JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Biology

Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65304
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
,
1Department of Cell Biology,Duke University Medical Center

Summary

Diese Technik beschreibt einen effektiven Arbeitsablauf zur Visualisierung und quantitativen Messung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels in HeLa-Zellen mittels fluoreszenzbasierter Live-Bildgebung.

Abstract

Mitochondrien sind dynamische Organellen, die für die metabolische Homöostase entscheidend sind, indem sie die Energieproduktion durch ATP-Synthese steuern. Um den Zellstoffwechsel zu unterstützen, arbeiten verschiedene mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen zusammen, um ein gesundes mitochondriales Netzwerk aufrechtzuerhalten. Ein solcher Weg ist die Mitophagie, bei der die PTEN-induzierte Kinase 1 (PINK1) und die Parkin-Phospho-Ubiquitinierung geschädigter Mitochondrien die Sequestrierung von Autophagosomen und die anschließende Entfernung aus der Zelle durch Lysosomenfusion erleichtern. Mitophagie ist wichtig für die zelluläre Homöostase, und Mutationen in Parkin werden mit der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung gebracht. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein erheblicher Schwerpunkt auf die Untersuchung der mitochondrialen Schädigung und des Umsatzes gelegt, um die molekularen Mechanismen und die Dynamik der mitochondrialen Qualitätskontrolle zu verstehen. In dieser Arbeit wurde die Bildgebung lebender Zellen verwendet, um das mitochondriale Netzwerk von HeLa-Zellen sichtbar zu machen, um das mitochondriale Membranpotenzial und die Superoxidspiegel nach der Behandlung mit Carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), einem mitochondrialen Entkopplungsmittel, zu quantifizieren. Darüber hinaus wurde eine PD-chromosomale Mutation von Parkin (ParkinT240R) exprimiert, die die Parkin-abhängige Mitophagie hemmt, um zu bestimmen, wie sich die mutierte Expression auf das mitochondriale Netzwerk im Vergleich zu Zellen auswirkt, die Wildtyp-Parkin exprimieren. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt einen einfachen Arbeitsablauf mit fluoreszenzbasierten Ansätzen zur effektiven Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels.

Introduction

Das mitochondriale Netzwerk besteht aus einer Reihe miteinander verbundener Organellen, die eine entscheidende Rolle bei der Energieproduktion1, der angeborenen Immunität 2,3 und der zellulären Signalübertragung 4,5 spielen. Mitochondriale Dysregulation wurde mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung gebracht6,7. Parkinson ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die dopaminerge Neuronen der Substantia nigra betrifft und von der weltweit fast 10 Millionen Menschen betroffen sind8. Parkinson wurde genetisch mit der Mitophagie in Verbindung gebracht, einem mitochondrialen Qualitätskontrollweg, der für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase notwendig ist und beschädigte Mitochondrien selektiv entfernt 9,10. Studien haben mehrere unabhängige Mitophagie-Signalwege identifiziert, darunter die FUN14-Domäne mit 1 (FUNDC1)-vermittelter Mitophagie, die Bcl-2-interagierende Protein 3 (BNIP3)-geförderte Mitophagie, die NIX-abhängige Mitophagie und die gut charakterisierte PTEN-induzierte Kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulierte Mitophagie10,11. PINK1 (eine mutmaßliche Kinase) und Parkin (eine E3-Ubiquitin-Ligase) arbeiten zusammen, um geschädigte Mitochondrien mit Phospho-Ubiquitinat zu versorgen, was die Bildung von Autophagosomen antreibt, die die beschädigte Organelle umhüllen und mit Lysosomen verschmelzen, um den Abbau einzuleiten 12,13,14,15,16. Mutationen bei Parkin wurden mit Parkinson-assoziierten Phänotypen wie Neurodegeneration über den Verlust dopaminerger Neuronen in Verbindung gebracht17,18.

Hier wird ein Protokoll beschrieben, in dem HeLa-Zellen, routinemäßig verwendete immortalisierte Zellen aus Gebärmutterhalskrebs, verwendet werden, um die Rolle von Parkin bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks zu untersuchen. HeLa-Zellen exprimieren vernachlässigbare Mengen an endogenem Parkin und benötigen daher eine exogene Parkin-Expression19. Um die Rolle von Parkin für die Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks zu untersuchen, werden HeLa-Zellen entweder mit Wildtyp-Parkin (ParkinWT), einer Parkin-Mutante (ParkinT240R) oder einem leeren Kontrollvektor transfiziert. ParkinT240R ist eine autosomal-rezessiv vererbte juvenile Parkinsonismus-Mutation, die die Aktivität der Parkin-E3-Ligase beeinträchtigt und die Effizienz des Mitophagie-Signalwegssignifikant verringert 20. HeLa-Zellen unterliegen milden (5 μM) oder schweren (20 μM) Konzentrationen von Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP), einem mitochondrialen Entkopplungsmittel. Die Behandlung mit schweren Konzentrationen von CCCP wird routinemäßig eingesetzt, um Parkin-vermittelte Mitophagie in verschiedenen Zelllinien, wie z. B. HeLa- und COS-7-Zellen, zu induzieren21,22,23.

Nach der Behandlung verwendet das Protokoll eine Live-Bildgebung des mitochondrialen Netzwerks unter Verwendung von zwei derzeit verfügbaren mitochondrialen Fluoreszenzfarbstoffen. Tetramethylrhodamin, Ethylester, Perchlorat (TMRE) ist ein kationischer Farbstoff, der auf der Grundlage des mitochondrialen Membranpotentials24 fluoresziert, während MitoSOX ein mitochondrialer Superoxidindikator ist, bei dem die Fluoreszenzintensität eine Funktion der Superoxidkonzentrationist 25. Schließlich verwendet das skizzierte Protokoll eine fluoreszenzbasierte Quantifizierung und einen einfachen Arbeitsablauf, um das mitochondriale Membranpotenzial und den Superoxidgehalt mit minimalem Spielraum für Benutzerverzerrungen effektiv zu quantifizieren. Obwohl dieses Protokoll entwickelt wurde, um die mitochondriale Funktion in HeLa-Zellen zu untersuchen, kann es für weitere Zelllinien und primäre Zelltypen angepasst werden, um die Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks quantitativ zu charakterisieren.

Protocol

1. Vorbereitung biologischer Proben

Anmerkungen: Führen Sie die folgenden Schritte mit steriler Technik in einer Biosicherheitswerkbank durch. Besprühen Sie die Oberfläche des Gehäuses und alle Materialien mit 70% Ethanol.

  1. HeLa-Zellkultivierung und -transfektion
    1. Kultur von 30.000 HeLa-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 4,5 g/l Glukose, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % L-Glutaminlösung (HeLa media; siehe Materialtabelle). Die Zellen werden auf 35-mm-Bildgebungsschalen mit Glasboden (sieheMaterialauswahl) mit 2 ml vorgewärmtem HeLa-Medium beschichtet. Halten Sie die HeLa-Kulturen bei 5% CO2 und 37 °C26,27.
    2. Untersuchen Sie am Tag nach dem Plattieren die 35-mm-Bildgebungsschalen mit einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen zu ~50%-60% konfluieren. Sobald die HeLa-Zellen konfluent sind, transfizieren Sie die HeLa-Zellen mit dem Vektor des leeren gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), YFP-ParkinWT oder YFP-ParkinT240R (Abbildung 1A).
    3. Bereiten Sie für jede Transfektion zwei separate Mischungen in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen vor. Mischen Sie, indem Sie auf das Röhrchen klopfen oder vorsichtig auf und ab pipettieren.
      1. Mischen Sie in Röhrchen 1 200 μl reduziertes Serummedium (siehe Materialtabelle) mit 2 μg der Plasmid-DNA.
      2. Mischen Sie in Röhrchen 2 200 μl reduziertes Serummedium mit 6 μl Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle)28.
    4. Inkubieren Sie die Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Röhrchen 2 zu Röhrchen 1 geben, durch Auf- und Abpipettieren mischen und 20 Minuten bei RT inkubieren.
    5. Geben Sie die Transfektionskomplexe tropfenweise in die vorhandenen Bildgebungsschalen mit den HeLa-Zellkulturen, um eine gleichmäßige Verteilung über die gesamte Schale zu gewährleisten. Stellen Sie die Bildgebungsschalen über Nacht in den 5% CO2 und 37 °C heißen Inkubator.
      Anmerkungen: Beschriften Sie jede Schale mit dem entsprechenden transfizierten Plasmid. Beschriften Sie für jedes Experiment die drei YFP-Parkin-WT-Schalen (Dimethylsulfoxid [DMSO; siehe Materialtabelle], 5 μM CCCP und 20 μM CCCP). Wiederholen Sie die Beschriftung mit den drei YFP-ParkinT240R-Schalen und den drei leeren YFP-Vektorschalen.
  2. Herstellung von CCCP und Fluoreszenzfarbstoffen
    ACHTUNG: Fluoreszenzfarbstoffe sind oft lichtempfindlich. Lagern Sie die Farbstoffe im Dunkeln mit Aluminiumfolie oder braunen Zentrifugenröhrchen, um die Lichteinwirkung zu reduzieren.
    1. Stellen Sie einen 5 mM Arbeitsvorrat CCCP (siehe Materialtabelle) her, indem Sie 5 mg CCCP in 4,89 ml DMSO auflösen. Stellen Sie einen 20 mM Arbeitsvorrat CCCP her, indem Sie 5 mg CCCP in 1,22 ml DMSO auflösen.
    2. Verdünnen Sie 10 μl einer 1 mM MitoTracker Deep Red (siehe Materialtabelle) Stammlösung in 390 μl DMSO, um einen 25 μM Arbeitsstoff herzustellen.
    3. Lösen Sie 50 μg MitoSOX Red25 (siehe Materialtabelle) in 13 μl DMSO auf, um einen 5 mM Arbeitsstoff zu erhalten.
    4. Lösen Sie 10 mg TMRE24 (siehe Materialtabelle) in 19,4 ml DMSO auf, um eine 1 mM Stammlösung herzustellen. Verdünnen Sie die TMRE, indem Sie 10 μl 1 mM TMRE in 990 μl DMSO geben, um einen 10 μM Arbeitsstoff herzustellen.

2. CCCP-Behandlung und mitochondriale Markierung mit Fluoreszenzsonden in HeLa-Zellen

VORSICHT: Führen Sie die folgenden Schritte schnell durch, um sicherzustellen, dass die HeLa-Zellen nicht für längere Zeit aus dem Inkubator herausgenommen werden.

  1. Am Tag nach der Transfektion werden 2 μl 5 oder 20 mM CCCP (Endkonzentration: 5 μM bzw. 20 μM) auf jede Versuchsplatte gegeben. Fügen Sie bei Kontrollplatten 2 μl DMSO hinzu. Legen Sie die Platten für 1,5 h in den Inkubator mit 5 % CO2 und 37 °C zurück (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Die CCCP-Behandlung dauert insgesamt 2 Stunden. Die Mitochondrien werden jedoch während der letzten 30 Minuten der CCCP-Behandlung mit fluoreszierenden Sonden markiert.
  2. Nach 1,5 h nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und geben Sie Fluoreszenzsonden in die Bildgebungsschalen. Legen Sie die Platten für 30 Minuten in den Inkubator mit 5 % CO2 und 37 °C zurück (Abbildung 1A).
    1. TMRE-Experiment: 2 μl 25 μM MitoTracker (Endkonzentration: 25 nM) und 2 μl 10 μM TMRE (Endkonzentration: 10 nM) zugeben.
    2. MitoSOX-Experiment: 2 μl 25 μM MitoTracker (Endkonzentration: 25 nM) und 1 μl 5 mM MitoSOX (Endkonzentration: 2,5 μM) hinzufügen.
  3. Nach der 2-stündigen CCCP-Behandlung bereiten Sie die HeLa-Zellen für die Bildgebung vor (Abbildung 1A,B).
    1. TMRE-Experiment: HeLa-Zellen sind sofort bildbereit; sicherstellen, dass die TMRE in den HeLa-Zellkulturmedien verbleibt.
    2. MitoSOX-Experiment: Waschen Sie die Zellen 3x mit 2 ml vorgewärmtem HeLa-Medium, um den freien MitoSOX-Farbstoff zu entfernen. Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes Medium hinzu. Die HeLa-Zellen sind nun bereit für die Aufnahme.
      HINWEIS: Waschen Sie die HeLa-Zellen mit frischem, vorgewärmtem HeLa-Medium, das die gleiche DMSO- oder CCCP-Konzentration wie die Versuchsbedingung enthält. enthalten nicht MitoSOX oder MitoTracker.

3. Aufbau der konfokalen Mikroskop-Bildaufnahme

HINWEIS: Bilden Sie die HeLa-Zellen mit einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) ab, das mit einem Ölimmersionsobjektiv mit 63x/1,40 numerischer Apertur (NA) und einer Klimakammer (siehe Materialtabelle) ausgestattet ist.

  1. Schalten Sie 1 h vor der Aufnahme das CO2 ein, indem Sie das Tankventil öffnen. Drücken Sie die Ein-Taste, um den Umgebungsregler für das Mikroskop einzuschalten. Mit den Pfeiltasten nach oben und unten auf dem Touchpad stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und den CO2 auf 5% ein. Drücken Sie auf Einstellen, wenn Sie fertig sind.
    Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Türen zur Klimakammer geschlossen sind, und warten Sie, bis sich die Bedingungen stabilisiert haben.
  2. Laser-Einstellungen
    1. Schalten Sie den Weißlichtlaser (WLL) ein und stellen Sie die Laserleistung auf 85 % und die Anregungssteuerung auf maximale Leistung ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Erfassen , wählen Sie Laser hinzufügen aus, und schalten Sie im angezeigten Dialogfeld die WLL auf Ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Laserleistung und geben Sie 85 % ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erregersteuerung und wählen Sie Maximale Leistung aus dem Dropdown-Menü (Abbildung 2A).
    2. TMRE-Experiment: Stellen Sie die Anregungs- und Emissionsspektren für YFP, MitoTracker und TMRE ein.
      1. Stellen Sie für YFP den Anregungslaser auf 514 nm und das Emissionsspektrenfenster auf 524-545 nm ein. Klicken Sie auf der Registerkarte “Erfassen” auf die Schaltfläche “Neue Einstellung hinzufügen“. Klicken Sie dann auf Laser hinzufügen und ziehen Sie ihn in Einstellung 1. Doppelklicken Sie auf die Anregungslinie und geben Sie im Dialogfeld 514 als Wellenlänge ein. Doppelklicken Sie auf den entsprechenden Detektor und geben Sie 524 für die Anfangs- und 545 für die Endwellenlänge ein.
      2. Stellen Sie für MitoTracker Deep Red den Anregungslaser auf 641 und das Emissionsspektrenfenster auf 650-750 nm ein. Klicken Sie auf der Registerkarte “Erfassen” auf die Schaltfläche “Laser hinzufügen” und ziehen Sie sie in Einstellung 1. Doppelklicken Sie auf die Anregungslinie und geben Sie im Dialogfeld 641 als Wellenlänge ein. Doppelklicken Sie auf den entsprechenden Detektor und geben Sie 650 für die Anfangs- und 750 für die Endwellenlänge ein.
      3. Stellen Sie für TMRE den Anregungslaser auf 555 nm und das Emissionsspektrenfenster auf 557-643 nm ein. Klicken Sie auf der Registerkarte “Erfassen” auf die Schaltfläche “Neue Einstellung hinzufügen“. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Laser hinzufügen und ziehen Sie ihn in Einstellung 2. Doppelklicken Sie auf die Anregungslinie und geben Sie im Dialogfeld 555 als Wellenlänge ein. Doppelklicken Sie auf den entsprechenden Detektor und geben Sie 557 für die Anfangs- und 643 für die Endwellenlänge ein.
    3. MitoSOX-Experiment: Stellen Sie die Anregungs- und Emissionsspektren für YFP, MitoTracker und MitoSOX ein (Abbildung 2B).
      1. Stellen Sie für YFP den Anregungslaser auf 507 nm und das Emissionsspektrenfenster auf 517-540 nm ein. Klicken Sie auf der Registerkarte “Erfassen” auf die Schaltfläche “Neue Einstellung hinzufügen“. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Laser hinzufügen und ziehen Sie ihn in Einstellung 1. Doppelklicken Sie auf die Anregungslinie und geben Sie im Dialogfeld 507 als Wellenlänge ein. Doppelklicken Sie auf den entsprechenden Detektor und geben Sie 517 für die Anfangs- und 540 für die Endwellenlänge ein.
      2. Für MitoSOX stellen Sie den Anregungslaser auf 547 nm und das Emissionsspektrenfenster auf 564-636 nm ein. Klicken Sie auf der Registerkarte ” Erfassen ” auf die Schaltfläche “Neue Einstellung hinzufügen “. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Laser hinzufügen und ziehen Sie ihn in Einstellung 2. Doppelklicken Sie auf die Anregungslinie und geben Sie im Dialogfeld 547 als Wellenlänge ein. Doppelklicken Sie auf den entsprechenden Detektor und geben Sie 564 für die Anfangs- und 636 für die Endwellenlänge ein.
      3. Stellen Sie für MitoTracker Deep Red den Anregungslaser auf 641 nm und das Emissionsspektrenfenster auf 652-742 nm ein. Klicken Sie auf der Registerkarte “Erfassen” auf die Schaltfläche “Neue Einstellung hinzufügen“. Klicken Sie auf die Schaltfläche Laser hinzufügen und ziehen Sie ihn in Einstellung 3. Doppelklicken Sie auf die Anregungslinie und geben Sie im Dialogfeld 641 als Wellenlänge ein. Doppelklicken Sie auf den entsprechenden Detektor und geben Sie 652 für die Anfangs- und 742 für die Endwellenlänge ein.
  3. Einstellungen für die Bildaufnahme (Abbildung 2C)
    1. Stellen Sie das Format auf 1.024 x 1.024, die Scangeschwindigkeit auf 600 Hz und den Zeilendurchschnitt auf 3 ein.
      1. Wählen Sie die Registerkarte ” Erfassung” und klicken Sie auf die Schaltfläche “Format “. Wählen Sie im Dropdown-Menü 1.024 x 1.024 aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Geschwindigkeit und wählen Sie 600 aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Liniendurchschnitt und wählen Sie im Dropdown-Menü die Option 3 aus.
      2. Schalten Sie das bidirektionale Scannen ein und stellen Sie den Phasen- und Zoomfaktor auf 22,61 bzw. 1,50 ein.
        1. Schalten Sie auf der Registerkarte ” Erfassung” die Schaltfläche ” Bidirektional ” auf ” Ein” um. Klicken Sie auf die Einstellung Phase X und stellen Sie sie auf 22,61 ein. Klicken Sie auf die Einstellung Zoomfaktor und stellen Sie sie auf 1,50 ein.

4. Bildaufnahme

VORSICHT: Der Experimentator muss ein visuelles Urteil fällen, um die Zellen basierend auf dem YFP-Fluoreszenzsignal auszuwählen. Vermeiden Sie übersättigte Pixel, da diese die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität erheblich beeinflussen können. Verwenden Sie eine Über/Unter-Lookup-Tabelle, die die Pixelsättigung angibt, um zu vermeiden, dass gesättigte Bilder erfasst werden.

  1. Klicken Sie auf die gewünschte Einstellung und drücken Sie auf Fast Live, um eine Live-Vorschau des Fluoreszenzbildes anzuzeigen.
  2. Stellen Sie die Verstärkung und Intensität durch Doppelklick auf den entsprechenden Detektor ein. Passen Sie im angezeigten Dialogfeld die Verstärkung mit dem Schieberegler an. Um die Intensität zu ändern, doppelklicken Sie auf die Anregungslinie und verwenden Sie die Aufwärts – und Abwärtspfeile im Popup-Fenster , um die Intensität zu ändern. Klicken Sie auf Stopp , um die Vorschau zu beenden.
    1. TMRE-Experiment: Stellen Sie zuerst die DMSO-Steuerplatte dar. Stellen Sie die Verstärkung und Intensität des TMRE-Signals (Einstellung 2) so ein, dass die Intensität des mitochondrialen Netzwerks knapp unter der Sättigung liegt. Halten Sie die Verstärkung und Intensität für das Experiment konstant. Stellen Sie die Verstärkung und Intensität des MitoTrackers und des YFP (Einstellung 1) so ein, dass das mitochondriale Netzwerk sichtbar, aber schwach ist.
    2. MitoSOX-Experiment: Bilden Sie zuerst die DMSO-Steuerplatte ab. Stellen Sie die Verstärkung und Intensität des MitoSOX-Signals (Einstellung 2) so ein, dass die Fluoreszenz sichtbar, aber schwach ist. Halten Sie die Verstärkung und Intensität für das Experiment konstant. Stellen Sie die Verstärkung und Intensität von YFP (Einstellung 1) und MitoTracker (Einstellung 3) so ein, dass das mitochondriale Netzwerk sichtbar, aber dunkel ist.
      HINWEIS: Notieren Sie die Verstärkung und Intensität von TMRE und MitoSOX, da diese Werte während des gesamten Experiments konstant bleiben müssen. Die Fluoreszenzsignale von YFP und MitoTracker werden in diesem Protokoll nicht quantifiziert. Daher können die Verstärkung und Intensität für jedes Bild angepasst werden. Es ist am effektivsten, die Verstärkungs- und Intensitätseinstellungen so einzustellen, dass die Zellen leicht zu sehen, aber immer noch dunkel sind, um sicherzustellen, dass die Zellen keinen übermäßigen Laserintensitäten ausgesetzt sind, die Zellschäden oder Photobleichung verursachen.
  3. Sobald die Einstellungen für Verstärkung und Intensität abgeschlossen sind, klicken Sie auf Start , um ein Bild aufzunehmen. Erfassen Sie Bilder von 20 Zellen pro Versuchsbedingung (z. B. fünf Bilder mit vier Zellen pro Bild; Abbildung 2D).

5. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität mit ImageJ

HINWEIS: Imaging-Dateien werden als “.lif” gespeichert und sind mit ImageJ29 kompatibel. Kompatible Dateitypen mit ImageJ sind auf ihrer Website angegeben. Es kann notwendig sein, den Dateityp zu konvertieren, wenn er nicht kompatibel ist.

  1. Erstellen und speichern Sie einen Interessenbereich (ROI).
    1. Klicken Sie in ImageJ auf Datei | Neu | Bild. Klicken Sie im angezeigten Dialogfeld auf OK.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckwerkzeug und zeichnen Sie einen 6 Mikron x 6 Mikron großen Quader. Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager, und warten Sie, bis ein Dialogfeld mit dem ROI-Manager angezeigt wird (Abbildung 3A). Fügen Sie dem Manager den rechteckigen ROI hinzu, indem Sie im Dialogfeld “Manager” auf “Hinzufügen” klicken. Speichern Sie den ROI, indem Sie Mehr auswählen, dann auf die Schaltfläche Speichern und dann auf OK klicken.
  2. Messen Sie die Fluoreszenzintensität.
    1. Klicken Sie in Bild J auf Datei und wählen Sie Öffnen aus. Wählen Sie im Dialogfeld die Imaging-Dateien für das Experiment aus, und klicken Sie auf Öffnen.
    2. Warten Sie, bis das Fenster Importoptionen für Bioformate angezeigt wird (Abbildung 3B). Wählen Sie “Kanäle teilen ” und klicken Sie auf “Öffnen“.
      HINWEIS: Mit der Funktion “Kanäle teilen” kann jeder Kanal im Bild als separates Fenster geöffnet werden. Die Kanalreihenfolge entspricht der Beschaffungsreihenfolge.
      1. TMRE-Experimente : YFP (Einstellung 1) ist der erste Kanal (c = 0); MitoTracker (Einstellung 1) ist der zweite Kanal (c = 1); und TMRE (Einstellung 2) ist der dritte Kanal (c = 2).
      2. MitoSOX-Experimente : YFP (Einstellung 1) ist der erste Kanal (c = 0); MitoSOX (Einstellung 2) ist der zweite Kanal (c = 1); und MitoTracker (Einstellung 3) ist der dritte Kanal (c = 2).
    3. Passen Sie die Helligkeit an, indem Sie Bild | Anpassen | Helligkeit (Abbildung 3C).
      HINWEIS: Drücken Sie nicht auf “Einstellen” oder “Anwenden“, um sicherzustellen, dass die Bildhelligkeit nicht dauerhaft geändert wird. Gelegentlich ist die Fluoreszenzintensität in den TMRE- oder MitoSOX-Kanälen nicht sichtbar. Passen Sie die Helligkeit an, um eine einfachere Visualisierung zu ermöglichen. Das Ändern der Helligkeit hat keinen Einfluss auf die rohen Fluoreszenzintensitätswerte.
    4. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Messungen festlegen aus. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Fläche und Mittelwert für Grauwert, und klicken Sie auf OK (Abbildung 3D).
      HINWEIS: Der mittlere Grauwert ist die Fluoreszenzintensität.
    5. Öffnen Sie den ROI-Manager und laden Sie den in Schritt 5.1 gespeicherten ROI, indem Sie auf Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager. Klicken Sie im ROI-Manager in der angezeigten Liste auf Mehr und dann auf Öffnen, und wählen Sie den gespeicherten ROI aus.
    6. Messen Sie die Fluoreszenzintensität von fünf zufälligen Regionen in einer einzelnen Zelle, indem Sie den gespeicherten ROI aus dem ROI-Manager auswählen und den ROI an eine zufällige Stelle innerhalb einer Zelle verschieben (Abbildung 3E). Messen Sie die Fluoreszenzintensität, indem Sie M drücken. Wiederholen Sie diesen Schritt mit vier zusätzlichen, nicht überlappenden Bereichen. Wenn ein Dialogfeld mit den Flächen- und mittleren Grauwerten angezeigt wird (Abbildung 3F), kopieren Sie die Werte und fügen Sie sie zur Analyse in eine Tabelle ein.
      1. TMRE-Experiment : Bild auswählen (c = 2).
      2. MitoSOX-Experiment : Bild auswählen (c = 2).
    7. Ermitteln Sie die mittleren Werte für die Fluoreszenzintensität. Verwenden Sie ein Tabellenkalkulationsprogramm (siehe Materialtabelle) und mitteln Sie die fünf mittleren Grauwerte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zelle.
    8. Analysieren und vergleichen Sie die mittleren Grauwerte von TMRE oder MitoSOX unter verschiedenen Versuchsbedingungen mit einem statistischen Softwareprogramm (siehe Materialtabelle; Abbildung 4 und Abbildung 5). Präsentieren Sie Daten als Balkendiagramme oder Geigendiagramme.

Representative Results

Discussion

Der hier skizzierte Workflow kann verwendet werden, um das mitochondriale Membranpotenzial und die Superoxidkonzentrationen mit Hilfe der fluoreszenzbasierten Bildgebung robust und reproduzierbar zu quantifizieren30. Es gibt wichtige technische Einschränkungen, die bei der Planung dieser Experimente zu berücksichtigen sind. HeLa-Zellen wurden mit einem leeren YFP-Vektor, YFP-ParkinWT oder YFP-ParkinT240R, transfiziert. Der leere YFP-Vektor wurde als Kontrolle verwendet, um zu bestätigen, dass die experimentellen Befunde spezifisch für Parkin waren. Für die transiente Transfektion wurde experimentell ein Massenverhältnis von 1:3 für DNA zu Transfektionsreagenz bestimmt, um die höchste Transfektionsrate zu erzielen, wobei 2 μg Plasmid-DNA für jedes Konstrukt28 verwendet wurden. Es war wichtig, den YFP-Tag für alle Konstrukte konsistent zu halten, da sich fluoreszierende Proteine in ihrer angeborenen Helligkeit unterscheiden31,32. Wenn mehrere fluoreszierende Proteinmarkierungen verwendet werden müssen, sollten fluoreszierende Proteine mit ähnlicher Helligkeit und Photostabilität ausgewählt werden33.

Zur Messung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidgehalts wurden zwei gut dokumentierte Farbstoffe ausgewählt. Das Fluoreszenzsignal von TMRE basiert auf dem mitochondrialen Membranpotential, während die MitoSOX-Fluoreszenzintensität eine Funktion des Superoxidspiegels ist. Für die fluoreszenzbasierte Bildgebung sollte es keine spektrale Überlappung zwischen den Fluoreszenzsonden geben. Das ursprüngliche Protokoll wurde jedoch mit mCherry-ParkinWT und mCherry-ParkinT240R durchgeführt, die sich mit den rotverschobenen Spektren von TMRE und MitoSOX überschnitten. Um spektrale Überlappungen zu vermeiden und potentielles Übersprechen zu minimieren, wurden YFP-markierte Parkin-Konstrukte ausgewählt. Diese Anpassung erforderte eine Änderung des MitoTracker-Farbstoffs von grün auf dunkelrot. Darüber hinaus wurde die Dichte der HeLa-Zellbeschichtung optimiert; Anfangs wurden HeLa-Zellen mit 45.000 Zellen pro Bildgebungsschale plattiert, was jedoch zu überkonfluierenden Schalen führte. Eine hohe Zellkonfluenz kann die Transfektionseffizienz verringern, den Zelltod fördern und den Zellstoffwechsel verändern34,35,36. Um diese möglichen Auswirkungen zu vermeiden, wurden die Zellen mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro bildgebender Schale plattiert.

Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist das Potenzial für Benutzerverzerrungen, insbesondere bei der Auswahl von Zellen und ROI-Standorten. Das Protokoll verwendet Änderungen der TMRE- und MitoSOX-Fluoreszenzintensitäten als funktionelle Anzeige für das Membranpotenzial und den Superoxidgehalt. Daher könnte die Zellselektion mit diesen Sonden möglicherweise die experimentellen Ergebnisse verzerren. Um dieser Verzerrung entgegenzuwirken, wählten wir Zellen aus, die ausschließlich auf der YFP-Expression basierten. Nicht überlappende ROIs wurden nach dem Zufallsprinzip über das mitochondriale Netzwerk innerhalb der Zelle ausgewählt. Obwohl diese Methode bisher zur Messung der Fluoreszenzintensität27 verwendet wurde, konnten zusätzliche Maßnahmen zur Reduzierung von Verzerrungen ergriffen werden. Erstens könnte die Studie mit den Blindanalyse-Tools in ImageJ verblindet werden, um eine ROI-Auswahl zu verhindern, die die erwarteten Ergebnisse unterstützt. Zweitens könnten die Fluoreszenzintensitäten mit einer fortschrittlichen Bildanalysesoftware gemessen werden, die ROIs überflüssig macht.

Während dieses Protokoll die konfokale Mikroskopie zur fluoreszenzbasierten Quantifizierung verwendet, könnten zusätzliche Methoden, wie z. B. die Durchflusszytometrie, zur Quantifizierung von Fluoreszenzänderungen in TMRE und MitoSOX37 verwendet werden. Hier haben wir die konfokale Mikroskopie anstelle der Durchflusszytometrie verwendet, um die Morphologie des mitochondrialen Netzwerks sichtbar zu machen. Das skizzierte Protokoll könnte leicht angepasst werden, um TMRE- und MitoSOX-Fluoreszenz mit Durchflusszytometrie zu messen, was zu ähnlichen experimentellen Ergebnissen führt. Darüber hinaus könnten Sauerstoffverbrauchsraten-Assays (OCR) verwendet werden, um Veränderungen in der Funktion der mitochondrialen Elektronentransportkette ohne kationische Farbstoffe zu erkennen. Während die OCR ein empfindliches Maß für die mitochondriale Dysfunktion liefert, ist sie nicht spezifisch für das Membranpotenzial oder die Superoxidkonzentration, sondern liefert stattdessen ein globales Maß für die mitochondriale Funktion38. Diese Assays könnten in Verbindung mit TMRE- und MitoSOX-Experimenten durchgeführt werden, um die Gesundheit der Mitochondrien zu beurteilen39.

Obwohl sich dieses Protokoll speziell auf die Wirkung des mitochondrialen Entkopplers CCCP40 konzentriert, könnten schädliche Reagenzien mit alternativen Mechanismen verwendet werden. Zum Beispiel sind Antimycin A und Oligomycin A Elektronentransportketteninhibitoren, die üblicherweise verwendet werden, um mitochondriale Schäden durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zu induzieren38. Während wir speziell den mitochondrialen Superoxidspiegel mit MitoSOX gemessen haben, konnte intrazelluläres ROS mit CellROX gemessen werden. In HeLa-Zellen war es aufgrund der geringen endogenen Expression notwendig, Parkin zu überexprimieren. Zukünftige Studien könnten die Auswirkungen der Parkin-Expression auf die Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks mit Hilfe von Zellkultursystemen beobachten, die endogenes Parkin41 exprimieren. Da Mitochondrien wichtige Regulatoren des Energiestoffwechsels und der zellulären Homöostase sind, wird die mitochondriale Dysfunktion mit zahlreichen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Diabetes42, Alzheimer 43,44,45, Krebs 46 und Lebererkrankungen 47. Daher könnte dieser Workflow angepasst werden, um die Gesundheit und Dysregulation der Mitochondrien in relevanten Zelllinien und Primärkulturen zu untersuchen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

<strong>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</strong>
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&nbsp;Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&nbsp;Gibco&nbsp;35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX&nbsp; Red&nbsp;ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&nbsp;ThermoFisher ScientificT669
<strong>Experimental models: Organisms/Strains</strong>
HeLa-M (<em>Homo sapiens</em>)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
<strong>Recombinant DNA</strong>
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
<strong>Software and Algorithms</strong>
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office&nbsp;https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
<strong>Other</strong>
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson’s disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson’s Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson’s disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson’s disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Tags

Fluorescence-based QuantificationMitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive ImagingHeLa CellsNeurodegenerative DiseasesMitochondrial DysregulationParkinson’s DiseaseALSSuper Resolution MicroscopySTEDSIMExpansion MicroscopyProtein DistributionMitochondrial TurnoverReactive Oxygen SpeciesMitochondrial Quality Control PathwaysMitophagyParkin MutationCellular Homeostasis
Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image