, die Eingabe für die Massenberechnung anzugeben. Der Benutzer gibt einbuchstabige Aminosäuresequenzen für die leichten und schweren Antikörperketten ein. Gängige Modifikationen für die N-terminale Zyklisierung mit schweren Ketten und das C-terminale Lysin-Clipping sind als Kontrollkästchen enthalten. Chemische Formeln/Elementzusammensetzungen können über das entsprechende Chem Mod-Textfeld addiert/subtrahiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

Der allgemeine Workflow für mAbScale ist in Abbildung 2 dargestellt. Jeder Schritt verfügt über ausgefeiltere innere Entscheidungszweige, Schleifen und Kombinatorik. Ein detaillierter algorithmischer Workflow, der den Berechnungsprozess beschreibt, ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Die Anwendungsausgabe wird in einem Tabellenkalkulationsformat in dem vom Benutzer ausgewählten Ordner gespeichert. Die Ausgabedatei besteht aus mehreren separaten Arbeitsblättern, die als Benutzereingabe, Molekulargewichtsberechnungen und Referenzen für die Ableitungen der durchschnittlichen Isotopenmasse kategorisiert werden können (Beispielausgaben finden Sie in ergänzenden Tabellen). Die Arbeitsblätter für die Benutzereingabe enthalten die Proteinaminosäuresequenzen und andere vom Benutzer eingegebene Informationen, gemittelte Elementmassen und Glykanmassen, die zur Berechnung der Elementzusammensetzung und verschiedener Molekulargewichte verwendet werden. Die Molekulargewichtsberechnungsblätter enthalten die chemische Zusammensetzung verschiedener Formen, die reduzierte Masse mit und ohne Glykosylierung und chemische Modifikation sowie die intakte Masse mit und ohne Glykosylierung und chemische Modifikation. Blätter, die Halbantikörpermassen enthalten, werden automatisch generiert, wenn der Benutzer zwei verschiedene HCs und/oder zwei verschiedene LCs auf der Benutzereingabeseite eingibt, da Halbantikörper primäre Verunreinigungen sind, die relativ zum gewünschten Heterodimer identifiziert und quantifiziert werden müssen. Der Quellcode für mAbScale kann über das folgende Repository aufgerufen werden: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.

Abbildung 2: Überblick über die Schritte zur Berechnung von Elementzusammensetzungen und -massen mit der Anwendung. Die Farbcodierung kann verwendet werden, um eine Verknüpfung mit dem in der ergänzenden Abbildung 1 beschriebenen Prozessablauf herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Öffnen der mAbscale-Anwendung

1. Öffnen Sie die Softwareanwendung, indem Sie auf das Symbol für die ausführbare Datei doppelklicken.

2. Sequenzeintrag

1. Geben Sie die Heavy-Chain- und Light-Chain-Sequenzen in die jeweiligen Textfelder ein, die mit 1 ohne Leerzeichen gekennzeichnet sind.
   1. Fügen Sie für bsAbs zusätzliche schwere oder leichte Ketten in den zweiten Satz von Textfeldern ein, die mit 2 gekennzeichnet sind. Lassen Sie 2 leer für mAbs mit identischen schweren Ketten und leichten Ketten.
   2. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen N-Klemmenzyklisierung und/oder C-Klemmen-Clipping , wenn diese Schwerkettenklemmenvarianten anwendbar sind.
   3. Fügen Sie alle chemischen Modifikationen, einschließlich Linker und Nutzlast für ADC-Moleküle, in die Textfelder "Heavy Chain Chem Mod" und/oder "Light Chain Chem Mod " ein.
      1. Geben Sie Modifikationen als elementare Zusammensetzungen an, z. B. CaCl₂. Die Modifikation wird an die jeweilige Proteinuntereinheit oder -kette angefügt.
         ANMERKUNG: Eine chemische Zusammensetzung kann auch von einer Untereinheit oder Kette subtrahiert werden, indem der elementaren Zusammensetzung ein Zeichen - vorangestellt wird. Zum Beispiel subtrahiert -_H2Oein Wassermolekül von der Zusammensetzung und Masse der Untereinheit.

3. Angabe der Anzahl der Disulfidbrücken

1. Geben Sie die Anzahl der Disulfidbrücken in den Proteinmolekülen im Textfeld Gesamtanzahl der Disulfide an.
2. Geben Sie die Anzahl der unreduzierten HC-Disulfide in das Textfeld Unreduzierte HC-Disulfide und die Anzahl der unreduzierten LC-Disulfide in das Textfeld Unreduzierte LC-Disulfide ein, je nach Ausmaß der Reduktion (vollständig vs. teilweise).
   HINWEIS: Die reduzierte Massenanalyse von mAb-Untereinheiten beinhaltet die Reduktion/Trennung der disulfidverknüpften schweren und leichten Ketten.
3. Wenn Glykosylierung an der mAb-Leichtkette vorhanden ist, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Leichte Kette ist glykosyliert .

4. Festlegen des Ausgabeordners und Ausführen der Anwendung

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Durchsuchen , um einen Ausgabeordner für das Textfeld Ausgabeordner auszuwählen.
2. Geben Sie den Namen der Ausgabedatei ohne Dateierweiterung (wird automatisch als .xlsx gespeichert) in das Textfeld Excel-Datei (kein ext) ein.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden , um die Bewerbung zu starten. Die Ausgabedatei befindet sich im dafür vorgesehenen Ordner.
   HINWEIS: Die Elementmassen und die Liste der Glykane können angepasst werden, indem die durch Trennzeichen getrennten Textdateien Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1) bzw. Glycan.csv (Supplementary Coding File 2) bearbeitet werden. Diese Dateien müssen im selben Ordner wie die ausführbare Datei mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) abgelegt werden, damit die Anwendung ausgeführt werden kann. Die Anwendung wird nach einmaliger Ausführung automatisch geschlossen. Der Benutzer muss die App erneut starten, wenn eine zweite Berechnung erforderlich ist.

Results

Es wurde eine Vielzahl von mAbs ausgewählt, um verschiedene Arten von mAbs zu repräsentieren. Ein kommerziell erhältlicher mAb-Standard wurde ausgewählt, um einen konventionellen mAb mit identischen schweren Ketten, identischen leichten Ketten und einer N-verknüpften Glykosylierungsstelle in der Fc-Region darzustellen. Ein mAb mit einer zusätzlichen Leichtketten-N-verknüpften Glykosylierung, ein bispezifischer mAb und ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat (ADC) mAb wurden ebenfalls ausgewählt, um die Anwendungsmöglichkeiten ...

Discussion

mAbScale bietet eine intuitive Benutzeroberfläche mit der Flexibilität, die Bausteine für Massen- und Elementberechnungen zu ändern. Von den Anwendern wird erwartet, dass sie ein grundlegendes Verständnis des Zielmoleküls haben, um die Anwendung zu verwenden, korrekte Massen abzuleiten und die Ergebnisse zu interpretieren. Zum Beispiel kann das intakte oder reduzierte Massenausgabeblatt aufgrund der zahlreichen Reihen intakter oder reduzierter Massen überwältigend sein, da die Standard-Glykandatenbank 88 N-verknüpfte Gly...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquity UPLC-System	Waters Corp., Milford, MA	N/A	Modulares System
Antikörper-Wirkstoff-Konjugat (ADC)	GlaxoSmithKline	N/A	Proprietäres Molekül
BEH 200 SEC Säule	Waters Corp., Milford, MA	176003904
Bispezifisches mAb	GlaxoSmithKline	N/A	Proprietäres Molekül
Byos	Protein Metrics, Cupertino, CA	https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5
GPMAW	GPMAW	http://www.gpmaw.com/
Wasser in LC-MS-Qualität	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	W6-1
mAb Standard	Waters Corp., Milford, MA	186009125	Waters Humanized mAb Mass Check Standard
mAbScale	GlaxoSmithKline	Apache Lizenz, Version 2.0
Xevo G2 Q-TOF Massenspektrometer	Waters Corp., Milford, MA	N/A	Modulares System