Methodenartikel

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

DOI:

10.3791/65316

⸱

21. April 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die räumlich-zeitliche Gentranskription wird durch distale regulatorische Elemente wie Enhancer und Silencer streng reguliert, die auf die physische Nähe zu ihren Zielgenpromotoren angewiesen sind, um die Transkription zu kontrollieren. Obwohl diese regulatorischen Elemente leicht zu identifizieren sind, sind ihre Zielgene schwer vorherzusagen, da die meisten von ihnen zelltypspezifisch sind und in der linearen Genomsequenz durch Hunderte von Kilobasen getrennt sein können, wodurch andere Nicht-Zielgene übersprungen werden. Seit einigen Jahren ist Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) der Goldstandard für die Assoziation von distalen regulatorischen Elementen mit ihren Zielgenen. PCHi-C ist jedoch auf die Verfügbarkeit von Millionen von Zellen angewiesen, was die Untersuchung seltener Zellpopulationen, wie sie üblicherweise aus primären Geweben gewonnen werden, verbietet. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) entwickelt, eine kostengünstige und anpassbare Methode zur Identifizierung des Repertoires an distalen regulatorischen Elementen, die jedes Gen des Genoms steuern. liCHi-C basiert auf einem ähnlichen experimentellen und rechnerischen Rahmen wie PCHi-C, aber durch minimale Röhrchenwechsel, Modifikation der Reagenzienkonzentration und -volumina sowie Austausch oder Eliminierung von Schritten wird ein minimaler Materialverlust während des Bibliotheksaufbaus verursacht. Insgesamt ermöglicht liCHi-C die Untersuchung der Genregulation und der raumzeitlichen Genomorganisation im Kontext der Entwicklungsbiologie und der zellulären Funktion.

Einleitung

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Die zeitliche Genexpression treibt die Zelldifferenzierung und letztendlich die Entwicklung von Organismen voran, und ihre Veränderung steht in engem Zusammenhang mit einer Vielzahl von Krankheiten 1,2,3,4,5. Die Gentranskription wird durch die Wirkung von regulatorischen Elementen fein reguliert, die als proximal (d. h. Genpromotoren) und distale (z. B. Enhancer oder Silencer) klassifiziert werden können, von denen letztere häufig weit von ihren Zielgenen entfernt sind und physisch mit ihnen durch Chromatinschleifen interagieren, um die Genexpression zu modulieren 6,7,8.

Die Identifizierung distaler regulatorischer Regionen im Genom ist eine Angelegenheit, über die man sich weitgehend einig ist, da diese Regionen spezifische Histonmodifikationenaufweisen 9,10,11 und spezifische Transkriptionsfaktor-Erkennungsmotive enthalten, die als Rekrutierungsplattformen für sie fungieren12,13,14. Außerdem haben sie im Fall von Enhancern und Super-Enhancern 15,16 auch eine geringe Nukleosomenbelegung 17,18 und werden in nicht-kodierende eRNAs transkribiert 19,20.

Nichtsdestotrotz sind die Zielgene der einzelnen distalen regulatorischen Elemente schwieriger vorherzusagen. In den meisten Fällen sind Interaktionen zwischen distalen regulatorischen Elementen und ihren Zielen zelltyp- und stimulusspezifisch 21,22, erstrecken sich über Hunderte von Kilobasen, überbrücken andere Gene in jede Richtung 23,24,25 und können sogar innerhalb von intronischen Regionen ihres Zielgens oder anderer nicht dazwischenliegender Gene lokalisiert werden 26,27. Darüber hinaus können distale regulatorische Elemente auch mehr als ein Gen gleichzeitig steuern und umgekehrt28,29. Diese Positionskomplexität erschwert es, regulatorische Zusammenhänge zwischen ihnen zu lokalisieren, und daher bleiben die meisten Ziele der einzelnen regulatorischen Elemente in jedem Zelltyp unbekannt.

In den letzten Jahren gab es einen bedeutenden Boom bei der Entwicklung von Techniken zur Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) zur Untersuchung von Chromatin-Interaktionen. Die am weitesten verbreitete von ihnen, Hi-C, ermöglicht es, eine Karte aller Interaktionen zwischen jedem Fragment des Genoms einer Zelle zu erstellen30. Um jedoch signifikante Wechselwirkungen auf der Ebene der Restriktionsfragmente zu erkennen, verlässt sich Hi-C auf eine ultratiefe Sequenzierung, die seine Verwendung zur routinemäßigen Untersuchung der regulatorischen Landschaft einzelner Gene verbietet. Um diese wirtschaftlichen Einschränkungen zu überwinden, haben sich mehrere anreicherungsbasierte 3C-Techniken herausgebildet, wie z. B. ChIA-PET31, HiChIP 32 und sein Gegenstück HiCuT33 mit geringem Input. Diese Techniken beruhen auf der Verwendung von Antikörpern zur Anreicherung für genomweite Interaktionen, die durch ein bestimmtes Protein vermittelt werden. Nichtsdestotrotz ist das Alleinstellungsmerkmal dieser 3C-Techniken auch der Fluch ihrer Anwendung; Anwender verlassen sich auf die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Antikörpern für das interessierende Protein und können Bedingungen nicht vergleichen, unter denen die Bindung des Proteins dynamisch ist.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) ist eine weitere anreicherungsbasierte 3C-Technik, die diese Einschränkungen umgeht34,35. Durch den Einsatz eines biotinylierten RNA-Sondenanreicherungssystems ist PCHi-C in der Lage, genomweite hochauflösende Bibliotheken von Genomregionen zu erstellen, die mit 28.650 humanen oder 27.595 mausannotierten Genpromotoren interagieren, die auch als Promotor-Interaktom bekannt sind. Dieser Ansatz ermöglicht es, signifikante langreichweitige Wechselwirkungen bei der Auflösung von Restriktionsfragmenten sowohl von aktiven als auch von inaktiven Promotoren zu detektieren und Promotor-Interaktome zwischen allen Bedingungen unabhängig von der Dynamik von Histonmodifikationen oder Proteinbindungen robust zu vergleichen. PCHi-C wurde in den letzten Jahren häufig eingesetzt, um Promotor-Interaktom-Reorganisationen während der Zelldifferenzierung zu identifizieren 36,37, den Wirkmechanismus von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren38,39 und neue potenzielle Gene und Signalwege zu entdecken, die bei Krankheiten durch nicht-kodierende Varianten dereguliert werden 40,41,42,43,44,45,46,47,48, daneben neue nicht-kodierende Treibermutationen49,50. Außerdem kann diese Technik durch einfaches Modifizieren des Erfassungssystems entsprechend der biologischen Fragestellung angepasst werden, um jedes Interaktom (z. B. das Enhancer-Interaktom 51 oder das Interaktom einer Sammlung von nicht-kodierenden Veränderungen41, 52) abzufragen.

PCHi-C ist jedoch auf mindestens 20 Millionen Zellen angewiesen, um die Technik durchzuführen, was die Untersuchung knapper Zellpopulationen, wie sie häufig in der Entwicklungsbiologie und in klinischen Anwendungen verwendet werden, verhindert. Aus diesem Grund haben wir Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) entwickelt, eine neue kostengünstige und anpassbare Methode, die auf dem experimentellen Rahmen von PCHi-C basiert, um hochauflösende Promotor-Interaktome mit geringem Zellinput zu erzeugen. Durch die Durchführung des Experiments mit minimalen Röhrchenänderungen, dem Austausch oder der Eliminierung von Schritten aus dem ursprünglichen PCHi-C-Protokoll, der drastischen Reduzierung des Reaktionsvolumens und der Änderung der Reagenzienkonzentrationen wird die Komplexität der Bibliothek maximiert und es ist möglich, qualitativ hochwertige Bibliotheken mit nur 50.000 Zellen zu generieren53.

Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) wurde mit PCHi-C verglichen und verwendet, um die Neuverdrahtung des Promotor-Interaktoms während der Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Zellen aufzuklären, potenzielle neue krankheitsassoziierte Gene und Signalwege zu entdecken, die durch nicht-kodierende Veränderungen dereguliert werden, und Chromosomenanomalien zu erkennen53. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll und die verschiedenen Qualitätskontrollen durch die Technik werden hier bis zur endgültigen Generierung der Bibliotheken und ihrer rechnerischen Analyse detailliert beschrieben.

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Protokoll

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Um einen minimalen Materialverlust zu gewährleisten, (1) arbeiten Sie mit DNA-Röhrchen und -Spitzen mit geringer Bindung (siehe Materialtabelle), (2) platzieren Sie Reagenzien an der Röhrchenwand, anstatt die Spitze in die Probe einzuführen, und (3) mischen Sie die Probe nach Möglichkeit durch Inversion, anstatt die Probe auf und ab zu pipettieren, und schleudern Sie sie anschließend nach unten, um die Probe zu gewinnen.

1. Fixierung der Zellen

  1. Zellen, die in Suspension wachsen
    1. Ernten Sie 50.000 bis eine Million Zellen und legen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen mit geringer DNA-Bindung.
      HINWEIS: Die für die vorliegende Studie verwendeten Zelltypen sind im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" aufgeführt.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 min lang bei 600 x g (bei 4 °C) mit einer Festwinkelrotorzentrifuge und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) bei Raumtemperatur.
    4. Fügen Sie 143 μl methanolfreies 16%iges Formaldehyd hinzu, um eine Konzentration von 2% zu erreichen, und mischen Sie.
    5. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang, während Sie sie bei Raumtemperatur drehen, um die Zellen zu fixieren.
      Anmerkungen: Versuchen Sie, mit der 10-minütigen Inkubationszeit so genau wie möglich zu sein. Eine Über- oder Unterfixierung der Zellen kann zu einer Verschlechterung der Qualität der Bibliothek führen.
    6. Die Reaktion durch Zugabe von 164 μl eiskaltem 1 M Glycin abschrecken und mischen. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang und drehen Sie sie bei Raumtemperatur.
    7. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis und mischen Sie sie alle ~5 Minuten durch Inversion.
    8. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) mit einer Festwinkelrotorzentrifuge und entfernen Sie den Überstand.
    9. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1 ml eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren.
    10. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) und entfernen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Die pelletierten Zellen können in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und bei -80 °C gelagert werden.
  2. Adhärente Zellen
    1. Waschen Sie die Zellen in der Kulturschale mit 1x PBS.
    2. Bereiten Sie bei Raumtemperatur genügend RPMI 1640 zu, ergänzt mit 10 % FBS und methanolfreiem 2 % Formaldehyd, um die Kulturschale zu bedecken.
    3. Geben Sie das zugesetzte Medium mit den Zellen in die Kulturschale und inkubieren Sie es 10 Minuten lang, wobei Sie es bei Raumtemperatur schaukeln, um die Zellen zu fixieren.
      Anmerkungen: Versuchen Sie, mit der 10-minütigen Inkubationszeit so genau wie möglich zu sein. Eine Über- oder Unterfixierung der Zellen kann zu einer Verschlechterung der Qualität der Bibliothek führen.
    4. Die Reaktion durch Zugabe von 1 M Glycin bis 0,125 M abschrecken und durch Schaukeln mischen.
    5. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang und schaukeln Sie sie bei Raumtemperatur.
    6. Die Zellen werden 15 min bei 4 °C weiter inkubiert, dabei alle 3-4 min geschaukelt.
    7. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit kaltem 1x PBS.
    8. Kratzen Sie die Zellen ab und übertragen Sie sie in ein 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung. Wischen Sie die Kulturschale mit 0,5-1 ml kaltem 1x PBS sauber.
    9. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) mit einer Festwinkelrotorzentrifuge und entfernen Sie den Überstand. Die pelletierten Zellen können in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und bei -80 °C gelagert werden.

2. Lyse und Verdauung

  1. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml kaltem Lysepuffer (Tabelle 1), um die Zellmembran aufzubrechen. Die Zugabe des Puffers allein sollte ausreichen, um die Zellen zu resuspendieren, aber sie können bei Bedarf durch Lichtwirbel weiter resuspendiert werden.
  2. 30 Minuten auf Eis inkubieren lassen, alle ~5 Minuten durch Inversion mischen. Zentrifugieren Sie die Kerne 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellkerne mit 500 μl kaltem 1,25-fachem Restriktionspuffer 2 (siehe Materialtabelle).
  3. Zentrifugieren Sie die Kerne 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellkerne in 179 μl 1,25-fachem Restriktionspuffer 2.
  4. 5,5 μl 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDB; siehe Materialtabelle) zugeben und mischen. Die Zellen können Klumpen bilden; Dies ist normal und muss durch Vortexing so weit wie möglich disaggregiert werden. Inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei 37 °C in einem Thermoblock unter Schütteln bei 950 U/min.
  5. Schrecken Sie das SDB ab, indem Sie 37,5 μl 10% Triton X-100 hinzufügen und mischen. Inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei 37 °C in einem Thermoblock unter Schütteln bei 950 U/min.
  6. Verdauen Sie das Chromatin, indem Sie 7,5 μl HindIII (100 U/μl; siehe Materialtabelle) hinzufügen und mischen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 °C in einem Thermoblock und schütteln Sie sie bei 950 U/min.
  7. Fügen Sie am nächsten Morgen weitere 2,5 μl HindIII (100 U/μL) hinzu und inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei 37 °C in einem Thermoblock, wobei Sie sie bei 950 U/min schütteln, um einen ordnungsgemäßen Chromatinaufschluss zu gewährleisten.
    HINWEIS: Übertragen Sie im Rahmen der Aufschlusseffizienzkontrollen (siehe Schritt 5.1) das Äquivalent von 20.000 bis 40.000 Kernen in ein anderes Röhrchen, um die unverdaute Kontrolle darzustellen. Übertragen Sie nach der Verdauung die gleiche Anzahl von Zellen erneut in ein anderes Röhrchen, um die verdaute Kontrolle darzustellen. Es wird empfohlen, die Aufschlusseffizienz als separates Experiment zu testen, wenn die Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials knapp ist.

3. Ligatur und Entkreuzung

  1. Kühlen Sie die Probe auf Eis. Bereiten Sie einen Mastermix vor und fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um die Überhänge des Restriktionsfragments zu füllen und zu biotinylieren: 3 μl 10x Restriktionspuffer 2, 1 μl nukleasefreies Wasser, 0,75 μl 10 mM dCTP, 0,75 μl 10 mM dTTP, 0,75 μl 10 mM dGTP, 18,75 μl 0,4 mM Biotin-14-dATP und 5 μl 5 U/μL Klenow (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Probe 75 min lang bei 37 °C und mischen Sie sie alle ~15 min durch Inversion.
  2. Kühlen Sie die Probe auf Eis. Bereiten Sie einen Mastermix vor und fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um die ausgefüllten DNA-Enden zu ligieren: 50 μl 10x Ligationspuffer, 2,5 μl 20 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 12,5 μl 1 U/μl T4-DNA-Ligase und 173 μl nukleasefreies Wasser (siehe Materialtabelle).
  3. Inkubieren Sie die Probe für 4-6 h bei 16 °C und mischen Sie alle ~1 h durch Inversion. Des Weiteren wird die Probe 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Entkreuzen Sie das Chromatin, indem Sie 30 μl 10 mg/ml Proteinase K hinzufügen und mischen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 65 °C.
  4. Fügen Sie am nächsten Morgen weitere 15 μl 10 mg/ml Proteinase K hinzu und inkubieren Sie die Probe 2 h lang bei 65 °C, um eine ordnungsgemäße Chromatin-Entkreuzung zu gewährleisten.

4. DNA-Reinigung

  1. Kühlen Sie die Probe auf Raumtemperatur ab und geben Sie sie zur Phenol-Chloroform-Reinigung in ein geeignetes Röhrchen.
  2. Fügen Sie 1 Volumen (545 μl) Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu, um die DNA zu reinigen, und mischen Sie sie durch kräftiges Schütteln.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe 5 Minuten lang bei 12.000 x g bei Raumtemperatur und überführen Sie die obere wässrige Phase (545 μl) in ein 2-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
  4. Fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um die DNA auszufällen: 1.362,5 μl 100 % Ethanol, gekühlt auf -20 °C, 54,5 μl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2 μl 15 mg/ml Glykogen als Kopiermittel.
  5. 1 h bei -80 °C oder über Nacht bei -20 °C inkubieren.
  6. Zentrifugieren Sie die Probe 30 min lang bei 16.000-21.000 x g bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Das DNA-Pellet muss sichtbar sein.
  7. Waschen Sie das Pellet, indem Sie 1 ml 70%iges Ethanol hinzufügen, wirbeln und 10 Minuten lang bei 16.000-21.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  8. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 130 μl nukleasefreiem Wasser.
  9. Beurteilen Sie die Konzentration durch fluorometrische Quantifizierung (siehe Materialtabelle). Lagern Sie das gereinigte 3C-Material mehrere Monate lang bei -20 °C, bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren.

5. Optionale Qualitätskontrollen

  1. Beurteilen Sie die Verdauungseffizienz. Die in Schritt 2.13 erhaltene unverdaute und verdaute Kontrollen werden wie zuvor beschrieben entkreuzen und Phenol:Chloroform-DNA-Aufreinigung durchführen. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 10 μl nukleasefreiem Wasser. Quantifizieren Sie die Konzentration und verdünnen Sie die erhaltene DNA bei Bedarf auf 4 ng/μl.
  2. Führen Sie eine quantitative PCR mit 4 ng DNA sowohl der unverdauten als auch der verdauten Kontrollgruppe durch, wobei die Primer einen offenen Chromatin-Locus mit und ohne HindIII-Target umfassen (siehe Tabelle 2 für das Primerdesign). Berechnen Sie die Effizienz der Verdauung nach einem zuvor veröffentlichten Bericht35.
    ANMERKUNG: Die Effizienz der Ligatur wird in Prozent nach folgender Formel berechnet: Verdauung (%) = 100 -100/(2^[(Ct verdaut mit HindIII - Ctverdaut ohne HindIII) - (Ct unverdaut mit HindIII - Ct unverdaut ohne HindIII)]) (siehe Tabelle 3), wobei die Differenz der verschiedenen Cts berücksichtigt wird, die für jedes Primerpaar in der unverdauten und der verdauten Kontrolle erhalten wurden.
  3. Bewerten Sie die Sensitivität der Interaktionsdetektion durch die Durchführung einer konventionellen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm beide F + R-Primer, 0,1 und U/μL Hot-Start-Polymerase), wobei Primer sowohl lang- als auch kurzreichweitige zellinvariante Wechselwirkungen abdecken (siehe Tabelle 2 für das Primerdesign). Verwenden Sie 50-100 ng 3C-Material (für kurz- bzw. langreichweitige Wechselwirkungen) und amplifizieren Sie unter den folgenden Bedingungen: 98 °C für 15 min, gefolgt von 37 Zyklen von 98 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 72 °C für 1 min und beenden bei 72 °C für 10 min. Bei 4 °C halten.
    HINWEIS: Wenn die erhaltene DNA-Menge weniger als 2 μg beträgt, überprüfen Sie nur eine lang- und eine kurzreichweitige Wechselwirkung und nicht das gesamte Interaktionspanel.
  4. Lassen Sie das Produkt auf 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) mit 1,6%igem Agarosegel laufen und suchen Sie nach dem Vorhandensein des entsprechenden PCR-Amplikons54.
    HINWEIS: Aufgrund des unvorhersehbaren "Ausschneidens und Einfügens" des Genoms können unspezifische Banden auftreten. Solange die richtige Bandgröße eingehalten wird, wird sie als korrekt gewertet.
  5. Beurteilen Sie die Effizienz des Biotin-Fill-Ins und der Ligatur, indem Sie ein Kurzstrecken-PCR-Produkt mit HindIII, NheI (siehe Materialtabelle), beiden Enzymen oder keinem Enzym (Wasser) differentiell verdauen und das Produkt auf einem 1x TBE 1,6%igen Agarosegel laufen lassen. Ein korrektes Fill-In und eine korrekte Ligatur eliminieren das vorherige HindIII-Target und erzeugen ein neues NheI-Target, so dass das Amplikon nur in Gegenwart von NheI geschnitten werden sollte.
    HINWEIS: Um den Materialverlust zu minimieren, entnehmen Sie 2,5 μl eines PCR-Produkts mit kurzer Reichweite aus den Interaktionskontrollen und reamplifizieren Sie es fünfmal, um die Fill-in- und Ligationskontrollen durchzuführen.

6. Beschallung

  1. Übertragen Sie die 130 μl der Probe (füllen Sie sie mit nukleasefreiem Wasser auf, falls etwas für die Kontrollen verwendet wurde) in eine Küvette, die für die Beschallung geeignet ist.
  2. Richten Sie einen Wasserbad-Beschallungsgerät ein und beschallen Sie ihn mit den folgenden Parametern (optimiert für das in der Materialtabelle beschriebene Modell und die Küvetten): Einschaltdauer: 20%; Spitzenleistung: 50; Zyklen pro Burst: 200; Dauer: 65 s; und Temperaturbereich: 6-10 °C (8 °C optimal).
  3. Übertragen Sie die Probe in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.

7. End-Reparatur

  1. Bereiten Sie einen Mastermix vor und fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um die ungleichmäßigen Enden der DNA-Fragmente zu reparieren, die während der Beschallung entstanden sind: 18 μl 10x Ligationspuffer, je 18 μl 2,5 mM dNTP-Mix, 6,5 μl 3 U/μL T4-DNA-Polymerase, 6,5 μl 10 U/μL T4 PNK und 1,3 μL 5 U/μL Klenow (siehe Materialtabelle).
  2. Die Probe wird 30 min bei 20 °C inkubiert und mit Tris-low EDTA (TLE)-Puffer (siehe Tabelle 1) auf 300 μl aufgefüllt.

8. Biotin-Pulldown

  1. Übertragen Sie 150 μl C1-Streptavidin-Kügelchen (siehe Materialtabelle) pro Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen, legen Sie sie auf einen 1,5-ml-Röhrchenmagneten und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Kügelchen an der Wand haften. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Perlen zurück.
  2. Waschen Sie die Perlen mit 400 μl 1x Tween-Puffer (TB; siehe Tabelle 1). Um die Perlen zu waschen, fügen Sie den Puffer hinzu und resuspendieren Sie sie durch sanftes Wirbeln. Setzen Sie das Röhrchen wieder in den Magneten ein und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Perlen an der Wand haften. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Perlen zurück.
  3. Waschen Sie die Perlen mit 300 μL 1x no Tween Buffer (NTB; siehe Tabelle 1). Resuspendieren Sie die Beads in 300 μl 2x NTB (siehe Tabelle 1).
    Anmerkungen: Die Perlen können beim Waschen mit Puffern ohne Waschmittel eine staubige Schicht um die Tubenwand bilden. Dies ist normal und hat keinen Einfluss auf das Ergebnis des Protokolls.
  4. Kombinieren Sie diese 300 μl Kügelchen in 2x NTB mit den 300 μl der Probe. 15 Minuten inkubieren und bei Raumtemperatur drehen, um die informativen DNA-Fragmente mit Biotin nach unten zu ziehen. Die Bibliothek klebt nun an den C1-Streptavidin-Kügelchen.
  5. Waschen Sie die Perlen mit 400 μL 1x NTB. Waschen Sie die Kügelchen mit 100 μl TLE-Puffer und resuspendieren Sie sie anschließend in 35,7 μl TLE-Puffer.

9. dATP-Tailing, Adapterligation und PCR-Amplifikation

  1. Bereiten Sie einen Mastermix vor und fügen Sie der Probe die folgenden Reagenzien hinzu, um die Enden der reparierten DNA-Fragmente zu dATP-Schwanz zu ziehen: 5 μl 10x Restriktionspuffer 2, 2,3 μl 10 mM dATP und 7 μl 5 U/μL Klenow exo-. Die Probe wird 30 min bei 37 °C inkubiert.
  2. Deaktivieren Sie Klenow exo- durch weitere Inkubation der Probe für 10 min bei 65 °C. Kühlen Sie die Probe auf Eis ab. Waschen Sie die Perlen mit 300 μl 1x TB. Waschen Sie die Perlen mit 300 μL 1x NTB.
  3. Waschen Sie die Kügelchen mit 100 μl 1x Ligationspuffer und resuspendieren Sie sie anschließend in 50 μl 1x Ligationspuffer. Der Probe werden 4 μl 15 μM vorgeglühte Adaptermischung (siehe Tabelle 2) und 1 μl 2.000 U/μL T4-DNA-Ligase (siehe Materialtabelle) zugegeben.
  4. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Perlen mit 400 μl 1x TB. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 1x NTB. Waschen Sie die Perlen mit 100 μl 1x Restriktionspuffer 2.
  5. Waschen Sie die Kügelchen mit 50 μl 1x Restriktionspuffer 2 und resuspendieren Sie sie anschließend in 50 μl 1x Restriktionspuffer 2.
  6. Mischen Sie die folgenden Reagenzien, um die PCR-Reaktion zur Amplifikation der Bibliothek vorzubereiten: 50 μl Beads mit der Bibliothek, 250 μl 2x PCR-Mastermix mit Enzym, 12 μl F + R-Primer (je 25 μM; siehe Tabelle 2) und 188 μl nukleasefreies Wasser.
  7. Führen Sie die PCR unter den folgenden Bedingungen durch (teilen Sie die PCR-Reagenzienmischung in 50-μl-Reaktionen auf): 98 °C für 40 s, gefolgt von X-Zyklen von 98 °C für 10 s, 65 °C für 30 s, 72 °C für 30 s und Ende bei 72 °C für 10 min. Bei 4 °C halten.
    HINWEIS: Verwenden Sie die folgende Anzahl von Zyklen als Ausgangspunkt für die Optimierung des Protokolls in diploiden Zellen, die eine Ausgabe von 500-1.000 ng vor der Bibliothekserfassung anstreben: eine Million Zellen für acht Zyklen; 250.000 Zellen für 10 Zyklen; 50.000 Zellen für 12 Zyklen.
  8. Fassen Sie alle 50-μl-Reaktionen aus derselben Probe in einem 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung zusammen, legen Sie es auf einen 1,5-ml-Röhrchenmagneten und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Kügelchen an der Wand kleben.
  9. Übertragen Sie den Überstand, der die Bibliothek enthält (500 μl), in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung. Mit TLE-Puffer auf 500 μl auffüllen, wenn ein Teil des Überstands verloren gegangen ist. Die C1-Streptavidin-Kügelchen werden nicht mehr benötigt.
  10. Führen Sie eine doppelseitige Auswahl55 mit paramagnetischer Perlenreinigung (0,4-1 Volumen) durch. Dies ermöglicht die selektive Eliminierung von zu großen (>1.000 bp) und zu kleinen Fragmenten oder PCR-Primern (<200 bp), abhängig von der Konzentration von Polyethylenglykol und Salz der zugesetzten paramagnetischen Beads.
  11. Geben Sie 200 μl (0,4 Volumen) Stammperlen in die Bibliothek und mischen Sie sie durch Vortexen. 10 Minuten inkubieren lassen, dabei bei Raumtemperatur drehen.
  12. Legen Sie es auf einen Magneten, warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Perlen an der Wand kleben, und übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek (ohne die größeren Fragmente) in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
  13. Konzentrieren Sie die Perlen, indem Sie 750 μl Brühperlen nehmen, sie in ein 1,5-ml-Röhrchen auf einen Magneten legen, 2-3 Minuten warten oder bis alle Perlen an der Wand kleben, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen, indem Sie 300 μl neue Brühperlen einwerfen.
  14. Geben Sie diese 300 μl konzentrierte Kügelchen in die Probe (1 Volumen) und mischen Sie sie durch Wirbeln. 10 Minuten inkubieren lassen, dabei bei Raumtemperatur drehen. Auf einen Magneten legen, 2-3 Minuten warten oder bis alle Perlen an der Wand kleben, und den Überstand (mit den kleineren Fragmenten und PCR-Primern) entfernen.
  15. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 1 ml 70%igem Ethanol. Fügen Sie dazu das Ethanol hinzu, während sich das Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magneten befindet, versuchen Sie, die Perlen nicht zu stören, und warten Sie 30-60 s. Entfernen Sie anschließend den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  16. Lassen Sie die Perlen an der Luft trocknen und resuspendieren Sie sie in 21 μl TLE-Puffer durch Vortexen.
    HINWEIS: Eine übermäßige Trocknung der Kügelchen kann die Ausbeute bei der Elution der DNA verringern. Versuchen Sie, sie sofort in TLE-Puffer zu resuspendieren, nachdem sie vom Ethanol nicht mehr "glänzend" sind.
  17. Inkubieren Sie die Probe 10 min lang bei 37 °C in einem Thermoblock, um die Bibliothek aus den Beads zu eluieren. Legen Sie das Röhrchen in einen Magneten und übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
  18. Quantifizieren Sie die Größe und Konzentration durch automatisierte Elektrophorese (siehe Materialtabelle). Gereinigtes Hi-C-Material kann mehrere Monate lang bei -20 °C gelagert werden, bevor mit dem Protokoll fortgefahren wird.

10. Erfassung der Bibliothek

  1. Arbeiten Sie mit 500-1.000 ng der Bibliothek. Konzentrieren Sie die Bibliothek, indem Sie die DNA mit einem Vakuumkonzentrator trocknen und das Material in 3,4 μl nukleasefreiem Wasser resuspendieren.
  2. Fügen Sie der Probe die folgenden Blocker aus dem Target-Anreicherungskit (siehe Materialtabelle) hinzu: 2,5 μl Blocker 1, 2,5 μl Blocker 2 und 0,6 μl benutzerdefinierter Oligoblocker für die Adapter.
  3. Gründlich resuspendieren, die Lösung in einen 0,2-ml-PCR-Streifen überführen und 5 min bei 95 °C in einem Thermocycler inkubieren, gefolgt von 5 min bei 65 °C mit erhitztem Deckel. Lassen Sie das Röhrchen bei 65 °C inkubieren.
  4. Bereiten Sie die Hybridisierungslösung vor, indem Sie die folgenden Reagenzien aus dem Target-Anreicherungskit (siehe Materialtabelle) pro Probe (13 μl) kombinieren. Bei Raumtemperatur auf dem Tisch aufbewahren: 6,63 μl Hyb 1, 0,27 μl Hyb 2, 2,65 μl Hyb 3 und 3,45 μl Hyb 4.
  5. Verdünnen Sie 0,5 μl RNase-Block aus dem Target-Anreicherungskit mit 1,5 μl nukleasefreiem Wasser pro Probe. Tauen Sie 5 μl der biotinylierten RNA pro Probe auf Eis auf und fügen Sie die 2 μl des verdünnten RNase-Blocks hinzu. Bei Raumtemperatur auf der Bank aufbewahren.
  6. Die 13 μl der Hybridisierungslösung zu den 7 μl der biotinylierten RNA mit RNase geben und gut vermischen.
  7. Auf dem Thermocycler bei 65 °C wird die Hybridisierungslösung mit der biotinylierten RNA (20 μL) in die blockierte Bibliothek überführt. Den Röhrchendeckel fest verschließen und über Nacht bei 65 °C im Thermocycler inkubieren.
    HINWEIS: Um die Probenverdampfung (die zu einer suboptimalen RNA-DNA-Hybridisierung führen kann) zu minimieren, wenn mehrere Proben gleichzeitig durchgeführt werden, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die biotinylierte RNA gleichzeitig in jede Bibliothek zu übertragen.

11. Biotin-Pulldown und PCR-Amplifikation

  1. Übertragen Sie 50 μl T1-Streptavidin-Kügelchen pro Probe in ein 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung, legen Sie sie auf einen 1,5-ml-Röhrchenmagneten und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Kügelchen an der Wand haften. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Perlen zurück. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 200 μl des Bindungspuffers aus dem Target Enrichment Kit.
  2. Resuspendieren Sie die Beads in 200 μl Bindungspuffer. Auf dem Thermocycler bei 65 °C wird die Probe in die resuspendierten T1-Streptavidin-Beads überführt und 30 Minuten lang inkubiert, wobei sie sich bei Raumtemperatur dreht.
  3. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 μl Waschpuffer 1 aus dem Target Enrichment Kit. 15 Minuten inkubieren lassen, dabei bei Raumtemperatur rotieren. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 200 μl Waschpuffer 2 aus dem auf 65 °C erhitzten Zielanreicherungskit. 10 min bei 65 °C in einem Thermoblock inkubieren, zwischen den Wäschen bei 300 U/min schütteln.
  4. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 μl 1x Restriktionspuffer 2 und resuspendieren Sie sie anschließend in 30 μl 1x Restriktionspuffer 2.
  5. Mischen Sie die folgenden Reagenzien, um die PCR-Reaktion zur Amplifikation der Bibliothek vorzubereiten: 30 μL Beads mit der Bibliothek, 150 μL 2x PCR Mastermix mit Enzym, 7,2 μL F + R Primer (je 25 μM; siehe Tabelle 2) und 112,8 μL Nuklease-freies Wasser.
  6. Führen Sie die PCR unter den folgenden Bedingungen durch (teilen Sie die PCR-Reagenzienmischung in 50-μl-Reaktionen auf): 98 °C für 40 s, gefolgt von vier Zyklen von 98 °C für 10 s, 65 °C für 30 s, 72 °C für 30 s und beenden Sie mit 72 °C für 10 min. Bei 4 °C halten.
  7. Fassen Sie alle 50-μl-Reaktionen aus derselben Probe in einem 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung zusammen, legen Sie es auf einen 1,5-ml-Röhrchenmagneten und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Kügelchen an der Wand kleben.
  8. Übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek (300 μl) in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung. Mit TLE-Puffer auf 300 μl auffüllen, wenn ein Teil des Überstands verloren gegangen ist. Die T1-Streptavidin-Kügelchen werden nicht mehr benötigt.
  9. Führen Sie eine DNA-Aufreinigung mit paramagnetischen Beads (0,9 Volumen; siehe Materialtabelle) durch. Geben Sie 270 μl Brühperlen in die Probe und mischen Sie sie durch Wirbeln.
  10. 10 Minuten inkubieren lassen, dabei bei Raumtemperatur drehen.
  11. Auf einen Magneten legen, 2-3 Minuten warten oder bis alle Perlen an der Wand kleben, und den Überstand entfernen.
  12. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 1 ml 70%igem Ethanol. Fügen Sie dazu das Ethanol hinzu, während sich das Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magneten befindet, und versuchen Sie, die Perlen nicht zu stören, und warten Sie 30-60 s. Entfernen Sie anschließend den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  13. Lassen Sie die Perlen an der Luft trocknen und resuspendieren Sie sie in 21 μl TLE-Puffer durch Vortexen.
    HINWEIS: Eine übermäßige Trocknung der Kügelchen kann die Ausbeute bei der Elution der DNA verringern. Versuchen Sie, sie sofort in TLE-Puffer zu resuspendieren, nachdem sie vom Ethanol nicht mehr "glänzend" sind.
  14. Inkubieren Sie die Probe 10 min lang bei 37 °C in einem Thermoblock, um die Bibliothek aus den Beads zu eluieren.
  15. Legen Sie das Röhrchen in einen Magneten und übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
  16. Quantifizieren Sie die Größe und Konzentration durch automatisierte Elektrophorese.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C bietet die Möglichkeit, mit nur 50.000 Zellen qualitativ hochwertige und hochauflösende genomweite Promotor-Interaktombibliotheken zu generieren53. Dies wird erreicht, indem – neben der drastischen Reduzierung des Reaktionsvolumens und der Verwendung von DNA-Plasticware mit geringer Bindung im gesamten Protokoll – unnötige Schritte aus dem ursprünglichen Protokoll entfernt werden, bei denen erhebliche Materialverluste auftreten. Dazu gehören die Phenolreinigung nach der Entkreuzung, die Bi...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C bietet die Möglichkeit, hochauflösende Promotor-Interaktom-Bibliotheken zu generieren, indem ein ähnlicher experimenteller Rahmen wie PCHi-Cs verwendet wird, jedoch mit einer stark reduzierten Zellzahl. Dies wird in hohem Maße durch den Wegfall unnötiger Schritte wie Phenolreinigung und Biotinentfernung erreicht. Beim klassischen Hi-C-Protokoll57 für die Ligatur im Zellkern und seiner nachfolgenden Derivatetechnik PCHi-C wird Biotin aus nicht-ligierten Restriktionsfragmenten entfernt, um z...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den anderen Mitgliedern des Javierre-Labors für ihr Feedback zum Manuskript. Wir danken dem CERCA-Programm, der Generalitat de Catalunya und der Josep-Carreras-Stiftung für die institutionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der FEDER/dem spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (RTI2018-094788-A-I00), der European Hematology Association (4823998) und der Spanish Association against Cancer (AECC) LABAE21981JAVI finanziert. BMJ wird durch das Junior Leader-Projekt der La Caixa Banking Foundation (LCF/BQ/PI19/11690001) finanziert, LR wird durch ein AGAUR FI-Stipendium (2019FI-B00017) und LT-D durch ein FPI-Stipendium (PRE2019-088005) finanziert. Wir danken dem Doktorandenprogramm Biochemie und Molekularbiologie der Universitat Autònoma de Barcelona für seine Unterstützung. Keiner der Geldgeber war zu irgendeinem Zeitpunkt an der Versuchsplanung oder dem Schreiben des Manuskripts beteiligt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0,5 M EDTA pH 8,0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8,0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIm Manuskript als Restriktionspuffer 2 referenziert
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA-Ligase-ReaktionspufferNew England BiolabsB0202S
16%ige Formaldehydlösung (w/v), methanolfreiThermo Scientific28908
20 mg/ml RinderserumalbuminNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel LichtröhrchenQiuantabio2302820Für die Phenol-Chloroform-Reinigung in Abschnitt 4 (DNA-Aufreinigung). Phase-Lock-Gel-Röhrchen sind eine kommerzielle Art von Röhrchen, die speziell entwickelt wurden, um die DNA-Rückgewinnung nach Phenol-Chloroform-Aufreinigungen zu maximieren und gleichzeitig die Verschleppung von Verunreinigungen in der organischen Phase zu vermeiden, indem sie ein Harz mittlerer Dichte enthalten, das sich zwischen der organischen und der wässrigen Phase absetzt und sie isoliert. PLG-Röhrchen sollten vor der Verwendung 30 s lang bei 12.000 x g gedreht werden, um sicherzustellen, dass das Harz gut am Boden des Röhrchens platziert ist
Adapter und PCR-Primer für die BibliotheksamplifikationIntegrierte DNA-Technologien-Gekauft als einzelne Primer mit PAGE-Aufreinigung für NGS-Zellschaber
Nunc179693Oder jede andere Marke
Zentrifuge (Festwinkelrotor für 1,5 mL Röhrchen)Jede Marke
CHiCAGO R Packung1.14.0
CleanNGS KügelchenCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123Aoder jede andere Marke
DNA LoBind Röhrchen, 1,5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind Röhrchen, 2 mLEppendorf30108078
DNA Polymerase I groß (Klenow) Fragment 5000 Einheiten/mlNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 KügelchenInvitrogen65002Für die Biotin-Pull-Down der vorerfassten Bibliothek in Abschnitt 8 (Biotin Pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602Für den Biotin-Pulldown der nachgefangenen Bibliothek in Abschnitt 11 (Biotin-Pulldown und PCR-Amplifikation)
DynaMag-2Invitrogen12321DOder jeder andere Magnet, geeignet für 1,5 ml tubeL
Ethanol absolutVWR20821.321
FBS, qualifiziertGibco10270-106Oder jede andere Marke
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CopräzipitantInvitrogenAM9515Wird für die DNA-Copräzipitation in Abschnitt 4 verwendet (DNA-Aufreinigung)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µ LNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 Einheiten/mLNew England BiolabsM0212L
Filterspitzen mit geringer Retention ( 10 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 200 & Mikro; L und 1000 µ L)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Fokussierter UltraschallgerätCovaris500295
Micro TUBE AFA Faser Vorgeschlitzte Schnappkappe 6 x 16 mm FläschchenCovaris520045Für die Beschallung in Sektion 6 (Beschallung)
NheI-HF, 100 U/µ LNew England BiolabsR3131M
Nukleasefreies Wasser in molekularbiologischer QualitätSigma-AldrichW4502
PCR-Primer für QualitätskontrollenDNA-Technologien-PCR-Streifen
  und VerschlüsseAgilent Technologies410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25:24:1, gesättigt mit 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion  High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-PufferNew England BiolabsM0531LZur Amplifikation der Bibliothek in den Abschnitten 9 (dATP-Tailing, Adapterligation und PCR-Amplifikation)
und 11 (Biotin-Pull-down und PCR-Amplifikation)
Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei)Roche11873580001
Proteinase K, rekombinant, Roche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity KitInvitrogenQ33230<strong>Für die DNA-Quantifizierung nach der Fällung in Abschnitt 4 (DNA-Aufreinigung)
Qubit AssayTubes InvitrogenQ32856
rCutsmart PufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Oder eine andere Marke
SDS - Lösung 10% für die MolekularbiologiePanReac AppliChemA0676
Natriumacetat pH 5,2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect benutzerdefinierte 3-5,9 Mb BibliothekAgilent Technologies5190-4831Speziell entwickelte Maus oder menschliches Erfassungssystem, verwendet für die
Erfassung SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Wird für das capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE FullAdapter verwendet Agilent Technologies931107Verwendet für die capture
T4 DNA-Ligase 1 U/µ LInvitrogen15224025Für die Ligation in Sektion 3 (Ligation und Decrosslink)
T4 DNA-Ligase 2000000/mlNew England BiolabsM0202TFür die Ligation in Sektion 9 (dATP-Tailing, Adapterligation und PCR-Amplifikation)
T4 DNA-Polymerase 3000 Einheiten/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 Einheiten/mlNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 InstrumentAgilent TechnologiesFür die automatisierte Elektrophorese in Abschnitt 9 (dATP-Tailing, Adapterligation und PCR-Amplifikation) und
Abschnitt 11 (Biotin-Pull-down und PCR-Amplifikation). Jedes andere automatisierte Elektrophoresesystem ist gültig
Tapestation-ReagenzienAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,Für die automatisierte Elektrophorese in Abschnitt 9 (dATP-Tailing, Adapterligation und PCR-Amplifikation) and
Abschnitt 11 (Biotin-Pull-down und PCR-Amplifikation). Jedes andere automatisierte Elektrophoresesystem ist gültig
Triton X-100 für die MolekularbiologiePanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML
Integrierte

Referenzen

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