Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

Summary

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Abstract

Gewebespezifische neurale Stammzellen (NSCs) bleiben im postnatalen Gehirn von Säugetieren aktiv. Sie befinden sich in spezialisierten Nischen, wo sie neue Neuronen und Gliazellen erzeugen. Eine solche Nische ist die subependymale Zone (SEZ; auch ventrikulär-subventrikuläre Zone genannt), die sich quer über die lateralen Wände der lateralen Ventrikel neben der ependymalen Zellschicht befindet. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind reichlich im zentralen Nervensystem verteilt und bilden einen Pool proliferativer Vorläuferzellen, die Oligodendrozyten erzeugen können.

Sowohl NSCs als auch OPCs weisen ein Selbsterneuerungspotenzial und Ruhe-/Aktivierungszyklen auf. Aufgrund ihrer Lage erfolgt die Isolierung und experimentelle Untersuchung dieser Zellen postmortal. Hier beschreiben wir ausführlich das “Brain Milking”, eine Methode zur Isolierung von NSCs und OPCs, unter anderem von Zellen, aus lebenden Tieren. Dabei handelt es sich um ein zweistufiges Protokoll, das für den Einsatz bei Nagetieren entwickelt und an Ratten getestet wurde. Zunächst werden die Zellen durch stereotaktische intrazerebroventrikuläre (i.c.v.) Injektion eines “Freisetzungscocktails” aus dem Gewebe “freigesetzt”. Die Hauptbestandteile sind die Neuraminidase, die auf Ependymzellen abzielt und die Denudation der Ventrikelwand induziert, ein Integrin-β1-blockierender Antikörper und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2. In einem zweiten Schritt der “Entnahme” werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis aus der Cisterna magna durchgeführt, bei anästhesierten Ratten, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass isolierte Zellen ihr endogenes Profil beibehalten und dass NSCs der Sonderwirtschaftszone ihre Ruhe bewahren. Die Denudation der Ependymschicht ist auf die anatomische Ebene der Injektion beschränkt und das Protokoll (Freisetzung und Entnahme) wird von den Tieren gut vertragen. Dieser neuartige Ansatz ebnet den Weg für die Durchführung von Längsschnittstudien zur endogenen Neurogenese und Gliogenese bei Versuchstieren.

Introduction

Gewebespezifische Stammzellen sind teilweise gebundene Zellen, aus denen alle Zellpopulationen hervorgehen können, aus denen die jeweiligen Gewebe bestehen. Abgesehen davon, dass sie multipotent sind, sind sie selbsterneuernde Zellen und entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Regenerationsfähigkeit von Geweben¹. Einige gewebespezifische Stammzellen verbleiben in einem aktiven, stark proliferativen Zustand, wie z. B. intestinale oder hämatopoetische Stammzellen. Andere, wie z. B. Hirnstammzellen, bleiben weitgehend ruhend oder ruhend². Im erwachsenen Gehirn befinden sich neurale Stammzellen (NSCs) in spezialisierten Bereichen, die oft als Nischen bezeichnet werden. Zwei solcher gut beschriebenen Bereiche existieren in der subependymalen Zone (SEZ) der Seitenventrikel und im Gyrus dentatus des Hippocampus. Die SWZ-Nische erzeugt die höchste Anzahl von Zellen, vor allem Neuroblasten, die in Richtung der Riechkolben wandern und zur lokalen Interneuronenpopulation beitragen; Im Gegensatz dazu wandern generierte Oligodendroblasten in das benachbarte Corpus callosum (CC)³. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind mitotisch aktive Zellen, die weit über das zentrale Nervensystem verteilt sind und die: i) an die oligodendrogliale Linie gebunden sind, ii) zu Demyelinisierungsstellen wandern können und iii) sich zu myelinisierenden Oligodendrozyten differenzieren können. OPCs weisen auch ein Selbsterneuerungspotenzial und eine Ruhephase^{auf 4}.

Bisher erforderte die Isolierung und Untersuchung von NSCs und OPCs eine postmortale Dissoziation des präparierten Hirn- und Rückenmarksgewebes. Um diese experimentelle Einschränkung zu umgehen, haben wir eine Methode entwickelt, die es zum ersten Mal ermöglicht, NSCs und OPCs im Gehirn aus lebenden Tieren zu isolieren. Wir nennen diese Methode “Melken”, weil sie mehrere Ansammlungen von Zellen ermöglicht, da ihre Pools nicht erschöpft sind. Das Protokoll wurde aufgrund ihrer großen Gehirngröße an Ratten entwickelt und zielt hauptsächlich auf die SEZ oder das CC ab und umfasst zwei Hauptschritte. Zunächst werden NSCs oder OPCs durch i.c.v.-Injektion eines “Freisetzungscocktails” aus dem Gewebe “entfernt”, der Neuraminidase, ein Toxin, das die Ventrikelwanddenudation induziert, einen Integrin-β1-blockierenden Antikörper und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) enthält. Der Cocktail wird stereopädisch beidseitig in die Seitenventrikel injiziert. Wenn die beabsichtigte Verwendung die Isolierung von NSCs ist, werden rostrale Bereiche der lateralen Ventrikel anvisiert. Geht es darum, OPCs reiner zu isolieren, wird der Cocktail kaudal in den Bereich der hippocampalen Fimbrien injiziert. In einem zweiten Schritt der “Entnahme” werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus der Cisterna magna von anästhesierten Ratten durchgeführt, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist. Die Flüssigbiopsie wird mit NSC-Nährmedium gemischt und kann bis zum Anrichten bei 4 °C aufbewahrt werden.

Protocol

Die Zucht-, Pflege- und Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt, der vom Innenministerium genehmigt wurde, und mit dem Präsidialdekret 56/2013 der Hellenischen Republik, das von den Tierschutz- und Ethikprüfungsgremien der Universitäten Cambridge und Patras sowie vom örtlichen Präfekturausschuss für Tierpflege und -verwendung genehmigt und geprüft wurde (Protokollnummer: 5675/39/18-01-2021). Es wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-, Wistar- und Long-Evans-Ratten mit einem Alter zwischen 2 und 4 Monaten und einem Körpergewicht zwischen 150 g und 250 g verwendet. Das Protokoll ist in Abbildung 1 grafisch zusammengefasst. 1. Zubereitung des Cocktails freisetzen HINWEIS: Am Tag des Eingriffs frisch zubereiten und auf Eis aufbewahren. Die Mengen werden pro 2 μl verabreicht, die i.c.v. in jeden Seitenventrikel injiziert werden. Bereiten Sie zusätzlich 1 μl pro beabsichtigter Injektion vor. Bereiten Sie 0,5 μl 500 mU Neuraminidase aus Clostridium perfringens (Clostridium welchii) vor.HINWEIS: Bewahren Sie dies als 1 U/μl in sterilem Wasser bei -20 °C verdünnt auf. Andere Arten von Neuraminidasen wurden nicht getestet. Bereiten Sie 1 μl mit 1 μg Integrin-β1-blockierendem Antikörper vor.HINWEIS: Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie 0,5 μl mit 0,5 μg basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (rekombinantes humanes FGF-basisch) vor.HINWEIS: Lagern Sie es als 1 μg/μl Brühe verdünnt in sterilem Wasser bei -20 °C. 2. Injektion des Freisetzungscocktails HINWEIS: Der gesamte Vorgang kann innerhalb von 20 Minuten durchgeführt werden. Achten Sie darauf, die Operation unter aseptischen Bedingungen durchzuführen. Reinigen Sie alle Oberflächen mit einem Antiseptikum (z. B. 3 % oder 6 % Wasserstoffperoxid). Verwenden Sie autoklavierte oder leicht sterile Werkzeuge, Handschuhe, Kittel und Vorhänge. Betäubung des Versuchstieres durch Isofluran-Inhalation (2,5 % zur Induktion und 2 % zur Erhaltung). Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Hornhautreflex, die Reaktion auf Reize (Kneiftest der Hintergliedmaßen und des Schwanzes) und die Art der Atmung überprüfen.HINWEIS: Chirurgische Eingriffe können unter Vollnarkose durchgeführt werden, die durch intraperitoneal injizierbare Anästhesie (z. B. Ketamin [40 mg/kg] und Xylazin [10 mg/kg]) induziert wird. Die Tiefenanästhesie wurde durch die Überprüfung des Hornhautreflexes, der Reaktion auf Reize (Kneiftest der Hintergliedmaßen und des Schwanzes) und der Art der Atmung bestätigt. Analgesie subkutan verabreichen (z. B. 0,3 mg/ml Buprenorphin) nach Einleitung der Anästhesie. Montieren Sie die Ratte auf dem stereotaktischen Rahmen. Rasieren Sie das Fell des Kopfes mit einem Rasierer und reinigen Sie die Haut mit einem Antiseptikum, z. B. 10%iger Povidon-Jod-Lösung und dann Alkohol. Tragen Sie das Antiseptikum dreimal mit sterilen Wattestäbchen auf. Jedes Mal 3-5 s lang in kreisenden Bewegungen reiben. Tragen Sie Augensalbe auf, um Trockenheit vorzubeugen. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 2 cm langen Schnitt in die Kopfhaut entlang der Mittellinie. Reinigen Sie den Schädel sorgfältig mit sterilen Tupfern und steriler Kochsalzlösung. Identifizieren Sie das Bregma mit dem Rand der Nadel einer 10-μl-Hamilton-Spritze, die auf dem stereotaktischen Gerät montiert ist. Stellen Sie das Bregma auf “Punkt 0,0” ein.ANMERKUNG: Das Bregma wird als Schnittpunkt zwischen der sagittalen und der koronalen Naht identifiziert. Weitere Details finden Sie im Rattenhirnatlas von Paxinos und Watson5. Bewegen Sie das Gerät auf die Koordinaten anterioposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (für die SWZ) oder AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (für die CC). Bohren Sie mit einem Dentalbohrer ein 1 mm dickes Gratloch.HINWEIS: Achten Sie beim Bohren von Hand darauf, die kortikale Oberfläche nicht zu verletzen. Es ist nicht zu erwarten, dass die Blutung erheblich sein wird. Reinigen Sie jegliches Blut mit Kochsalzlösung und üben Sie Druck aus, um hartnäckigere Blutungen zu stoppen. Geben Sie 4 μl des Freisetzungscocktails in die 10 μl Hamilton-Spritze. Senken Sie die Nadel (vorzugsweise stumpfe oder konische Kante) der Hamilton-Spritze ab, um mit der Dura in Kontakt zu kommen. Stechen Sie die Nadel in der gewünschten Tiefe (D = 3,5 mm) ein.HINWEIS: Gießen Sie Kochsalzlösung auf die Oberfläche der Dura, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen. 2 μl des Freisetzungscocktails mit einer Geschwindigkeit von 1 μl/min aufgießen. Lassen Sie die Nadel weitere 2 Minuten an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam entnehmen, um ein Auftauchen des Freisetzungscocktails zu vermeiden. Wiederholen Sie die Schritte 2.8-2.14 für die andere Hemisphäre bei den Koordinaten AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (für die SWZ) oder AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (für die CC). Vernähen Sie den Einschnitt mit 5-0 Nylon (Durchmesser 0,1 mm) und reinigen Sie den vernähten Bereich mit einem Antiseptikum. Nehmen Sie die Maske mit dem Betäubungsmittel ab und bringen Sie das Tier in den Überwachungsbereich nach der Operation.HINWEIS: Die Erholung von der Anästhesie und die Aufrechterhaltung der Liegelage sollten innerhalb von 5-10 Minuten und die vollständige Erholung (normales Verhalten) innerhalb von 25 Minuten erfolgen.Überwachen Sie genau die Erholung (lebhafte und ununterbrochene Bewegung, häufiger Zugang zu Wasser) in einem gut beheizten (24-25 °C), ruhigen Raum ohne Einstreu mit kleinen Partikeln, die die Atemwege blockieren können. Geben Sie das Tier erst dann in die Gesellschaft seiner Käfiggenossen (nicht in neue Tiere) zurück, wenn Sie die vollständige Genesung bestätigt haben. Überwachen Sie das Tier mindestens 48 Stunden nach der Operation in der Pflegeeinrichtung. Behandeln Sie Anzeichen von Schmerzen (Verstecken des Kopfes, abnormale Kopf- oder Körperhaltung, Überempfindlichkeit und Übererregbarkeit bei der Handhabung) durch Verabreichung einer Analgesie (z. B. 0,3 mg/ml Buprenorphin, subkutan). Weisen Sie Tiere mit verfärbtem oder aufgerichtetem Fell an den zuständigen Tierarzt über. 3. Flüssigbiopsie der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) HINWEIS: Der gesamte Vorgang kann innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden. Die hier beschriebene Flüssigbiopsie wird 3 Tage nach der Injektion des Freisetzungscocktails durchgeführt, kann aber bei Bedarf auf genau die gleiche Weise durchgeführt werden. Achten Sie darauf, die Operation unter aseptischen Bedingungen durchzuführen. Reinigen Sie alle Oberflächen mit einem Antiseptikum (z. B. 3 % oder 6 % Wasserstoffperoxid). Verwenden Sie autoklavierte oder leicht sterile Werkzeuge, Handschuhe, Kittel und Vorhänge. Betäubung des Tieres durch Isofluran-Inhalation (2,5 % zur Induktion und 2 % zur Erhaltung). Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hornhaut überprüfenReflex, die Reaktion auf Reize (Kneiftest der hinteren Gliedmaßen und des Schwanzes) und die Art der Atmung.HINWEIS: Die chirurgischen Eingriffe können unter Vollnarkose durchgeführt werden, die durch intraperitoneal injizierbare Anästhesie (z. B. Ketamin [40 mg/kg] und Xylazin [10 mg/kg]) induziert wird. Dies ist jedoch nicht ratsam, da das Verfahren kurz ist, insbesondere wenn Biopsien mehrmals an aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden. Analgesie subkutan verabreichen (z. B. 0,3 mg/ml Buprenorphin) nach Einleitung der Anästhesie. Montieren Sie das Versuchstier auf dem stereotaktischen Rahmen. Verwenden Sie Ohrbügel, um den Kopf zu fixieren, ohne die Drehbewegung nach vorne und hinten zu behindern. Stabilisieren Sie den Kopf in einem Winkel von 40° nach unten, damit eine gute Streckung des Nackens erreicht werden kann.HINWEIS: Eine Möglichkeit, dies zu tun, ist die Verwendung der Mundleiste des Geräts6. Rasieren Sie das Fell im Nackenbereich mit einem Rasierer und reinigen Sie die Haut mit einem Antiseptikum, z. B. 10%iger Povidon-Jod-Lösung und anschließend Alkohol. Tragen Sie das Antiseptikum dreimal mit sterilen Wattestäbchen auf. Jedes Mal 3-5 s lang in kreisenden Bewegungen reiben. Suchen Sie mit der Fingerspitze den rautenförmigen deprimierbaren Bereich, der sich zwischen dem Hinterhauptsvorsprung und der Wirbelsäule des Atlas6 befindet. Zeichne eine Punktmarkierung (z.B. mit einem Marker). Befestigen Sie eine 1-ml- oder 0,5-ml-Spritze auf dem stereotaktischen Rahmen.HINWEIS: Es ist ratsam, Spritzen mit nicht abnehmbaren Nadeln zu verwenden, da sie eine bessere Saugkraft erzeugen und weniger Totvolumen haben. Führen Sie die Nadel an die Kontaktstelle mit der Haut an der Punktmarkierung. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an, während Sie die Spritze durch die Hautschichten senken. Ziehen Sie den Kolben leicht an, um einen Unterdruck in der Spritze zu erzeugen. Beginnen Sie mit dem Eintauchen der Nadel sehr langsam, bis Flüssigkeit (CSF) in der Spritze erscheint. Setzen Sie die Nadel an dieser Position ab und lassen Sie den langsamen Fluss des Liquors zu.HINWEIS: Die Nadel kann leicht abgesenkt oder angehoben werden, wenn der Liquorfluss sehr langsam ist. Beginnen Sie mit der Entnahme des Liquors langsam (in Schritten von 40 μl/min) bis zu 120 μl. Ziehen Sie die Spritze langsam heraus. Intraperitoneal 1 ml normales Serum verabreichen, um die Flüssigkeitsauffüllung des Versuchstieres zu unterstützen. Mischen Sie die Flüssigbiopsie (CSF) mit 400 μl NSC-Medium und halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.HINWEIS: Flüssigbiopsien sollten innerhalb von 3 h verarbeitet werden, wenn sie nicht eingefroren sind. Entfernen Sie die Maske, die das Betäubungsmittel liefert, und bringen Sie das Tier in den Überwachungsbereich nach der Operation.HINWEIS: Die Erholung von der Anästhesie und die Aufrechterhaltung der Liegelage sollten innerhalb von 5-10 Minuten und die vollständige Erholung (normales Verhalten) innerhalb von 25 Minuten erfolgen.Überwachen Sie genau die Erholung (lebhafte und ununterbrochene Bewegung, häufiger Zugang zu Wasser) in einem gut beheizten (24-25 °C), ruhigen Raum ohne Einstreu mit kleinen Partikeln, die die Atemwege blockieren können. Geben Sie das Tier erst dann in die Gesellschaft seiner Käfiggenossen (nicht in neue Tiere) zurück, wenn die vollständige Genesung bestätigt wurde. Überwachen Sie das Tier mindestens 48 Stunden nach der Operation in der Pflegeeinrichtung. Wenn Anzeichen von Schmerzen (Verstecken des Kopfes, abnorme Kopf- oder Körperhaltung, Überempfindlichkeit und Übererregbarkeit bei der Handhabung) beobachtet werden, ist eine Analgesie (z. B. 0,3 mg/ml Buprenorphin subkutan) zu verabreichen. Weisen Sie Tiere mit verfärbtem oder aufgerichtetem Fell an den zuständigen Tierarzt über. 4. Aufbereitung von Gewebe für die Immunfluoreszenz Euthanasie des Tieres durch intrakardiale Infusion von 20 ml eiskalter Kochsalzlösung, gefolgt von 50 ml eiskaltem 4%igem Paraformaldehyd (PFA; in phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS] mit einem pH-Wert = 7,4). Sezieren Sie das Hirngewebe.Trennen Sie den Kopf mit einer Schere vom Körper, um einen Schnitt im Nackenbereich zu machen. Entfernen Sie mit der Schere die Haut und schneiden Sie dann den Schädelknochen entlang der sagittalen Mittellinie ab, wobei die Spitzen der Schere nach oben zeigen, um das Hirngewebe nicht zu beschädigen. Versuchen Sie, so viel wie möglich zu schneiden und dabei die koronale Mittellinie zu passieren. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Knochen zu entfernen, beginnend mit dem supraokzipitalen und den Scheitelknochen und schließlich den Stirnknochen. Sobald das Hirngewebe freigelegt ist, heben Sie es mit der Zange oder einem Spatel aus dem Schädel. Um dies zu erleichtern, schneiden Sie die Nerven an der Basis des Gehirns und die Riechkolben durch, wenn Sie dies nicht wünschen. Fixieren Sie das Gewebe über Nacht in 2% PFA bei 4 °C. Schützen Sie das Gewebe in 30% Saccharose (in PBS) für mindestens 48 h bei 4 °C, bis das Gewebe zu Boden sinkt. Das Gewebe bei -80 °C einfrieren. Schneiden Sie das Hirngewebe mit einem Kryostaten in 14 μm dicke koronale Schnitte. Durchführung von Immunfluoreszenzfärbungen mit Standardprotokollen 3,7Die Schnitte werden mit Blockierungspuffer (3 % Rinderserumalbumin [BSA], 0,1 % Triton X-100, in PBS) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Antigengewinnung durchführen (15 min in 10 mM Citratpuffer kochen, pH = 6,0, in Gläsern).HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, aber für nukleäre Antigene erforderlich. Auf Raumtemperatur bringen und mit primären Antikörpern gegen saures Gliafibrillenprotein (GFAP), Doppelcortin (Dcx), S100β und β-Catenin (siehe Materialtabelle) in Blockierungspuffer über Nacht bei 4 °C inkubieren. Inkubieren Sie für 2 h mit sekundären Antikörpern in PBS mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur nuklearen Gegenfärbung bei Raumtemperatur (siehe Materialtabelle). Montieren Sie die Deckgläser. 5. Prozessierung isolierter Zellen für die Immunfluoreszenz Die Zellen werden in mikroskopiekompatible 96-Well-Platten eingeteilt, die mit Poly-D-Lysin (100 μg/ml) beschichtet sind. Die Zellen 10 min in eiskaltem 2% PFA fixieren und 3x mit PBS waschen. Führen Sie die Immunfluoreszenz mit den Standardverfahren3,7 für PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 und ID3 durch (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Zellen in PBS + NaN3 (0,1%) bei 4 °C im Dunkeln. 6. Mikroskopie und Bildanalyse Nehmen Sie Bilder mit Epifluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie auf und führen Sie Zellzählungen mit Standard-Bildanalyse-Softwaretools wie Zellzählern durch.

Representative Results

Freigabe und Sammlung von NSCsNSCs der SWZ sind nur durch die Monoschicht der Ependymzellen vom Liquor getrennt, obwohl sie über interkalierende monofliliierte Fortsätze in direktem Kontakt mit dem ventrikulären Inhalt bleiben 8,9. Neuraminidase wirkt spezifisch auf Ependymzellen durch Spaltung von Sialinsäureresten und kann eine Denudation der Ventrikelwand induzieren. Dies führt zu einer Anhäufung von Neuroblasten au…

Discussion

Stamm- und Vorläuferzellen sind im Hirngewebe von Säugetieren relativ spärlich. Darüber hinaus befinden sich NSCs in Bereichen, die für einfache und sichere Biopsien unzugänglich sind (Ventrikelwände, Hippocampus). Daher war die einzige Möglichkeit, mit solchen Zellen experimentell zu arbeiten, bisher ihre postmortale Isolierung. Eine Methode, die die einmalige oder wiederholte Entnahme von NSCs und OPCs von lebenden Ratten ermöglicht, das sogenannte Melken, wird hier Schritt für Schritt beschrieben. Die Method…

Materials

Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX