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Methodenartikel

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

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DOI:

10.3791/65314

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14. April 2023

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Kontraktilität von Actomyosin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell- und Gewebemorphogenese. Es ist jedoch schwierig, die Actomyosin-Kontraktilität in vivo akut zu manipulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein optogenetisches System, das die Rho1-vermittelte Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen schnell hemmt und den sofortigen Verlust der Epithelspannung nach der Inaktivierung von Actomyosin in vivo aufdeckt.

Zusammenfassung

Kontraktile Kräfte, die durch Aktin und Nicht-Muskelmyosin II erzeugt werden ("Actomyosin-Kontraktilität"), sind entscheidend für morphologische Veränderungen von Zellen und Geweben auf mehreren Längenskalen, wie z. B. Zellteilung, Zellmigration, Epithelfaltung und verzweigte Morphogenese. Ein tiefgreifendes Verständnis der Rolle der Aktomyosin-Kontraktilität in der Morphogenese erfordert Ansätze, die eine schnelle Inaktivierung von Actomyosin ermöglichen, die mit herkömmlichen genetischen oder pharmakologischen Ansätzen nur schwer zu erreichen ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Verwendung eines CRY2-CIBN-basierten optogenetischen Dimerisierungssystems, Opto-Rho1DN, zur Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit präzisen zeitlichen und räumlichen Kontrollen. In diesem System ist CRY2 mit der dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN) fusioniert, während CIBN an der Plasmamembran verankert ist. Die Blaulicht-vermittelte Dimerisierung von CRY2 und CIBN führt zu einer schnellen Translokation von Rho1DN aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran, wo es Actomyosin durch Hemmung von endogenem Rho1 inaktiviert. Darüber hinaus wird in diesem Artikel ein detailliertes Protokoll für die Kopplung der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung von Aktomyosin mit der Laserablation vorgestellt, um die Rolle von Actomyosin bei der Erzeugung von Epithelspannung während der ventralen Furchenbildung von Drosophila zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auf viele andere morphologische Prozesse angewendet werden, die die Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit minimalen Modifikationen beinhalten. Insgesamt ist dieses optogenetische Werkzeug ein leistungsfähiger Ansatz, um die Funktion der Actomyosin-Kontraktilität bei der Kontrolle der Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

Einleitung

Die Actomyosin-Kontraktilität, die kontraktile Kraft, die von Nicht-Muskel-Myosin II (im Folgenden "Myosin") auf das F-Aktin-Netzwerk ausgeübt wird, ist eine der wichtigsten Kräfte bei der Veränderung der Zellform und der Steuerung der Morphogenese auf Gewebeebene 1,2. Zum Beispiel führt die Aktivierung der Actomyosin-Kontraktilität an der apikalen Domäne der Epithelzellen zu einer apikalen Verengung, die eine Vielzahl morphogenetischer Prozesse erleichtert, darunter Epithelfaltung, Zellextrusion, Delamination und Wundheilung 3,4,5,6,7 . Die Aktivierung von Myosin erfordert die Phosphorylierung seiner regulatorischen Leichtkette. Diese Modifikation mildert die hemmende Konformation der Myosinmoleküle, so dass sie bipolare Myosinfilamentbündel mit mehreren Kopfdomänen an beiden Enden bilden können. Die bipolaren Myosinfilamente treiben die antiparallele Bewegung der Aktinfilamente an und führen zur Erzeugung der Kontraktionskraft 1,8,9.

Die evolutionär konservierte kleine GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila) spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität in verschiedenen zellulären Kontexten10,11. Rho1 fungiert als bimolekularer Schalter, indem es entweder GTP (aktive Form) oder GDP (inaktive Form) bindet12. Der Kreislauf zwischen GTP- oder GDP-gebundenem Rho1 wird durch seine GTPase-aktivierenden Proteine (GAPs) und Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) reguliert13. GEFs erleichtern den Austausch von BIP gegen GTP und aktivieren so die Rho1-Aktivität. GAPs hingegen verstärken die GTPase-Aktivität von Rho1 und deaktivieren so Rho1. Aktiviertes Rho1 fördert die Kontraktilität von Aktomyosin, indem es mit seinen nachgeschalteten Effektoren, der Rho-assoziierten Kinase (Rok) und Diaphanous14, interagiert und diese aktiviert. Rok induziert die Myosinaktivierung und die Aktomyosinkontraktilität durch Phosphorylierung der regulatorischen leichten Kette von Myosin15. Darüber hinaus hemmt Rok auch die Myosin-regulatorische Leichtkettenphosphatase und fördert somit die Myosin-Filament-Assemblierung16 weiter. Rok kann auch LIM-Kinasen phosphorylieren, die, wenn sie aktiviert werden, den Aktinabbau verhindern, indem sie den Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin17,18 phosphorylieren und hemmen. Diaphanous ist ein Aktinnukleator der Forminfamilie, der die Aktinpolymerisation fördert und eine Basis für die Interaktion von Myosin mit 19,20,21 bietet.

Während die zellulären Mechanismen, die die Kontraktilität von Actomyosin aktivieren, gut aufgeklärt sind, ist unser Verständnis seiner Funktion bei der Regulierung des dynamischen Gewebeumbaus noch unvollständig. Um diese Wissenslücke zu schließen, sind Ansätze erforderlich, die Actomyosin an bestimmten Geweberegionen in vivo schnell inaktivieren und die unmittelbaren Auswirkungen auf das Verhalten und die Eigenschaften des Gewebes aufzeichnen können. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur akuten Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität während der Einstülpung des Drosophila-Mesoderms, gefolgt von der Messung der Epithelspannung mittels Laserablation. Während der Gastrulation von Drosophila erleiden die ventral lokalisierten Mesoderm-Vorläuferzellen eine apikale Verengung und invaginatieren von der Oberfläche des Embryos, indem sie eine anterior-posterior orientierte Furche bilden22,23. Die Bildung ventraler Furchen dient seit langem als Modell für die Untersuchung des Mechanismus der Epithelfaltung. Die Bildung der ventralen Furchen wird durch das dorsal-ventrale Mustersystem in Drosophila 24,25,26,27 gesteuert. Die Expression von zwei Transkriptionsfaktoren, Twist und Snail, die sich auf der ventralen Seite des Embryos befinden, steuert die ventrale Furchenbildung und spezifiziert das Schicksal der mesodermalen Zellen28. Twist und Snail aktivieren die Rekrutierung des Rho1 GEF RhoGEF2 an die Spitze der Mesoderm-Vorläuferzellen über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptorweg und ein RhoGEF2-Adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Als nächstes aktiviert RhoGEF2 Myosin auf der gesamten apikalen Oberfläche des potenziellen Mesoderms über den Rho-Rho-Kinase-Signalweg 34,35,36,37,38,39. Aktiviertes Myosin bildet ein suprazelluläres Actomyosin-Netzwerk auf der gesamten apikalen Oberfläche des Mesoderm-Primordiums, dessen Kontraktionen die apikale Verengung vorantreiben und zu einem schnellen Anstieg der apikalen Gewebespannung führen 14,37,40.

Das in diesem Protokoll beschriebene optogenetische Werkzeug, Opto-Rho1DN, hemmt die Kontraktilität von Actomyosin durch Blaulicht-abhängige Plasmamembranrekrutierung einer dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN)41. Eine T19N-Mutation in Rho1DN eliminiert die Fähigkeit des mutierten Proteins, GDP gegen GTP auszutauschen, und macht das Protein somit dauerhaft inaktiv34. Eine nachfolgende Mutation in Rho1DN, C189Y, eliminiert dessen naives Membran-Targeting-Signal42,43. Wenn Rho1DN in die Plasmamembran infundiert wird, bindet es an Rho1-GEFs und staut sie, wodurch die Aktivierung von Rho1 sowie die Rho1-vermittelte Aktivierung von Myosin und Aktin blockiertwerden 34,44. Die Rekrutierung von Rho1DN in der Plasmamembran erfolgt durch ein lichtabhängiges Dimerisierungsmodul, das von Cryptochrom 2 und seinem Bindungspartner CIB1 abgeleitet ist. Cryptochrom 2 ist ein durch blaues Licht aktivierter Cryptochrom-Photorezeptor in Arabidopsis thaliana45. Cryptochrom 2 bindet nur im photoangeregten Zustand an CIB1, ein basisches Helix-Schleifen-Helix-Protein45. Später wurde festgestellt, dass die konservierte N-terminale Photolyase-Homologie-Region (PHR) von Cryptochrom 2 (CRY2PHR, im Folgenden als CRY2 bezeichnet) und die N-terminale Domäne (aa 1-170) von CIB1 (im Folgenden CIBN) für die lichtinduzierte Dimerisierung wichtig sind46. Opto-Rho1DN besteht aus zwei Komponenten. Die erste Komponente ist das CIBN-Protein, das mit einem CAAX-Anker fusioniert ist, der das Protein an der Plasmamembran47 lokalisiert. Die zweite Komponente ist mCherry-markiertes CRY2, das mit Rho1DN41 fusioniert ist. In Abwesenheit von blauem Licht verbleibt CRY2-Rho1DN im Zytoplasma. Nach Stimulation durch blaues Licht wird CRY2-Rho1DN durch die Wechselwirkung zwischen membranverankertem CIBN und angeregtem CRY2 auf die Plasmamembran gerichtet. Opto-Rho1DN kann durch ultraviolettes A-Licht (UVA) und blaues Licht (400-500 nm, maximale Aktivierung bei 450-488 nm) oder durch einen gepulsten Laser mit 830-980 nm aktiviert werden, wenn eine Zwei-Photonen-Stimulation durchgeführtwird 41,46,47,48. Daher wird Opto-Rho1DN durch Wellenlängen stimuliert, die normalerweise für die Anregung von GFP verwendet werden (488 nm für die Einzelphotonen-Bildgebung und 920 nm für die Zwei-Photonen-Bildgebung). Im Gegensatz dazu stimulieren Wellenlängen, die üblicherweise für die Anregung von mCherry verwendet werden (561 nm für die Einzelphotonen-Bildgebung und 1.040 nm für die Zwei-Photonen-Bildgebung), das optogenetische Modul nicht und können daher für die Bildgebung vor der Stimulation verwendet werden. Das Protokoll beschreibt die Ansätze, die verwendet werden, um das Risiko einer unerwünschten Stimulation während der Probenmanipulation zu minimieren.

Die Laserablation wurde in großem Umfang eingesetzt, um Spannungen in Zellen und Geweben zu erkennen und zu messen49. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Zwei-Photonen-Laserablation unter Verwendung eines Femtosekunden-Nahinfrarotlasers bei entsprechender Kontrolle der Laserintensität einige subzelluläre Strukturen (z. B. kortikale Actomyosin-Netzwerke) physikalisch beeinträchtigen kann, ohne eine Plasmamembran-Raptur zu verursachen50,51. Wenn das Gewebe unter Spannung steht, führt die Laserablation einer interessierenden Region innerhalb des Gewebes zu einem sofortigen Rückstoß der an die abgetragene Region angrenzenden Zellen nach außen. Die Rückstoßgeschwindigkeit ist eine Funktion der Größe der Spannung und der Viskosität des Mediums (Zytoplasma), das die Strukturen umgibt, die dem Rückstoß ausgesetzt sind49. Aufgrund der überlegenen Eindringtiefe der Nahinfrarotlaser und der Möglichkeit, eine gut begrenzte fokale Ablation zu erreichen, ist die Zwei-Photonen-Laserablation besonders nützlich für die Erkennung von Gewebespannungen in vivo. Wie in diesem Protokoll gezeigt, kann diese Methode leicht mit der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung der Actomyosin-Kontraktilität kombiniert werden, um den direkten Einfluss der Rho1-abhängigen zellulären Kontraktilität auf die Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

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Protokoll

1. Aufstellen der genetischen Kreuzung und Vorbereiten des Eizellentnahmebechers

  1. Ausgewählte weibliche Fliegen (jungfräulich) aus der optogenetischen Linie UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) auf einem CO2 -Pad unter einem Stereomikroskop und eine Kreuzung mit männlichen Fliegen aus der mütterlichen GAL4-Treiberlinie 67 Sqh-mCherry; 15 E-Cadherin-GFP.
    ANMERKUNG: Die 67 und 15 stehen für maternales Tubulin-GAL4, das in das zweite (II) bzw. dritte (III) Chromosom eingefügt ist,52. Die in diesem Protokoll verwendete GAL4-Linie exprimiert auch die mCherry-markierte regulatorische Myosin-Leichtkette Sqh (Spaghettikürbis)37 und GFP-markiertes E-Cadherin53. Fliegen aus der optogenetischen Linie können noch FM7- und TM6-Balancer-Chromosomen enthalten. Fliegen aus der mütterlichen GAL4-Treiberlinie können noch die CyO- und TM3-Balancer-Chromosomen enthalten.
  2. Wählen Sie nach ~10 Tagen weibliche F1-Fliegen mit folgendem Genotyp aus: UASp-CIBNpm/+; 67 qm Kirsche/+; 15 E-Cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Stellen Sie einen Eiersammelbecher mit den männlichen Fliegen auf.
    1. Stellen Sie sicher, dass die weiblichen Fliegen mit dem richtigen Genotyp keine Balancer-Chromosomen enthalten (d. h. sie sollten keine gelockten Flügel [Cy], kurze Borsten [Sb], balken- oder nierenförmige Augen [B] oder extrahumerale Borsten [Hu] enthalten), die Marker für die CyO-, TM3-, FM7- und TM6-Balancer sind, die bei der Erzeugung der Stämme verwendet werden. Decken Sie die Tasse mit einem Apfelsaftteller ab, auf dessen Oberfläche ein Hauch frischer Hefepaste liegt.
      HINWEIS: Bei F1-Weibchen werden die optogenetischen Komponenten mütterlich exprimiert. Daher müssen die F1-Weibchen, die für die Einrichtung des Bechers verwendet werden, keine Jungfrauen sein. Es wird empfohlen, männliche Fliegen aus der gleichen F1-Population für den Becher zu verwenden.
  3. Bewahren Sie den Becher in einem mit Aluminiumfolie bedeckten Karton auf, um ein mögliches Austreten von Licht aus der Umgebung zu vermeiden. Wechseln Sie die Apfelsaftplatte jeden Tag für Tassen, die bei Raumtemperatur (~21-23 °C) aufbewahrt werden, oder alle zwei Tage für Tassen, die bei 18 °C aufbewahrt werden.
    1. Klopfen Sie den Becher unmittelbar vor dem Tellerwechsel auf eine ebene Fläche (z. B. Tischplatte), um die Fliegen am Boden des Bechers zu halten und zu verhindern, dass sie entweichen. Wechseln Sie den Apfelsaftteller in einem dunklen Raum und verwenden Sie eine Stirnlampe mit rotem Licht zur Beleuchtung (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Um die Expression der Konstrukte zu erhöhen, die unter der Kontrolle von maternalem Tubulin-GAL4 und UASp stehen, wird empfohlen, den Becher vor der Embryonenentnahme mindestens 3 Tage lang bei 18 °C zu halten. Diese Inkubationszeit ermöglicht es den Fliegen auch, sich an den Becher anzupassen und sich gut mit der Hefepaste zu ernähren, um eine optimale Eiproduktion zu erreichen.

2. Entnahme der Embryonen im gewünschten Stadium und Vorbereitung auf die optogenetische Stimulation

HINWEIS: Alle Schritte der Probenentnahme und -vorbereitung müssen in einem dunklen Raum durchgeführt werden, wobei ein "sicheres Licht" (z. B. rotes Licht) für die Beleuchtung verwendet werden muss. Die optogenetischen Komponenten reagieren sehr empfindlich auf Umgebungslicht. Schon die geringste Einwirkung von Umgebungslicht führt zu einer vorzeitigen Stimulation der Probe. Typischerweise verursachen Lichter im grün-roten Bereich (>532 nm) keine unerwünschte Stimulation.

  1. Für die Entnahme von Embryonen in der frühen Embryogenese wird 8 bis 16 Stunden vor der Embryonenentnahme (bei 18 °C) ein neuer Apfelsaftteller auf den Becher gelegt.
  2. Wechseln Sie zum Zeitpunkt der Embryonenentnahme die Apfelsaftplatte. Beschriften Sie die vom Becher abgenommene Platte und bedecken Sie die Oberfläche der Platte mit einer dünnen Schicht Halogenkohlenstofföl 27 (siehe Materialtabelle). Warten Sie 30-60 s, bis die Eierschale durchsichtig wird.
  3. Platzieren Sie eine orange-rote Kunststoffabschirmung (siehe Materialtabelle) auf dem Tisch eines aufrechten Stereoskops. Die Platzierung der orange-roten Abschirmung verhindert eine unerwünschte Stimulation während der Probenbeleuchtung, indem die blau-grünen Wellenlängen des transmittierten Lichts blockiert werden.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wird ein aufrechtes Stereoskop für die Embryonenentnahme verwendet (siehe Materialtabelle).
  4. Den Apfelsaftteller auf das orangerote Schild stellen. Schalten Sie das Durchlicht des Stereomikroskops ein, um die Probe zu beleuchten. Entnehmen Sie 5-15 Embryonen im entsprechenden Stadium mit einer Pinzette von der Apfelsaftplatte. Drücken Sie die Embryonen nicht mit der Pinzette zusammen.
    HINWEIS: In diesem Protokoll sollte sich der entsprechende Embryo im frühen bis mittleren Zellularisierungsstadium befinden. Der Embryo sollte in diesem Stadium ein dunkles, undurchsichtiges Eigelb haben, das von einer klaren, gleichmäßigen Periplasmaschicht umgeben ist, die die sich bildenden Blastodermzellen enthält. Die Vorderkante der Spaltfurchen ("Zellularisierungsfront"), die als durchgehende Linie parallel zur Oberfläche des Embryos erscheint, sollte nicht über die Hälfte der Tiefe des Periplasmas hinausgehen.
  5. Tupfen Sie die Embryonen vorsichtig auf ein Stück Papiertuch (~1,5 cm × 1,5 cm), um überschüssiges Öl mit der Pinzette von den Embryonen zu entfernen.
  6. Geben Sie einige Tropfen frisch zubereitetes 40%iges Bleichmittel (~3% Natriumhypochlorit; siehe Materialtabelle) mit einer Plastiktransferpipette in ein neues kleines quadratisches Stück Papiertuch (~1,5 cm × 1,5 cm), so dass das Papiertuch mit einer dünnen Schicht Bleichmittel bedeckt ist. Übertragen Sie den Embryo mit der Pinzette vom trockenen Papiertuch auf das mit Bleichmittel getränkte Papiertuch und stellen Sie sicher, dass die Embryonen in Bleichmittel getränkt sind. Warten Sie 2-4 Minuten, bis der Embryo dechorioniert ist.
  7. Tupfen Sie nach der Dechorionation mit der Pinzette das quadratische Papiertuch auf ein großes Stück Seidenpapier, um überschüssiges Bleichmittel zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Seite mit den Embryonen nach oben zeigt.
  8. Um die Embryonen abzuspülen, weichen Sie das quadratische Papiertuch mit der Pinzette vorsichtig in einem Tropfen deionisiertem Wasser ein und tupfen Sie es schnell auf ein großes Stück Seidenpapier. Wiederholen Sie diesen Vorgang achtmal, um sicherzustellen, dass alle Bleichmittelrückstände entfernt werden.
  9. Verwenden Sie ein Wimpernwerkzeug, um den Embryo vom Papiertuch in eine 35 mm Glasbodenschale zu übertragen (siehe Materialtabelle). Geben Sie deionisiertes Wasser in die Schale, um die Embryonen vollständig zu bedecken. Feinabstimmung der Position und Ausrichtung der Embryonen mit dem Wimpernwerkzeug.
    HINWEIS: Nach der Dechorionation neigt der Embryo dazu, an der Oberfläche des Glases zu kleben und ist unbeweglich, ohne gestört zu werden, so dass es nicht notwendig ist, eine zusätzliche Behandlung (wie z.B. Klebstoff) anzuwenden, um den Embryo auf der Glasbodenschale zu immobilisieren.
  10. Legen Sie die 35-mm-Glasbodenschale mit den Embryonen in eine lichtdichte schwarze Box (siehe Materialtabelle), um die Probe während des Transfervorgangs vor Lichteinwirkung zu schützen. Bringen Sie die Box mit dem Multiphotonenmikroskop in den Raum.

3. Optogenetische Stimulation, Laserablation und Bildgebung des Embryos

ANMERKUNG: Das in diesem Experiment verwendete Multiphotonensystem (siehe Materialtabelle) ist in der Lage, gleichzeitig zwei Wellenlängen abzubilden. Es enthält auch eine Photostimulationseinheit mit einem 458-nm-Laser und einen separaten Galvanometer-Scanner, der eine Photoaktivierung/Stimulation innerhalb einer definierten Region of Interest (ROI) ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass der 920-nm-Laser, der zur Anregung von grün-gelb fluoreszierenden Proteinen verwendet wird, Opto-Rho1DN stimuliert, wenn auch langsamer als die durch blaue Laser vermittelte Stimulation.

  1. Decken Sie das Multiphotonenmikroskop mit einem lichtdichten schwarzen Tuch ab (siehe Materialtabelle), um eine unerwünschte Stimulation der Embryonen während des Probenaufbaus und der Bildgebung zu vermeiden.
    HINWEIS: Der gleiche Ansatz wird bei der regulären Multiphotonen-Bildgebung verwendet, um die lichtempfindlichen Detektoren des Mikroskops zu schützen.
  2. Schalten Sie das Raumlicht und die Computerbildschirme aus. Schalten Sie den Touchpanel-Controller aus, indem Sie in der Software unter "Hintergrundbeleuchtung des Touchpanel-Controllers" auf OFF klicken. Stellen Sie sicher, dass sich kein anderes Umgebungslicht im Raum befindet.
    1. Öffnen Sie die Vorderseite der schwarzen Stoffabdeckung des Mikroskops. Nehmen Sie die 35-mm-Glasbodenschale aus der Blackbox und stellen Sie sie auf den Mikroskoptisch.
  3. Beleuchten Sie Embryonen mit einem grünen Licht, das normalerweise als Anregungslicht für die Epifluoreszenz verwendet wird. Schalten Sie dazu die Fluoreszenzbeleuchtung ein, wählen Sie in der Software unter dem Bedienfeld "Okular" die Option "Okular" und ändern Sie den "Würfelrevolver" auf 4:TRITC. Verwenden Sie das Okular, um den interessierenden Embryo zu identifizieren und in den Fokus zu rücken.
    HINWEIS: Die Grünlichtvisualisierung wird erreicht, indem ein von der Fluoreszenzbeleuchtungseinheit erzeugtes weißes Licht durch einen eingebauten Standard-TRITC-Filterwürfel geleitet wird, der einen 528-553-nm-Anregungsfilter, einen 565-nm-Strahlteiler und einen 590-650-nm-Emissionsfilter enthält. Andere nicht-blaue Lichter sollten ebenfalls gut für die Probenbeleuchtung geeignet sein. Das Tragen eines Augenschutzes ist in diesem Schritt nicht notwendig, da das Anregungslicht eine geringe Intensität hat und nicht auf das Okular gerichtet wird. Der Embryo erscheint aufgrund der Autofluoreszenz gleichmäßig rot.
  4. Schließen Sie die schwarze Stoffabdeckung, so dass die Probe vollständig vor Licht geschützt ist. Schalten Sie den Computerbildschirm ein, um auf die Software zuzugreifen, mit der das Mikroskop gesteuert wird. Ändern Sie das "Okular" in der Software für die Bildaufnahme auf LSM .
  5. Führen Sie eine Laserablation an kontrollierten, nicht stimulierten Embryonen mit einem 25-fachen Wasserimmersionsobjektiv durch.
    1. Klicken Sie im "Tool-Fenster" der Software auf Bright Z, Sequence Manager und LSM Stimulation. Stellen Sie den Scannertyp auf Galvano und die Scangröße auf 512 × 512 ein. Schalten Sie CH1 und CH3 unter dem Feld "PMT-Einstellung" ein, um die Verwendung des 1.040-nm-Lasers zu ermöglichen, und klicken Sie auf Live × 4, um den Embryo zu visualisieren.
    2. Drehen Sie den Embryo mit der Rotationsfunktion in der Software so, dass die vordere und hintere Achse des Embryos vertikal ausgerichtet ist. Stellen Sie den Zoom auf 3 ein. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) mit dem Formwerkzeug unter "Scaneinstellungen" und legen Sie die Größe der ROI im Bedienfeld "Referenz" fest. Legen Sie die ROI auf 512 Pixel in der Breite und 100 Pixel in der Höhe (171 × 33 μm2) fest.
    3. Legen Sie die Erfassungsparameter für den Z-Stapel vor der Ablation fest.
      1. Registrieren Sie die Oberfläche des Embryos als 0 unter dem "Z-Abschnitt". Stellen Sie den Anfang auf 0 und das Ende auf 100 μm ein. Stellen Sie die Schrittweite auf 2 μm ein. Aktivieren Sie den Z-Erfassungsmodus, indem Sie Z auf der Registerkarte "Serie" aktivieren.
      2. Stellen Sie die Laserintensität von 1.040 nm ein, um sie mit der Funktion "Bright Z " linear von 3 % auf 7 % zu erhöhen.
      3. Speichern Sie die aktuelle Imaging-Einstellung als erste Aufgabe der Pipeline, indem Sie in "Sequence Manager" auf LSM klicken.
        HINWEIS: Der Z-Stapel vor der Ablation wird entnommen, um das Stadium des Embryos zu bestätigen. In diesem Experiment werden CRY2-Rho1DN-mCherry und Sqh-mCherry durch den 1.040-nm-Laser angeregt. Während der apikalen Konstriktion ist das Sqh-mCherry-Signal in der medioapikalen Region der ventralen mesodermalen Zellen verstärkt, während CRY2-Rho1DN-mCherry vor der Stimulation zytosolisch ist. Die Laserintensität, die für die Bildgebung vor und nach der Stimulation verwendet wird, wird empirisch anhand des Gleichgewichts zwischen dem optimalen Signal-Rausch-Verhältnis und der Vermeidung von Photobleaching bestimmt.
    4. Legen Sie die Aufnahmeparameter für den Film vor der Ablation fest.
      1. Löschen Sie alle vorhandenen ROI, um die Abbildung des gesamten 512 × 512 Pixelbereichs (171 × 171 μm 2, 3-facher Zoom) in der Nähe der ventralen Oberfläche des Embryos zu ermöglichen, wie in Schritt 3.5.2 beschrieben. Stellen Sie die Laserintensität von 1.040 nm auf 3 % ein.
      2. Aktivieren Sie die Zeit, und deaktivieren Sie Z unter dem Bedienfeld "Reihe". Behalten Sie das "Intervall" als FreeRun unter dem Bereich "Zeitraffer" bei. Stellen Sie den Zyklus auf 10 ein.
      3. Speichern Sie die aktuellen Einstellungen als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie in "Sequence Manager" auf LSM klicken.
        HINWEIS: Der Zweck dieser Aufgabe besteht darin, einen 10-Frame-Einzel-Z-Ebenen-Vorablationsfilm mit einem 1.040-nm-Laser für die Bildaufnahme zu erhalten. Die Bildaufnahmegeschwindigkeit beträgt ca. 1 s pro Bild.
    5. Stellen Sie die Parameter für die Laserablation ein.
      1. Definieren Sie einen 3D-Bereich von unmittelbar unterhalb der Vitellinmembran bis zu ~20 μm Tiefe für die Laserablation (Abbildung 1A). Legen Sie den Anfang des Z-Stapels als die Ebene fest, die sich unmittelbar unter der Vitellinmembran befindet, und das Ende als 20 μm tiefer als die Startebene. Stellen Sie die Schrittweite auf 1,5 μm ein.
        HINWEIS: Der ROI des abgetragenen Bereichs beträgt ~30 Pixel in der Breite und ~10 Pixel in der Höhe (~10 μm entlang der medial-lateralen Achse und ~3,3 μm entlang der A-P-Achse). Der Zweck der Ablation der Probe in mehreren Z-Ebenen besteht darin, sicherzustellen, dass die apikale Oberfläche der ventralen Zellen abgetragen wird. Dies ist besonders wichtig für die stimulierten Embryonen, da die ventralen Zellen nach der Rho1-Hemmung eine schnelle apikale Entspannung erfahren.
      2. Schalten Sie CH2 und CH4 unter dem Bedienfeld "PMT-Einstellung" ein, um die Verwendung des 920-nm-Lasers zu ermöglichen. Stellen Sie die Intensität des 920-nm-Lasers auf 30 % ein. Stellen Sie die Bildaufnahme mit dem 920-nm-Laser für einen einzelnen Z-Stapel innerhalb des in Schritt 3.5.5.1 definierten 3D-Bereichs für die Laserablation ein.
        HINWEIS: Die in diesem Schritt gewählte Laserintensität reicht aus, um das Gewebe abzutragen (wie durch den Geweberückstoß unmittelbar nach der Laserbehandlung angezeigt), schädigt aber die Plasmamembran nicht offensichtlich (wie durch das Fehlen von Brandflecken auf der Zellmembran angezeigt) (Abbildung 1B,C).
      3. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
    6. Legen Sie die Aufnahmeparameter für den Film nach der Ablation fest.
      1. Stellen Sie die Bildaufnahme für einen 100-Frame-Film mit einer einzelnen Z-Ebene nach der Ablation sowohl mit dem 1.040-nm- als auch mit dem 920-nm-Laser ein. Stellen Sie die Intensität des 1.040-nm-Lasers und des 920-nm-Lasers auf 3 % bzw. 0,3 % ein. Der in Schritt 3.5.4 angegebene Bereich wird mit identischer Bildaufnahmegeschwindigkeit abgebildet.
      2. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
        ANMERKUNG: Der Zweck der Speicherung der in den Schritten 3.5.3-3.5.6 beschriebenen Parameter als sequentielle Aufgaben im "Sequenz-Manager" vor jeder tatsächlichen Erfassung besteht darin, die Erfassung der unmittelbaren Gewebereaktion nach der Laserablation sicherzustellen.
    7. Wählen Sie unter "Erfassen" die Option "Sequenz" aus. Ändern Sie den Datenspeicherpfad und den Dateinamen nach Bedarf. Klicken Sie auf Bereit, und warten Sie, bis die Software die Pipeline initialisiert hat. Klicken Sie dann auf Starten , um die Pipeline auszuführen.
  6. Führen Sie eine Laserablation bei stimulierten Embryonen durch.
    1. Legen Sie die Erfassungsparameter für den Z-Stapel vor der Ablation fest, wie in den Schritten 3.5.1-3.5.3 beschrieben. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als erste Aufgabe der Pipeline, indem Sie in "Sequence Manager" auf LSM klicken.
    2. Stellen Sie Parameter für die optogenetische Stimulation innerhalb eines definierten ROI ein.
      1. Ändern Sie den Zoom auf 1 und wählen Sie eine ROI, die die ventrale Oberfläche des Embryos abdeckt (~512 × 300 μm2). Schalten Sie die CH1-CH4-Melder aus.
      2. Klicken Sie auf LSM-Stimulation. Deaktivieren Sie Kontinuierlich innerhalb der Dauer und geben Sie 12 s ein. Prüfen Sie die 458 nm mit 0,3 % Laserintensität.
      3. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im 'Sequence Manager' auf Stimulation klicken.
        HINWEIS: Eine schnellere Stimulation kann durch eine Erhöhung der Laserintensität von 458 nm erreicht werden. Bei Verwendung höherer Laserintensitäten kann das gestreute Laserlicht jedoch den an den ROI angrenzenden Bereich stimulieren, was nicht ideal ist, wenn eine räumlich begrenzte Stimulation erforderlich ist.
    3. Stellen Sie eine Wartezeit von 3 Minuten nach der Stimulation ein, um eine vollständige Inaktivierung von Myosin und den Abbau von apikalem F-Aktin zu gewährleisten und eine statische Gewebemorphologie vor der Laserablation zu erreichen. Dies erreichen Sie, indem Sie unter "Sequenzmanager" auf Warten /Pause klicken und die gewünschte Zeit für "Warten" einstellen.
      HINWEIS: Die Rekrutierung von CRY2-Rho1DN-mCherry an die Membran, die durch eine einzige Stimulationsrunde (0,3% 458 nm Laser für 12 s) verursacht wird, ist 10-15 Minuten nach der Stimulation deutlich nachweisbar. Dies stimmt mit der veröffentlichten Dissoziationshalbzeit von ~9 min47 überein.
    4. Legen Sie die Aufnahmeparameter für den einzelnen Z-Ebenen-Vorablationsfilm fest, wie in Schritt 3.5.4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass sowohl der 1.040-nm- als auch der 920-nm-Laser für die Bildaufnahme verwendet werden. Schalten Sie die CH1-CH4-Melder ein. Stellen Sie die Intensität des 1.040-nm-Lasers und des 920-nm-Lasers auf 3 % bzw. 0,3 % ein. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
    5. Stellen Sie die Parameter für die Laserablation ein, wie in Schritt 3.5.5 beschrieben. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
    6. Legen Sie die Aufnahmeparameter für den einzelnen Film nach der Ablation auf der Z-Ebene fest, wie in Schritt 3.5.6 beschrieben. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
    7. Wählen Sie unter "Erfassen" die Option "Sequenz" aus. Ändern Sie den Datenspeicherpfad und den Dateinamen nach Bedarf. Klicken Sie auf Bereit, und warten Sie, bis die Software die Pipeline initialisiert hat. Klicken Sie dann auf Starten, um die Pipeline auszuführen.

4. Quantifizierung der Rückstoßrate des Gewebes nach Laserablation

  1. Öffnen Sie den Film nach der Ablation in ImageJ.
  2. Zeichnen Sie eine kleine ROI entlang der ventralen Mittellinie, die den abgetragenen Bereich abdeckt, mit dem Rechteckauswahl-Werkzeug . Die Breite des ROI beträgt neun Pixel. Die Höhe des ROI ist so eingestellt, dass der ROI groß genug ist, um den gesamten Bereich des Geweberückstoßes nach der Laserablation abzudecken.
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte "Bild" auf Duplizieren. Aktivieren Sie im Pop-up-Fenster die Option Stapel duplizieren und klicken Sie dann auf OK, um den Stapel innerhalb der ausgewählten ROI zu duplizieren.
  3. Generieren Sie eine Montage aus dem duplizierten Stapel über Bild- > Stapel > Montage erstellen. Legen Sie im Pop-up-Fenster die Zeilennummer auf 1 und die Spaltennummer auf die Gesamtzahl der Frames im Stapel (in diesem Fall 100 ) fest.
  4. Messen Sie die A-P-Breite des abgetragenen Bereichs über die Zeit aus der generierten Montage.
    1. Verwenden Sie das Multi-Point-Werkzeug in ImageJ, um die A-P-Grenzen des abgetragenen Bereichs für jeden Zeitpunkt in der Montage zu markieren.
    2. Speichern Sie die Koordinaten der markierten Punkte mit Datei > Speichern als > XY-Koordinaten.
    3. Importieren Sie die gemessenen XY-Koordinaten in MATLAB. Berechnen Sie die A-P-Breite des abgetragenen Bereichs für jeden Zeitpunkt, indem Sie die Y-Koordinate der oberen Begrenzung von der Y-Koordinate der unteren Begrenzung subtrahieren.
  5. Bestimmen Sie die Rückstoßrate des Gewebes, indem Sie die ersten 20 s der "Breite über die Zeit"-Kurve mit der "polyfit"-Funktion in MATLAB in eine Linie einpassen. Geben Sie die Steigung der angepassten Linie als Rückstoßrate des Gewebes an.
  6. Führen Sie statistische Tests durch, um die Rückstoßrate des Gewebes zwischen den stimulierten und nicht stimulierten Proben zu vergleichen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, Daten von mindestens fünf Embryonen pro Erkrankung zu erhalten. Sowohl der zweiseitige Wilcoxon-Rangsummentest als auch der zweiseitige Schüler-t-Test können für statistische Vergleiche verwendet werden.

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Ergebnisse

In den nicht stimulierten Embryonen, die einer apikalen Konstriktion unterzogen wurden, wurde Sqh-mCherry in der medioapikalen Region der ventralen mesodermalen Zellen angereichert, während CRY2-Rho1DN-mCherry zytosolisch war (Abbildung 1A). Die Laserablation innerhalb der Verengungsdomäne führte zu einem raschen Geweberückstoß entlang der A-P-Achse (Abbildung 1B,C). In den stimulierten Embryonen wurde das CRY2-Rho1DN-mCherry-Signal in der Plasm...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschrieb den kombinierten Einsatz von Optogenetik und Laserablation, um Veränderungen der Gewebespannung unmittelbar nach der Inaktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität zu untersuchen. Das hier beschriebene optogenetische Werkzeug nutzt die dominante negative Form von Rho1 (Rho1DN), um die endogene Rho1- und Rho1-abhängige Actomyosin-Kontraktilität akut zu hemmen. Die vorherige Charakterisierung von Opto-Rho1DN im Zusammenhang mit der ventralen Furchenbildung von Drosophila zeigte, dass das We...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Die Autoren danken Ann Lavanway für die Unterstützung bei der Bildgebung. Die Autoren danken dem Wieschaus-Labor und dem De Renzis-Labor für die gemeinsame Nutzung der Reagenzien und dem Bloomington Drosophila Stock Center für die Fliegenbestände. Diese Studie wird durch den NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 und den American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 an BH unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
35 mm GlasbodenschaleMatTekP35G-1.5-10-CWird für die Probenvorbereitung
verwendet 60 mm & mal 15 mm Petrischale mit DeckelFalcon351007Wird für die Probenvorbereitung
verwendet Schwarzes Tuch zum Abdecken des MikroskopsOnlineNAWird verwendet, um unerwünschte Lichtstimulation zu vermeiden
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8,25% Natriumhypochlorit)VWR10028-048Wird für die Dechorination von Embryonen
verwendet CO2Pad Genesee Scientific59-114Wird für das Cross-Setup
verwendet ddH2ONANA Wirdfür die Probenvorbereitung verwendet
Dumont Style 5 PinzetteVWR102091-654Wird für die Probenvorbereitung
verwendet Wimpernwerkzeug (hergestellt aus reiner roter Zobel-Rundbürste #2)VWR22940-834Wird für die Probenvorbereitung
verwendet FluoView (Software)OlympusNAWird für die Bildaufnahme und optogenetische Stimulation
Halogenkohlenwasserstofföl 27Sigma AldrichH8773-100MLWird für die Visualisierung des Embryostadiums
verwendet ImageJ/FIJINIHNAWird für die Bildanalyse verwendet
MATLABMathWorksNAWird für die Bildanalyse verwendet
Nikon SMZ-745 StereoskopNikonNAWird für die Probenvorbereitung
verwendet Olympus FVMPE-RS Multiphotonenmikroskop mit InSight DS Dual-Line Ultrakurzpulslasern für simultane Dual-Wellenlängen-Multiphotonen-Bildgebung, einem 25x/NA1.05 Wasserimmersionsobjektiv (XLPLN25XWMP2) und einer IR/VIS-Stimulationseinheit für die Photoaktivierung/-stimulation. Dieses System ist zusätzlich mit einem TRITC-Filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M) und eine Fluoreszenzbeleuchtungseinheit, die weißes Licht emittiert.OlympusNAZur Bildaufnahme und optogenetischen Stimulation
SP Bel-Art Gefrierschrank aus Polypropylen mit 100 Plätzen (Schwarze, lichtdichte Box für den Probentransfer)VWR30621-392Zur Vermeidung unerwünschter Lichtstimulation
UV-Filterabschirmung für FM1403 Fluore (orange-rote Kunststoffabschirmung)BoliopticsFM14036151Zur Vermeidung unerwünschter Lichtstimulation
VITCHELO V800 Stirnlampe mit weißer und roter LED-BeleuchtungAmazonNAWird verwendet, um unerwünschte Lichtstimulation zu vermeiden
verwendet

Referenzen

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Schlagwörter

Rho1 InhibitionLaserablationGewebemorphogeneseBildung der VentralfurcheCRY2 CIBN Systemapikale Konstriktion
Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen
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