Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten

Summary

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Abstract

Gewebespezifische neurale Stammzellen (NSCs) bleiben im postnatalen Gehirn von Säugetieren aktiv. Sie befinden sich in spezialisierten Nischen, wo sie neue Neuronen und Gliazellen erzeugen. Eine solche Nische ist die subependymale Zone (SEZ; auch ventrikulär-subventrikuläre Zone genannt), die sich quer über die lateralen Wände der lateralen Ventrikel neben der ependymalen Zellschicht befindet. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind reichlich im zentralen Nervensystem verteilt und bilden einen Pool proliferativer Vorläuferzellen, die Oligodendrozyten erzeugen können.

Sowohl NSCs als auch OPCs weisen ein Selbsterneuerungspotenzial und Ruhe-/Aktivierungszyklen auf. Aufgrund ihrer Lage erfolgt die Isolierung und experimentelle Untersuchung dieser Zellen postmortal. Hier beschreiben wir ausführlich das "Brain Milking", eine Methode zur Isolierung von NSCs und OPCs, unter anderem von Zellen, aus lebenden Tieren. Dabei handelt es sich um ein zweistufiges Protokoll, das für den Einsatz bei Nagetieren entwickelt und an Ratten getestet wurde. Zunächst werden die Zellen durch stereotaktische intrazerebroventrikuläre (i.c.v.) Injektion eines "Freisetzungscocktails" aus dem Gewebe "freigesetzt". Die Hauptbestandteile sind die Neuraminidase, die auf Ependymzellen abzielt und die Denudation der Ventrikelwand induziert, ein Integrin-β1-blockierender Antikörper und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2. In einem zweiten Schritt der "Entnahme" werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis aus der Cisterna magna durchgeführt, bei anästhesierten Ratten, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass isolierte Zellen ihr endogenes Profil beibehalten und dass NSCs der Sonderwirtschaftszone ihre Ruhe bewahren. Die Denudation der Ependymschicht ist auf die anatomische Ebene der Injektion beschränkt und das Protokoll (Freisetzung und Entnahme) wird von den Tieren gut vertragen. Dieser neuartige Ansatz ebnet den Weg für die Durchführung von Längsschnittstudien zur endogenen Neurogenese und Gliogenese bei Versuchstieren.

Introduction

Gewebespezifische Stammzellen sind teilweise gebundene Zellen, aus denen alle Zellpopulationen hervorgehen können, aus denen die jeweiligen Gewebe bestehen. Abgesehen davon, dass sie multipotent sind, sind sie selbsterneuernde Zellen und entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Regenerationsfähigkeit von Geweben¹. Einige gewebespezifische Stammzellen verbleiben in einem aktiven, stark proliferativen Zustand, wie z. B. intestinale oder hämatopoetische Stammzellen. Andere, wie z. B. Hirnstammzellen, bleiben weitgehend ruhend oder ruhend². Im erwachsenen Gehirn befinden sich neurale Stammzellen (NSCs) in spezialisierten Bereichen, die oft als Nischen bezeichnet werden. Zwei solcher gut beschriebenen Bereiche existieren in der subependymalen Zone (SEZ) der Seitenventrikel und im Gyrus dentatus des Hippocampus. Die SWZ-Nische erzeugt die höchste Anzahl von Zellen, vor allem Neuroblasten, die in Richtung der Riechkolben wandern und zur lokalen Interneuronenpopulation beitragen; Im Gegensatz dazu wandern generierte Oligodendroblasten in das benachbarte Corpus callosum (CC)³. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind mitotisch aktive Zellen, die weit über das zentrale Nervensystem verteilt sind und die: i) an die oligodendrogliale Linie gebunden sind, ii) zu Demyelinisierungsstellen wandern können und iii) sich zu myelinisierenden Oligodendrozyten differenzieren können. OPCs weisen auch ein Selbsterneuerungspotenzial und eine Ruhephase^{auf 4}.

Bisher erforderte die Isolierung und Untersuchung von NSCs und OPCs eine postmortale Dissoziation des präparierten Hirn- und Rückenmarksgewebes. Um diese experimentelle Einschränkung zu umgehen, haben wir eine Methode entwickelt, die es zum ersten Mal ermöglicht, NSCs und OPCs im Gehirn aus lebenden Tieren zu isolieren. Wir nennen diese Methode "Melken", weil sie mehrere Ansammlungen von Zellen ermöglicht, da ihre Pools nicht erschöpft sind. Das Protokoll wurde aufgrund ihrer großen Gehirngröße an Ratten entwickelt und zielt hauptsächlich auf die SEZ oder das CC ab und umfasst zwei Hauptschritte. Zunächst werden NSCs oder OPCs durch i.c.v.-Injektion eines "Freisetzungscocktails" aus dem Gewebe "entfernt", der Neuraminidase, ein Toxin, das die Ventrikelwanddenudation induziert, einen Integrin-β1-blockierenden Antikörper und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) enthält. Der Cocktail wird stereopädisch beidseitig in die Seitenventrikel injiziert. Wenn die beabsichtigte Verwendung die Isolierung von NSCs ist, werden rostrale Bereiche der lateralen Ventrikel anvisiert. Geht es darum, OPCs reiner zu isolieren, wird der Cocktail kaudal in den Bereich der hippocampalen Fimbrien injiziert. In einem zweiten Schritt der "Entnahme" werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus der Cisterna magna von anästhesierten Ratten durchgeführt, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist. Die Flüssigbiopsie wird mit NSC-Nährmedium gemischt und kann bis zum Anrichten bei 4 °C aufbewahrt werden.

Protocol

Die Zucht-, Pflege- und Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt, der vom Innenministerium genehmigt wurde, und mit dem Präsidialdekret 56/2013 der Hellenischen Republik, das von den Tierschutz- und Ethikprüfungsgremien der Universitäten Cambridge und Patras sowie vom örtlichen Präfekturausschuss für Tierpflege und -verwendung genehmigt und geprüft wurde (Protokollnummer: 5675/39/18-01-2021). Es wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-, Wistar- und Long-Evans-Ratten mit einem Alter zwischen 2 und 4 Monaten und einem Körpergewicht zwischen 150 g und 250 g verwendet. Das Protokoll ist in Abbildung 1 grafisch zusammengefasst.

1. Zubereitung des Cocktails freisetzen

HINWEIS: Am Tag des Eingriffs frisch zubereiten und auf Eis aufbewahren. Die Mengen werden pro 2 μl verabreicht, die i.c.v. in jeden Seitenventrikel injiziert werden. Bereiten Sie zusätzlich 1 μl pro beabsichtigter Injektion vor.

1. Bereiten Sie 0,5 μl 500 mU Neuraminidase aus Clostridium perfringens (Clostridium welchii) vor.
   HINWEIS: Bewahren Sie dies als 1 U/μl in sterilem Wasser bei -20 °C verdünnt auf. Andere Arten von Neuraminidasen wurden nicht getestet.
2. Bereiten Sie 1 μl mit 1 μg Integrin-β1-blockierendem Antikörper vor.
   HINWEIS: Bei 4 °C lagern.
3. Bereiten Sie 0,5 μl mit 0,5 μg basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (rekombinantes humanes FGF-basisch) vor.
   HINWEIS: Lagern Sie es als 1 μg/μl Brühe verdünnt in sterilem Wasser bei -20 °C.

2. Injektion des Freisetzungscocktails

HINWEIS: Der gesamte Vorgang kann innerhalb von 20 Minuten durchgeführt werden. Achten Sie darauf, die Operation unter aseptischen Bedingungen durchzuführen. Reinigen Sie alle Oberflächen mit einem Antiseptikum (z. B. 3 % oder 6 % Wasserstoffperoxid). Verwenden Sie autoklavierte oder leicht sterile Werkzeuge, Handschuhe, Kittel und Vorhänge.

1. Betäubung des Versuchstieres durch Isofluran-Inhalation (2,5 % zur Induktion und 2 % zur Erhaltung). Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Hornhautreflex, die Reaktion auf Reize (Kneiftest der Hintergliedmaßen und des Schwanzes) und die Art der Atmung überprüfen.
   HINWEIS: Chirurgische Eingriffe können unter Vollnarkose durchgeführt werden, die durch intraperitoneal injizierbare Anästhesie (z. B. Ketamin [40 mg/kg] und Xylazin [10 mg/kg]) induziert wird. Die Tiefenanästhesie wurde durch die Überprüfung des Hornhautreflexes, der Reaktion auf Reize (Kneiftest der Hintergliedmaßen und des Schwanzes) und der Art der Atmung bestätigt.
2. Analgesie subkutan verabreichen (z. B. 0,3 mg/ml Buprenorphin) nach Einleitung der Anästhesie.
3. Montieren Sie die Ratte auf dem stereotaktischen Rahmen.
4. Rasieren Sie das Fell des Kopfes mit einem Rasierer und reinigen Sie die Haut mit einem Antiseptikum, z. B. 10%iger Povidon-Jod-Lösung und dann Alkohol. Tragen Sie das Antiseptikum dreimal mit sterilen Wattestäbchen auf. Jedes Mal 3-5 s lang in kreisenden Bewegungen reiben. Tragen Sie Augensalbe auf, um Trockenheit vorzubeugen.
5. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 2 cm langen Schnitt in die Kopfhaut entlang der Mittellinie.
6. Reinigen Sie den Schädel sorgfältig mit sterilen Tupfern und steriler Kochsalzlösung.
7. Identifizieren Sie das Bregma mit dem Rand der Nadel einer 10-μl-Hamilton-Spritze, die auf dem stereotaktischen Gerät montiert ist. Stellen Sie das Bregma auf "Punkt 0,0" ein.
   ANMERKUNG: Das Bregma wird als Schnittpunkt zwischen der sagittalen und der koronalen Naht identifiziert. Weitere Details finden Sie im Rattenhirnatlas von Paxinos und Watson⁵.
8. Bewegen Sie das Gerät auf die Koordinaten anterioposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (für die SWZ) oder AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (für die CC).
9. Bohren Sie mit einem Dentalbohrer ein 1 mm dickes Gratloch.
   HINWEIS: Achten Sie beim Bohren von Hand darauf, die kortikale Oberfläche nicht zu verletzen. Es ist nicht zu erwarten, dass die Blutung erheblich sein wird. Reinigen Sie jegliches Blut mit Kochsalzlösung und üben Sie Druck aus, um hartnäckigere Blutungen zu stoppen.
10. Geben Sie 4 μl des Freisetzungscocktails in die 10 μl Hamilton-Spritze.
11. Senken Sie die Nadel (vorzugsweise stumpfe oder konische Kante) der Hamilton-Spritze ab, um mit der Dura in Kontakt zu kommen.
12. Stechen Sie die Nadel in der gewünschten Tiefe (D = 3,5 mm) ein.
    HINWEIS: Gießen Sie Kochsalzlösung auf die Oberfläche der Dura, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen.
13. 2 μl des Freisetzungscocktails mit einer Geschwindigkeit von 1 μl/min aufgießen.
14. Lassen Sie die Nadel weitere 2 Minuten an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam entnehmen, um ein Auftauchen des Freisetzungscocktails zu vermeiden.
15. Wiederholen Sie die Schritte 2.8-2.14 für die andere Hemisphäre bei den Koordinaten AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (für die SWZ) oder AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (für die CC).
16. Vernähen Sie den Einschnitt mit 5-0 Nylon (Durchmesser 0,1 mm) und reinigen Sie den vernähten Bereich mit einem Antiseptikum.
17. Nehmen Sie die Maske mit dem Betäubungsmittel ab und bringen Sie das Tier in den Überwachungsbereich nach der Operation.
    HINWEIS: Die Erholung von der Anästhesie und die Aufrechterhaltung der Liegelage sollten innerhalb von 5-10 Minuten und die vollständige Erholung (normales Verhalten) innerhalb von 25 Minuten erfolgen.
    1. Überwachen Sie genau die Erholung (lebhafte und ununterbrochene Bewegung, häufiger Zugang zu Wasser) in einem gut beheizten (24-25 °C), ruhigen Raum ohne Einstreu mit kleinen Partikeln, die die Atemwege blockieren können. Geben Sie das Tier erst dann in die Gesellschaft seiner Käfiggenossen (nicht in neue Tiere) zurück, wenn Sie die vollständige Genesung bestätigt haben.
    2. Überwachen Sie das Tier mindestens 48 Stunden nach der Operation in der Pflegeeinrichtung. Behandeln Sie Anzeichen von Schmerzen (Verstecken des Kopfes, abnormale Kopf- oder Körperhaltung, Überempfindlichkeit und Übererregbarkeit bei der Handhabung) durch Verabreichung einer Analgesie (z. B. 0,3 mg/ml Buprenorphin, subkutan). Weisen Sie Tiere mit verfärbtem oder aufgerichtetem Fell an den zuständigen Tierarzt über.

3. Flüssigbiopsie der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF)

HINWEIS: Der gesamte Vorgang kann innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden. Die hier beschriebene Flüssigbiopsie wird 3 Tage nach der Injektion des Freisetzungscocktails durchgeführt, kann aber bei Bedarf auf genau die gleiche Weise durchgeführt werden. Achten Sie darauf, die Operation unter aseptischen Bedingungen durchzuführen. Reinigen Sie alle Oberflächen mit einem Antiseptikum (z. B. 3 % oder 6 % Wasserstoffperoxid). Verwenden Sie autoklavierte oder leicht sterile Werkzeuge, Handschuhe, Kittel und Vorhänge.

1. Betäubung des Tieres durch Isofluran-Inhalation (2,5 % zur Induktion und 2 % zur Erhaltung). Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hornhaut überprüfen
   Reflex, die Reaktion auf Reize (Kneiftest der hinteren Gliedmaßen und des Schwanzes) und die Art der Atmung.
   HINWEIS: Die chirurgischen Eingriffe können unter Vollnarkose durchgeführt werden, die durch intraperitoneal injizierbare Anästhesie (z. B. Ketamin [40 mg/kg] und Xylazin [10 mg/kg]) induziert wird. Dies ist jedoch nicht ratsam, da das Verfahren kurz ist, insbesondere wenn Biopsien mehrmals an aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden.
2. Analgesie subkutan verabreichen (z. B. 0,3 mg/ml Buprenorphin) nach Einleitung der Anästhesie.
3. Montieren Sie das Versuchstier auf dem stereotaktischen Rahmen. Verwenden Sie Ohrbügel, um den Kopf zu fixieren, ohne die Drehbewegung nach vorne und hinten zu behindern.
4. Stabilisieren Sie den Kopf in einem Winkel von 40° nach unten, damit eine gute Streckung des Nackens erreicht werden kann.
   HINWEIS: Eine Möglichkeit, dies zu tun, ist die Verwendung der Mundleiste des Geräts⁶.
5. Rasieren Sie das Fell im Nackenbereich mit einem Rasierer und reinigen Sie die Haut mit einem Antiseptikum, z. B. 10%iger Povidon-Jod-Lösung und anschließend Alkohol. Tragen Sie das Antiseptikum dreimal mit sterilen Wattestäbchen auf. Jedes Mal 3-5 s lang in kreisenden Bewegungen reiben.
6. Suchen Sie mit der Fingerspitze den rautenförmigen deprimierbaren Bereich, der sich zwischen dem Hinterhauptsvorsprung und der Wirbelsäule des Atlas⁶ befindet.
7. Zeichne eine Punktmarkierung (z.B. mit einem Marker).
8. Befestigen Sie eine 1-ml- oder 0,5-ml-Spritze auf dem stereotaktischen Rahmen.
   HINWEIS: Es ist ratsam, Spritzen mit nicht abnehmbaren Nadeln zu verwenden, da sie eine bessere Saugkraft erzeugen und weniger Totvolumen haben.
9. Führen Sie die Nadel an die Kontaktstelle mit der Haut an der Punktmarkierung.
10. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an, während Sie die Spritze durch die Hautschichten senken.
11. Ziehen Sie den Kolben leicht an, um einen Unterdruck in der Spritze zu erzeugen.
12. Beginnen Sie mit dem Eintauchen der Nadel sehr langsam, bis Flüssigkeit (CSF) in der Spritze erscheint.
13. Setzen Sie die Nadel an dieser Position ab und lassen Sie den langsamen Fluss des Liquors zu.
    HINWEIS: Die Nadel kann leicht abgesenkt oder angehoben werden, wenn der Liquorfluss sehr langsam ist.
14. Beginnen Sie mit der Entnahme des Liquors langsam (in Schritten von 40 μl/min) bis zu 120 μl.
15. Ziehen Sie die Spritze langsam heraus.
16. Intraperitoneal 1 ml normales Serum verabreichen, um die Flüssigkeitsauffüllung des Versuchstieres zu unterstützen.
17. Mischen Sie die Flüssigbiopsie (CSF) mit 400 μl NSC-Medium und halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
    HINWEIS: Flüssigbiopsien sollten innerhalb von 3 h verarbeitet werden, wenn sie nicht eingefroren sind.
18. Entfernen Sie die Maske, die das Betäubungsmittel liefert, und bringen Sie das Tier in den Überwachungsbereich nach der Operation.
    HINWEIS: Die Erholung von der Anästhesie und die Aufrechterhaltung der Liegelage sollten innerhalb von 5-10 Minuten und die vollständige Erholung (normales Verhalten) innerhalb von 25 Minuten erfolgen.
    1. Überwachen Sie genau die Erholung (lebhafte und ununterbrochene Bewegung, häufiger Zugang zu Wasser) in einem gut beheizten (24-25 °C), ruhigen Raum ohne Einstreu mit kleinen Partikeln, die die Atemwege blockieren können. Geben Sie das Tier erst dann in die Gesellschaft seiner Käfiggenossen (nicht in neue Tiere) zurück, wenn die vollständige Genesung bestätigt wurde.
    2. Überwachen Sie das Tier mindestens 48 Stunden nach der Operation in der Pflegeeinrichtung. Wenn Anzeichen von Schmerzen (Verstecken des Kopfes, abnorme Kopf- oder Körperhaltung, Überempfindlichkeit und Übererregbarkeit bei der Handhabung) beobachtet werden, ist eine Analgesie (z. B. 0,3 mg/ml Buprenorphin subkutan) zu verabreichen. Weisen Sie Tiere mit verfärbtem oder aufgerichtetem Fell an den zuständigen Tierarzt über.

4. Aufbereitung von Gewebe für die Immunfluoreszenz

1. Euthanasie des Tieres durch intrakardiale Infusion von 20 ml eiskalter Kochsalzlösung, gefolgt von 50 ml eiskaltem 4%igem Paraformaldehyd (PFA; in phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS] mit einem pH-Wert = 7,4).
2. Sezieren Sie das Hirngewebe.
   1. Trennen Sie den Kopf mit einer Schere vom Körper, um einen Schnitt im Nackenbereich zu machen. Entfernen Sie mit der Schere die Haut und schneiden Sie dann den Schädelknochen entlang der sagittalen Mittellinie ab, wobei die Spitzen der Schere nach oben zeigen, um das Hirngewebe nicht zu beschädigen. Versuchen Sie, so viel wie möglich zu schneiden und dabei die koronale Mittellinie zu passieren.
   2. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Knochen zu entfernen, beginnend mit dem supraokzipitalen und den Scheitelknochen und schließlich den Stirnknochen.
   3. Sobald das Hirngewebe freigelegt ist, heben Sie es mit der Zange oder einem Spatel aus dem Schädel. Um dies zu erleichtern, schneiden Sie die Nerven an der Basis des Gehirns und die Riechkolben durch, wenn Sie dies nicht wünschen.
3. Fixieren Sie das Gewebe über Nacht in 2% PFA bei 4 °C.
4. Schützen Sie das Gewebe in 30% Saccharose (in PBS) für mindestens 48 h bei 4 °C, bis das Gewebe zu Boden sinkt.
5. Das Gewebe bei -80 °C einfrieren.
6. Schneiden Sie das Hirngewebe mit einem Kryostaten in 14 μm dicke koronale Schnitte.
7. Durchführung von Immunfluoreszenzfärbungen mit Standardprotokollen ^3,7
   1. Die Schnitte werden mit Blockierungspuffer (3 % Rinderserumalbumin [BSA], 0,1 % Triton X-100, in PBS) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.
   2. Antigengewinnung durchführen (15 min in 10 mM Citratpuffer kochen, pH = 6,0, in Gläsern).
      HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, aber für nukleäre Antigene erforderlich.
   3. Auf Raumtemperatur bringen und mit primären Antikörpern gegen saures Gliafibrillenprotein (GFAP), Doppelcortin (Dcx), S100β und β-Catenin (siehe Materialtabelle) in Blockierungspuffer über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   4. Inkubieren Sie für 2 h mit sekundären Antikörpern in PBS mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur nuklearen Gegenfärbung bei Raumtemperatur (siehe Materialtabelle).
   5. Montieren Sie die Deckgläser.

5. Prozessierung isolierter Zellen für die Immunfluoreszenz

1. Die Zellen werden in mikroskopiekompatible 96-Well-Platten eingeteilt, die mit Poly-D-Lysin (100 μg/ml) beschichtet sind.
2. Die Zellen 10 min in eiskaltem 2% PFA fixieren und 3x mit PBS waschen.
3. Führen Sie die Immunfluoreszenz mit den Standardverfahren^3,7 für PDGFRα, GFAP, Dcx^, SOX2 und ID3 durch (siehe Materialtabelle).
4. Halten Sie die Zellen in PBS + NaN₃ (0,1%) bei 4 °C im Dunkeln.

6. Mikroskopie und Bildanalyse

1. Nehmen Sie Bilder mit Epifluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie auf und führen Sie Zellzählungen mit Standard-Bildanalyse-Softwaretools wie Zellzählern durch.

Results

Freigabe und Sammlung von NSCs
NSCs der SWZ sind nur durch die Monoschicht der Ependymzellen vom Liquor getrennt, obwohl sie über interkalierende monofliliierte Fortsätze in direktem Kontakt mit dem ventrikulären Inhalt bleiben ^8,9. Neuraminidase wirkt spezifisch auf Ependymzellen durch Spaltung von Sialinsäureresten und kann eine Denudation der Ventrikelwand induzieren. Dies führt zu einer Anhäufung von Neuroblasten auf der Oberfläche des Ventrikels^10,11. Darüber hinaus wurde ein Fluss von Neuroblasten im Liquor nach der i.c.v.-Injektion eines Integrin-β1-blockierenden Antikörpers beobachtet, wahrscheinlich aufgrund einer Lockerung der interependymalen Zellverbindungen¹². Diese Beobachtungen haben zur Entwicklung eines Protokolls geführt, das die Isolierung der Stamm- und Vorläuferzellen des Gehirns durch kontrollierte Beeinträchtigung der Integrität der Wände des Seitenventrikels ermöglicht. In einem ersten Schritt wird die Freisetzung aus dem Parenchym und der anschließende Fluss von NSCs oder OPCs innerhalb des Liquors durch i.c.v.-Injektion des Freisetzungscocktails induziert. Der Cocktail wird stereotaktisch mit einer Rate von 1 μl/min bilateral (2 μl pro Injektion) in die lateralen Ventrikel injiziert (Koordinaten für SEZ-NSCs: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; Koordinaten, die auf CC-OPCs abzielen: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). Der zweite Schritt ("Entnahme") beinhaltet die Durchführung von Liquor-Flüssigbiopsien aus der Cisterna magna. Die Ratten müssen betäubt werden und die Biopsie kann mit 1-ml-Spritzen durchgeführt werden. Die Verwendung des stereotaktischen Geräts ermöglicht eine fast vollständige Entnahme von ca. 100 μl Liquor, ohne dass Inzisionen erforderlich sind. Die flüssige Biopsie wird dem eisgekühlten Kulturmedium zugesetzt und bis zum Aufplattieren <3 Stunden lang bei 4 °C aufbewahrt (NSC-Kulturmedium enthält Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM], B27-Supplement [2 %], N2-Supplement [1 %], FGF2 [20 ng/ml] und epidermalen Wachstumsfaktor [EGF; 20 ng/ml]).

Histologische Beurteilung des periventrikulären Bereichs nach Injektion des Freisetzungscocktails
Eine erste Kohorte von Experimenten zeigte, dass bei der Injektion von mehr als 3 μl Flüssigkeit die Ventrikel durch unspezifische, mechanische Verletzungen geschädigt werden können (Abbildung 2B,C). Die langsame Injektion von 2 μl des Freisetzungscocktails führte zur Entstehung von Clustern von Dcx-immunpositiven Neuroblasten an der ventrikulären Oberfläche. Diese Cluster blieben auch 8 Monate nach der Injektion sichtbar (Abbildung 2D). Da die Methode für Längsschnittstudien gedacht war, die auf eine langfristige Nachbeobachtung der Tiere abzielten, wurde die durch den Freisetzungscocktail verursachte Gewebeschädigung beurteilt. An 14 μm dicken Kryostat-Hirnschnitten wurde eine Immunfärbung auf ependymale Zellmarker wie S100β und β-Catenin¹³ durchgeführt und die Gesamtintegrität der Ependymschicht beurteilt. Denudationsstellen der Ependymalschicht waren nur in der Nähe des rostrocaudalen Niveaus der Injektionen vorhanden, wobei ein allmählicher Rückgang der Störungen der Ependymalschicht in den hinteren und anterioren Bereichen der SWZ festgestellt wurde (Abbildung 2E,F) und nach einem Abstand von ±2 mm von der Injektionsstelle verschwand. Die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass die partielle Denudation der Ependymschicht, die durch die i.c.v.-Injektion des Freisetzungscocktails verursacht wird, fokal ist, in der Nähe der Injektionsstelle zurückgehalten wird und den Rest der periventrikulären Ependymschicht intakt lässt.

Markerprofil und in vitro Verhalten der gesammelten Zellen
Anschließend wurden das In-vitro-Verhalten und das Markerprofil der über das Melkprotokoll isolierten Zellen bewertet. Die durchschnittliche Zellausbeute jeder Flüssigbiopsie beträgt ca. 300 ± 45 Zellen (pro Biopsie von 100 μl)⁷. Die Melkbiopsien ergaben NSC-Kulturen mit einem durchschnittlichen Passagepotenzial von 3,17 ± 0,45. Zellen, die aus mit Kochsalzlösung injizierten Ratten isoliert wurden, konnten durchschnittlich 1,92 ± 0,76 Mal durchgelassen werden; Im Gegensatz dazu erreichten diejenigen, die durch Melken isoliert wurden, sogar neun Passagen (p = 0,038, t-Test) (Abbildung 3A)⁷. Die durchschnittliche Passagekapazität von Standard-Postmortem-Neurosphärenkulturen aus der Sonderwirtschaftszone ist höher als 12 Passagen in unseren Händen. Da sich gezeigt hat, dass das In-vivo-Expansionspotenzial von SEZ-NSCs, wie es durch In-vivo-Zell-Verbführungs-Mapping-Experimente ¹⁴ gezeigt wurde, begrenzt ist, entstehen beim Melken Zellen mit einem signifikant anderen In-vitro-Verhalten als das von Zellen in Standardkulturen, wenn auch viel näher am Verhalten endogener NSCs. Die gesammelten Zellen wurden auf Poly-D-Lysin-beschichteten Wells plattiert. wo sie sowohl als adhärente Monolayer als auch seltener als Neurosphären wuchsen (Abbildung 3B). Frisch isolierte Zellen (3 Tage nach der Injektion entnommen und 24 Stunden nach der Plattierung fixiert), die immunpositiv für den astroglialen Marker GFAP waren, waren auch immunpositiv für ID3, einen Marker für Ruhe, und wiesen die Charakteristik für die bipolare Morphologie des NSC auf (Abbildung 3C). Darüber hinaus zeigte, wie bereits berichtet⁷, ein detaillierterer immunzytochemischer Vergleich von aus Biopsien gewonnenen Zellen und von postmortalen Zellen derselben Tiere 3 Tage nach der Injektion (Suche nach GFAP+-Astrozyten, Dcx+-Neuroblasten, PDGFRa+-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und SOX2+-Zellen der neuronalen Linie), dass das Profil der gesammelten Zellen dem der endogenen SEZ-Zellen ähnelte (Abbildung 3D). Insbesondere beim Vergleich von Biopsie- und Gewebezellen unter verschiedenen Bedingungen (z. B. Injektion eines Freisetzungscocktails mit und ohne FGF2) wurde festgestellt, dass der Wachstumsfaktor zu einem gleichzeitigen und signifikanten Anstieg des Vorhandenseins von SOX2+-Zellen sowie zu einer signifikanten Abnahme des Vorhandenseins von Dcx+-Neuroblasten in beiden Proben führte (Abbildung 3D). Diese Daten bestätigten, dass sich alle Veränderungen, die im Profil der endogenen Populationen von NSCs auftreten, in den durch Melken erzeugten Zellproben widerspiegeln.

Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung des Melkens. Ein koronaler Schnitt einer Gehirnhälfte mit den wichtigsten anatomischen Orientierungspunkten (dem lateralen Ventrikel, dem darüber liegenden Corpus callosum und der vorderen Kommissur darunter [Bahnen der weißen Substanz in grau] und der subependymalen Zone an den Seitenwänden [in blau]). Der Freisetzungscocktail wird in die Seitenkammer injiziert, was zu einer Beeinträchtigung der Integrität des Gewebes und zur Freisetzung von postnatalen neuralen Hirnstammzellen in der Zerebrospinalflüssigkeit führt, aus denen sie über Flüssigbiopsien gewonnen werden können. Abkürzungen: SEZ = subependymale Zone; LV = lateraler Ventrikel; Liquor = Liquor cerebrospinalis; pbNSCs = postnatale neurale Stammzellen des Gehirns; β1-int = beta1-Integrin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Histologische Beurteilung der Wirkung von i.c.v.-Injektionen. (A-D) Schwach vergrößerte Bilder der dorsalen Hälfte des lateralen Ventrikels nach Immunfärbung für Dcx (in rot, zur Markierung von Neuroblasten). (A) Das einfache i.c.v.-Einführen einer Hamilton-Spritze stört die Zytoarchitektur der SWZ nicht, während die i.c.v.-Injektion von 10 ml (Infusionsrate von 1 ml/min) unabhängig von ihrem Inhalt zu einer schweren Schädigung der Ventrikelwand führt. (B) Kochsalzlösung und (C) Freisetzungscocktail. (D) Die Injektion von 2 μl des Freisetzungscocktails führt zu einer kontrollierten Beeinträchtigung der Ventrikelwand, die auch 8 Monate nach der Operation beobachtet wird. Höhere Vergrößerungsdetails der Wand der SWZ 7 und 14 Tage nach der Injektion sind in (E) bzw. (F) dargestellt. Es gibt eine unorganisierte Struktur, wobei Dcx+-Neuroblasten (in grün) an der Oberfläche der Wand ruhen und die anderen Zellen der Nische (Sox2+, in weiß) tiefer ruhen. Das periventrikuläre Gewebe ist nach 2 Monaten (in G) auf rostrocaudaler Ebene der Injektion geschädigt, während das Gewebe auf kaudaler Ebene (in H) desselben Tieres intakt ist. Die Ventrikelwand wird durch Immunfärbung auf die ependymalen Marker S100β und β-Catenin untersucht. Details der typischen Architektur der Wand sind in (I) dargestellt. Die Kernfärbung erfolgt mittels DAPI (blau dargestellt). Maßstabsbalken = 300 μm (A-C,G,H, Einsätze), 150 μm (D), 30 μm (E,F) und 50 μm (I). Diese Abbildung wurde von McClenahan et ^al.13 modifiziert. Abkürzungen: SEZ = subependymale Zone; I.C.V = intrazerebroventrikulär; Dcx = Doppelcortin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Bewertung der durch Melken isolierten Zellen . (A) Diagramm mit der maximalen Anzahl von Passagen, die pro Flüssigbiopsieprobe von Tieren mit Kochsalzlösung (graue Balken, insgesamt 12 Proben) oder nach dem Melken (schwarze Balken, insgesamt 29 Proben, Freisetzungscocktail mit Neuraminidase und Integrin-β1-blockierenden Antikörpern) erhalten wurden. (B) Repräsentatives konfokales Mikroskopiebild von Primärzellen, die 3 Tage nach der Injektion durch Melken gewonnen und gegen GFAP und ID3 immungefärbt wurden. (C,D) Hellfeldbilder von Zellen, die 3 Tage nach der Injektion isoliert, auf Poly-D-Lysin-beschichteten Wells plattiert und 7 Tage lang in NSC-Proliferationsmedium wachsen gelassen wurden. (E) Schaubild mit dem Zelltypprofil der Zellen, die durch Melken in der SWZ isoliert wurden, und der endogenen Population der SWZ-NSCs von denselben Versuchstieren. Die SOX2+- und die Dcx+-Fraktionen waren nach der Co-Injektion von FGF2 signifikant erhöht bzw. erniedrigt. (Einweg-ANOVA-Analyse pro Marker, gefolgt von Post-hoc-Analyse; n = 4-6 Tiere pro Versuchsgruppe.) Maßstabsbalken = 100 μm (C,D) und 10 μm (B). Diese Abbildung wurde von McClenahan et ^al.13 modifiziert. Abkürzungen: SEZ = subependymale Zone; DPI = Tage nach der Injektion; NSC = neurale Stammzellen; Dcx = Doppelcortin; GFAP = saures Gliafibrillenprotein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Stamm- und Vorläuferzellen sind im Hirngewebe von Säugetieren relativ spärlich. Darüber hinaus befinden sich NSCs in Bereichen, die für einfache und sichere Biopsien unzugänglich sind (Ventrikelwände, Hippocampus). Daher war die einzige Möglichkeit, mit solchen Zellen experimentell zu arbeiten, bisher ihre postmortale Isolierung. Eine Methode, die die einmalige oder wiederholte Entnahme von NSCs und OPCs von lebenden Ratten ermöglicht, das sogenannte Melken, wird hier Schritt für Schritt beschrieben. Die Methode basiert auf zwei Hauptmerkmalen: i) NSCs oder OPCs sind durch die Ependymzell-Monoschicht vom Liquor getrennt, der innerhalb des ventrikulären Systems des Gehirns fließt; ii) Ependymzellen und neurale Vorläuferzellen halten über Integrine den Kontakt untereinander und mit anderen benachbarten Zelltypen aufrecht. Daher enthält der Freisetzungscocktail, der in bestimmte Bereiche der Ventrikel injiziert wird, um die Ablösung von NSCs oder OPCs aus dem Gehirnparenchym zu ermöglichen, Neuraminidase, ein Toxin, das spezifisch auf Ependymzellen abzielt und diese abtötet^10,11, und einen Integrin-β1-blockierenden Antikörper. Es enthält auch FGF2, da dieser Wachstumsfaktor für das Überleben und den Erhalt von NSCs in der Nische und in der Kultur unerlässlich ist^15,16. Es wurde bereits gezeigt⁷, dass dieses Protokoll von den Tieren gut vertragen wird; In diesem Bericht wird ferner bestätigt, dass die Schädigung der Ependymzellen, die durch den Freisetzungscocktail als Voraussetzung für die Freisetzung von NSCs/OPCs im Liquor induziert wird, um das rostrocaudale Niveau der Injektion begrenzt ist. Dies war von entscheidender Bedeutung, da das Protokoll die homöostatische Funktion des Gehirns, einschließlich der Stammzellnische selbst, erhalten und das langfristige Wohlbefinden der Tiere nicht beeinträchtigen sollte. Die stereotaktische Injektion des Freisetzungscocktails ist von mildem Schweregrad und hat noch nie zum Tod geführt. Darüber hinaus ist die Durchführung von Flüssigbiopsien aus der Cisterna magna ein schnelles und minimalinvasives Verfahren, das mehrmals hintereinander wiederholt werden kann.

Wichtig ist, dass die NSC-Proben, die durch Melken isoliert wurden, den endogenen Pool an NSCs genau widerspiegeln. Das Profil der SEZ-Vorläuferzellen kann durch die i.c.v.-Injektion von FGF2 beeinflusst werden. Wenn dies geschieht, wird das Profil der aus dem Melken gewonnenen Zellen auf die gleiche Weise beeinflusst. Darüber hinaus haben frühere experimentelle Arbeiten gezeigt, dass NSCs, die durch Melken der SWZ isoliert wurden, ein begrenztes Selbsterneuerungspotenzial haben, ein Verhalten, das dem von endogenen NSCs ähnelt, wie mit in vivo, transgenen Zellschicksalsstrategien gezeigt wurde^14,17. Postnatale NSCs im Gehirn werden in Ruhe gehalten und gehen selten in Richtung mitotischer Aktivierung über, um neurogene und gliogene Nachkommen zu erzeugen^18,19,20. Hier wird der Nachweis erbracht, dass der Anteil der aus dem Melken stammenden Zellen, die GFAP exprimieren und von denen erwartet wird, dass sie bona fide NSCs enthalten, ID3, einen Marker für ruhende NSCs, coexprimieren²¹. Das angereicherte Vorhandensein von ruhenden NSCs, die dann in dem NSC-Medium plattiert werden, das typischerweise für die Kultivierung von postmortal isolierten NSCs verwendet wird, scheint das Expansionspotenzial der gesammelten NSCs zu begrenzen (z. B. ein Prozess, der entscheidend ist, wenn Zellen für autologe Transplantationen verwendet werden sollten). Dies liegt daran, dass diese Medien speziell für das Überleben und die mitotische Expansion aktivierter NSCs entwickelt wurden. Daher wird die Generierung von Protokollen, die eine effiziente und schnelle mitotische Aktivierung ruhender NSCs ermöglichen, den Wert und den Anwendungsbereich des Melkens erhöhen.

Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass das Melken die Entnahme von postnatalen NSCs und OPCs im Gehirn (abhängig von der rostrocaudalen Injektion des Freisetzungscocktails) von lebenden Ratten ermöglicht. Diese Arbeit weist darauf hin, dass es möglich ist, sukzessive Flüssigbiopsien im selben Tier durchzuführen, auch über einen längeren Zeitraum nach der Injektion des Freisetzungscocktails (also um experimentelle Längsschnittstudien zu planen und durchzuführen), da Neuroblasten auch 8 Monate nach der Injektion an den Ventrikelwänden gehäuft bleiben. Solche Methoden sind von entscheidender Bedeutung, da sie die Untersuchung von Ereignissen innerhalb einzelner Tiere ermöglichen, die zu einer Verringerung des biologischen Rauschens führen, das durch physiologische Variation erzeugt wird. Dies wiederum führt zu einer erhöhten Genauigkeit und zur Umsetzung der Prinzipien der "3R" (Replacement, Reduction, Refinement). Zukünftige wichtige Schritte zur Verbesserung der Methode werden die Bestimmung der maximalen Anzahl und des Zeitrahmens sein, in dem Flüssigbiopsien nach einem Freisetzungsverfahren durchgeführt werden können, wobei die Durchführung zusätzlicher Freisetzungsverfahren bei Bedarf möglich sein sollte.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release Cocktail
β 1-Integrin-blockierender Antikörper	BD Biosciences	#555002	gereinigter NA/LE Hamster Anti-Ratte CD29 Klon Ha2/5, 1 mg/ml. Jeder Körper mit blockierender Aktivität sollte angemessen sein.
Neuraminidase aus Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidasen aus anderen Quellen (z.B. aus Vibrio cholerae) wurden nicht getestet.
Rekombinantes humanes FGF-basisch (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	wird als 1 μ g/μ L-Brühe, verdünnt in sterilem Wasser bei -20 &°; C
Chirurgische Eingriffe
10 & micro; L Spritze	Hamilton	#80330	Modell 701 RN, kleine abnehmbare Nadel, 26s Gauge, 2 Zoll, Spitzenform 2
BD Mikrofeine 1 mL Insulinspritzen	BD biosciences	04085-00	29 G x 12,7 mm
BEADIN CUT. SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	ARTIKELNUMMER:
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (Buprenophin 0,3 mg/ml)
Digital New Standard Stereotaxic, Ratte und Maus	Stoelting	51500D
Homöothermes Überwachungssystem	Harvard Apparatur	55-7020
ISOFLURIN 1.000 mg/g Inhalationsdampf, flüssig	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU:	Ketamin 100 mg/mL
Nylonnaht, Ethilon	Ethicon	D9635	Klar, Größe 5-0
Wiederaufladbare kabellose chirurgische Trimmer	Stoelting	Artikel:51472
Skalpellklingen, steril	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-Zoll-Tupfer	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaktischer Hochgeschwindigkeitsbohrer	Foredom	1474w/o1464
Stoelting' s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Artikel: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazin, 25
mLTissue and cells handling and immunostainings
96-well Platten geeignet für die Mikroskopie	Greiner	#655866	Screen Star Mikroplatte
B27 Ergänzung	ThermoFisher Scientific	A1486701
Rinderserumalbumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraktion V, Hitzeschock
Citrat	Merck	71497	Monobasisches Natriumcitrat
Kryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Kernfärbung, Verdünnung: 1/1.000
DMEM	ThermoFisher Wissenschaftliche	11995065	Anti-Ziegen mit hohem Glukosegehalt und Pyruvat
	Biotium	20016 oder 20106 oder 20048	Verdünnung: 1/1.000
Esel Anti-Maus	Biotium	20014 oder 20105 oder 20046	Verdünnung: 1/1.000
Esel Anti-Kaninchen	Biotium	20015 oder 20098 oder 20047	Verdünnung: 1/1.000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (oder bFGF)	Peprotech	100-18B
Ziege Anti-GFAP	Abcam	ab53554	Verdünnung: 1/500
Ziege anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Verdünnung: 1/200
Maus anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Verdünnung: 1/200
Maus anti-S100β	Sigma	S2532	Verdünnung: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Eindeckmedium
N2 Ergänzung	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysin	Merck, Millipore	A-003-E	Lösung, 1,0 mg/ml
Kaninchen Anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Verdünnung: 1/500
Kaninchen Anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Verdünnung: 1/200
Kaninchen Anti-Β- Catenin	Abcam	ab16051	Verdünnung: 1/500
Triton X-100	Merck	X100<
strong>Mikroskopie und Bildanalyse
Konfokalmikroskop	Leica	SP6 und SP8
Bildanalyse	NIH, USA	ImageJ
Bildanalyse	Leica	LasX