Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen

Summary

Diese Technik beschreibt einen effektiven Arbeitsablauf zur Visualisierung und quantitativen Messung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels in HeLa-Zellen mittels fluoreszenzbasierter Live-Bildgebung.

Abstract

Mitochondrien sind dynamische Organellen, die für die metabolische Homöostase entscheidend sind, indem sie die Energieproduktion durch ATP-Synthese steuern. Um den Zellstoffwechsel zu unterstützen, arbeiten verschiedene mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen zusammen, um ein gesundes mitochondriales Netzwerk aufrechtzuerhalten. Ein solcher Weg ist die Mitophagie, bei der die PTEN-induzierte Kinase 1 (PINK1) und die Parkin-Phospho-Ubiquitinierung geschädigter Mitochondrien die Sequestrierung von Autophagosomen und die anschließende Entfernung aus der Zelle durch Lysosomenfusion erleichtern. Mitophagie ist wichtig für die zelluläre Homöostase, und Mutationen in Parkin werden mit der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung gebracht. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein erheblicher Schwerpunkt auf die Untersuchung der mitochondrialen Schädigung und des Umsatzes gelegt, um die molekularen Mechanismen und die Dynamik der mitochondrialen Qualitätskontrolle zu verstehen. In dieser Arbeit wurde die Bildgebung lebender Zellen verwendet, um das mitochondriale Netzwerk von HeLa-Zellen sichtbar zu machen, um das mitochondriale Membranpotenzial und die Superoxidspiegel nach der Behandlung mit Carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), einem mitochondrialen Entkopplungsmittel, zu quantifizieren. Darüber hinaus wurde eine PD-chromosomale Mutation von Parkin (Parkin^T240R) exprimiert, die die Parkin-abhängige Mitophagie hemmt, um zu bestimmen, wie sich die mutierte Expression auf das mitochondriale Netzwerk im Vergleich zu Zellen auswirkt, die Wildtyp-Parkin exprimieren. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt einen einfachen Arbeitsablauf mit fluoreszenzbasierten Ansätzen zur effektiven Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels.

Introduction

Das mitochondriale Netzwerk besteht aus einer Reihe miteinander verbundener Organellen, die eine entscheidende Rolle bei der Energieproduktion¹, der angeborenen Immunität ^2,3 und der zellulären Signalübertragung ^4,5 spielen. Mitochondriale Dysregulation wurde mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung ^gebracht6,7. Parkinson ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die dopaminerge Neuronen der Substantia nigra....

Protocol

1. Vorbereitung biologischer Proben

Anmerkungen: Führen Sie die folgenden Schritte mit steriler Technik in einer Biosicherheitswerkbank durch. Besprühen Sie die Oberfläche des Gehäuses und alle Materialien mit 70% Ethanol.

1. HeLa-Zellkultivierung und -transfektion
   1. Kultur von 30.000 HeLa-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 4,5 g/l Glukose, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % L-Glutaminlösung (HeLa media; siehe Materialtabelle). Die Zellen werden auf 35-mm-Bildgebungsschalen mit Glasboden (sieheMaterialauswahl) mit 2 ml vorgewärmtem HeLa-Medium bes....

Results

In diesem Protokoll wurde die fluoreszenzbasierte Quantifizierung verwendet, um das Membranpotenzial und den Superoxidspiegel des mitochondrialen Netzwerks nach der CCCP-Behandlung zu messen (Abbildung 1). In diesem Workflow wurden HeLa-Zellen verwendet, eine immortalisierte Zelllinie, die aus Gebärmutterhalskrebs gewonnen wurde. HeLa-Zellen werden routinemäßig zur Untersuchung der mitochondrialen Biologie verwendet und sind relativ flach, was es einfach macht, das mitochondriale Netzwerk mi.......

Discussion

Der hier skizzierte Workflow kann verwendet werden, um das mitochondriale Membranpotenzial und die Superoxidkonzentrationen mit Hilfe der fluoreszenzbasierten Bildgebung robust und reproduzierbar zu quantifizieren³⁰. Es gibt wichtige technische Einschränkungen, die bei der Planung dieser Experimente zu berücksichtigen sind. HeLa-Zellen wurden mit einem leeren YFP-Vektor, YFP-Parkin^WT oder YFP-Parkin^T240R, transfiziert. Der leere YFP-Vektor wurde als Kontrolle verwendet, um zu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine
CCCP (Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) mit 4,5 g/L Glukose	Gibco	11-965-084
DMSO, wasserfrei	ThermoFisher Scientific	D12345
Fötales Rinderserum-Hyklon		SH3007103
FuGENE 6 (Transfektionsreagenz)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutaminlösung)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Rot	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep	Red ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher Scientific	31985070
Tetramethylrhodamin, Ethylester, Perchlorat (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Experimentelle Modelle: Organismen/Stämme
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Rekombinante DNA
EYFP Leerer Vektor N	/A	N/A
YFP-Parkin T240R	Diese Arbeit	wurde durch ortsgerichtete Mutagenese aus YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene generiert; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software und Algorithmen
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Tabellenkalkulationssoftware)	Microsoft Office
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistisch) Analysesoftware)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
Other
35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 20 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet	MatTek	P35G-1.5-20-C
Käfig-Inkubator (Klimakammer)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverses Mikroskop	Leica	N/A
LIGHTNING Dekonvolution Software	Leica	N/A
STELLARIS 8 Konfokalmikroskop	Leica	N/A