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Methodenartikel

Bewertung der Auswirkungen eines neuen Kühlzellenprozessorsystems auf die Inselzellisolationsanlage

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DOI:

10.3791/65321

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11. August 2023

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1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll hier beschreibt ein kundenspezifisches Kühlzellenprozessorsystem, das mit einem Reinraum für gute Herstellungspraktiken (GMP) kompatibel ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Verarbeitung zu verbessern.

Zusammenfassung

Standard-Zelltherapiegeräte, einschließlich des Goldstandard-Zellprozessors zur Reinigung menschlicher Inselzellen für die klinische Transplantation, werden selten gekühlt, wodurch die Zellen während des Zentrifugationsschritts möglicherweise erhöhten Temperaturen ausgesetzt werden. Kundenspezifische Kühlsysteme haben einen direkten Nutzen für die Lebensfähigkeit und Funktion der menschlichen Inseln. Die aktuelle Studie wurde konzipiert, um die Wirksamkeit eines neu entwickelten, leicht verfügbaren gekühlten Zellprozessorsystems zu testen, das minimale Modifikationen erfordert, und um seine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit menschlicher Zellen und die GMP-Reinraumumgebung zu bewerten. Das Kühlsystem, ein mechanisch gekühlter Wärmetauscher, der auf -30 °C eingestellt ist, wurde verwendet, um gekühlte trockene Luft in medizinischer Qualität durch ein Loch in der Zentrifugenabdeckung in die Zellprozessorschüssel zu leiten. Angesichts der begrenzten Verfügbarkeit von Bauchspeicheldrüsenspendern in Katar wurde die Systemvalidierung mit einer kontinuierlichen Dichtegradientenreinigung von gepooltem menschlichem Knochenmark-Buffy-Coat durchgeführt. Sterilität, Turbulenz und Partikelzahl wurden in Reinraumumgebungen der Klassen C und B gemessen. Um den gekühlten Zellprozessor herum bildeten sich keine Turbulenzen, und es wurden keine überschüssigen 0,5 μm und 5 μm Partikel in der Luft gemäß den GMP-Standards des Reinraums erzeugt. Zu Beginn und am Ende der Entnahmeschritte stieg die Temperatur auf 21,50 °C ± 0,34 °C bzw. 21,93 °C ± 0,20 °C im ungekühlten Zellprozessor und auf nur 10,9 °C ± 0,17 °C und 11,16 °C ± 0,35 °C im Kühlzellenprozessor an (p <0,05). Der gekühlte Zellprozessor führte sowohl zu einer verbesserten Rückgewinnung (98 %) der mononukleären Zellfraktion als auch zu einer verbesserten Viabilität (100 % ± 2 %) nach der Verarbeitung. Das neue Kühlsystem reduziert effektiv die vom Zellprozessor erzeugte Wärme, ohne dass die Partikel die GMP-Reinraumumgebung beeinträchtigen. Der hier beschriebene gekühlte Zellprozessor ist eine kostengünstige (16.000 US-Dollar ohne Steuern, Zollabfertigung und Transport) und minimalinvasive Methode zur Bereitstellung einer robusten Kühlung. Derzeit wird diese Technologie in der GMP-Zelltherapieanlage für die Isolierung und Transplantation menschlicher Inselzellen für das klinische Programm eingesetzt.

Einleitung

Inseltransplantation bei schwerem Typ-1-Diabetes kann die endogene Insulinsekretion wiederherstellen und ist in einer Reihe von Ländern zum Behandlungsstandard geworden1. Die Inselisolierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das einen warmen enzymatischen und mechanischen Aufschluss der Bauchspeicheldrüse umfasst, gefolgt von gekühlten Phasen zur Rückgewinnung des verdauten Gewebes und der Inselreinigung mit kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Dichtegradienten auf einem Zellprozessor. Die schnelle Abkühlung verlangsamt die enzymatische Verdauungsphase und schützt die Inselzellen vor Verdauungsenzymen, die durch die Kontamination der Azinuszellen freigesetzt werden. Der Zellprozessor wurde ursprünglich entwickelt, um zelluläre Blutbestandteile bei Umgebungstemperatur zu trennen2. Es wurde 1989 zur Reinigung der menschlichen Pankreasinseln von Langerhans umfunktioniert3. Seit drei Jahrzehnten werden menschliche Inselzellen für klinische Studien und in jüngerer Zeit für die Standardbehandlung gereinigt, entweder in einem Zellprozessor mit diskontinuierlichen Gradienten4 oder in kontinuierlichen Dichtegradienten1, der mit einem Gradient Maker1 oder einem gleichwertigen computergesteuerten Mixer hergestellt wurde5,6,7. Andere Gruppen haben berichtet, dass die Reinigung von Inselzellen durch große Säugetiere und Menschen mit großen zylindrischen Plastikflaschen durchgeführt wurde8,7,9, was die Wirksamkeit der Reinigung und die Qualität der Inselzellen erheblich verbesserte.

In der Tat, unter Berücksichtigung des Goldstandards zur Reinigung menschlicher Inselzellen für klinische Transplantationen10,11, war der hergestellte Zellprozessor ohne Kühlung. Als direkte Folge der fehlenden Kühlung wurden die Inselzellen während des Reinigungsschritts steigenden Temperaturen ausgesetzt. Während der Zentrifugation kommt es aufgrund der mechanischen Reibung des Rotors zu einem unkontrollierten Temperaturanstieg12,13. Die Zellprozessoren wurden mit einem Kühlsystem in Inselisolationszentren ausgestattet, das die glukoseinduzierte Insulinsekretion und die Zellviabilität statistisch erhöhte, was den Vorteil bestätigte, die Pankreasinseln während des Reinigungsverfahrens bei niedrigen Temperaturen zu halten14,15.

Es sollte beachtet werden, dass in den späten 1980er Jahren 10 gekühlte Prototypen gebaut wurden, um die Beschädigung von Inselzellen während der Reinigung durch Dichtegradienten zu reduzieren, aber keine weitere Aufmerksamkeit erhielten. Die Prototypen der Zellprozessoren basierten auf einer Spindel- und Trommelkühlung mit gekühltem Polyethylenglykol. Insbesondere Lösungen zur Reinigung von Inselzellen, einschließlich Lösungen zur Organkonservierung und Polysaccharid-Dichtegradienten, können für die Lebensfähigkeit von Inselzellen schädlich sein, wenn sie bei oder über Raumtemperatur verwendet werden16,17,18. Ein Vergleich verschiedener Kühlstrategien des Zellprozessors für die Reinigung von Inselzellen mit dem ursprünglichen ungekühlten Zellprozessor wurde evaluiert, um dem unkontrollierten Temperaturanstieg entgegenzuwirken, der durch die Reibung des Rotors auftritt. Es wurden mehrere Versuche unternommen, den Zellprozessor während der Reinigung menschlicher Inselzellen abzukühlen. Der Zellprozessor kann vorübergehend oder dauerhaft in einem speziell entwickelten Kühlraum untergebracht werden, um eine Temperatur von 0-8 °C aufrechtzuerhalten19 während der Gradientenzentrifugation, die derzeit in den Inselisolationszentren an der University of Illinois Chicago verwendet wird, 19, University of Miami14, University of Oxford facilities15und die University of San Francisco (die benutzerdefinierte Kühleinheit umhüllt den Zellprozessor). Eine weitere Modifikation umfasst die Kernkühlung der Zellprozessorspindel mit einem Kühlsystem unter Verwendung elektronisch gesteuerter Flüssigstickstoffkühlung in Genf, Schweden, und der Tschechischen Republik15,19. Eine weitere Alternative war Mitte 2000 die Kernkühlung des Zellprozessors mit einer Klimaanlage 12 oder durch Flüssigkeitskühlung des Schachtes an der Universität Lille.

Kühlmodifikationen des Zellenprozessors sind nicht ohne weiteres verfügbar und bergen Risiken (Feuchtigkeit, Kondensationsbildung) in GMP-Reinraumumgebungen, einschließlich des Verlusts der Garantie und der Weigerung des Erbauers, die Maschine zu warten. Folglich verwenden einige Inselzentren, darunter Mailand, Italien, Oslo, Norwegen und Edinburgh, Schottland, kein Kühlsystem für Zellprozessoren während des Inselreinigungsprozesses15.

Die aktuelle Studie wurde konzipiert, um die Wirksamkeit eines neu entwickelten, leicht verfügbaren Kühlers in Verbindung mit einem minimal modifizierten Zellprozessorsystem zu testen. Kurz gesagt, der hier beschriebene luftbasierte Kühler ist ein mechanisch gekühlter Wärmetauscher, der die Temperatur von 1 Standardkubikfuß pro Minute (SCFM) trockenen Gases zwischen -40 °C und -100 °C regelt. Dieses Kühlsystem erfordert eine trockene medizinische Luftzufuhr. Die Luft strömt durch die Leitung und den Wärmetauscher und durch die Düse (7,9 mm) nach außen. Eine Heizung, die sich in der Düse befindet, liefert Wärme, um die Temperatur des Luftstroms zu regeln. Es wurde eine Ersatzabdeckung für eine Zentrifuge aus festem Kunststoff gekauft, und es wurden nur minimale Änderungen vorgenommen. In den Deckel wurde ein Loch mit einem Durchmesser von 13,3 mm gebohrt und über das Loch im Zentrifugendeckel gekühlte Luft aus der Kühlerdüse zum Zellprozessor geleitet. Die gekühlte medizinische Luft wurde in die Zentrifugationstrommel des Zellprozessors injiziert, wobei die Temperatur der Flüssigkeiten oder Dichtegradienten ständig kontrolliert wurden.

Wir haben die technische Leistung des gekühlten Zellprozessors und den Einfluss des Kühlelements auf die GMP-Reinraumumgebung bewertet. Das Hauptaugenmerk lag darauf, eine robust niedrige Temperatur (<10 °C) während der Reinigung menschlicher Inselzellen zu erreichen, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Unter Verwendung einer Buffy-Coat-Dichtetrennung als Proxy für die Inselisolierung haben wir die Wirksamkeit dieses Kühlprotokolls auf die Zellviabilität bestimmt.

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Protokoll

Dieses Protokoll verwendete verwarfe Ganzblutproben, die gemäß den Entsorgungsrichtlinien der Institution nicht für die Verwendung geeignet waren. Eine Genehmigung durch die Ethikkommission und die Einholung informierter Einwilligungen sind nicht erforderlich.

1. Aufbau des gekühlten Zellprozessors

HINWEIS: Alle Verfahren müssen in einer Reinraumumgebung durchgeführt werden, und das Personal muss die Reinraumkleidungsanweisungen befolgen.

  1. Gerätekauf
    1. Kaufen Sie einen Ersatz-Plexiglasdeckel. Erwerben Sie das Kühlausrüstungssystem, bestehend aus Kühler mit mechanisch gekühlter Gasstromtemperaturregelung, Lufttrockner, Druck- und Durchflussregler sowie der Garantie (optional). Siehe Tabelle der Materialien für Bezugsquellen.
      HINWEIS: Die Gesamtkosten betragen 16.133 $ ohne Versand- oder Zollgebühren.
    2. Bestellen Sie medizinische Trockenluft, ein komprimiertes medizinisches Gas, das der Standardqualität entspricht (europäische Arzneibuchreferenz 1238), beim örtlichen medizinischen Gaslieferanten. Kaufen Sie 2 Flaschen mit je 6,8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; Durchmesser x Länge).
  2. Inbetriebnahme der Ausrüstung (Abbildung 1 und Abbildung 2)
    1. Bringen Sie die Ausrüstung in den GMP-Reinraum (desinfizieren Sie vor dem Betreten des Reinraums gemäß GMP-Verfahren).
    2. Verlegen Sie für die medizinische Druckluft eine Gasleitung, anstatt die Gasflasche direkt im Reinraum zu platzieren.
  3. Umrüstung des Zellprozessors zur Kühlung
    1. Entfernen Sie zunächst die Plexiglasabdeckung. Bewahren Sie die ursprüngliche Plexiglasabdeckung auf, falls Probleme mit der Garantie auftreten. Bohren Sie ein Loch in den Ersatzdeckel des Zellprozessors mit einem Durchmesser, der dem Außendurchmesser der Düse des Kühlers entspricht, um Risse in der Zentrifugenabdeckung zu vermeiden (empfohlen: 13,3 mm).
    2. Befestigen Sie Halterungen zusammen mit einer runden Schaumstoffplatte. Dies dient dazu, Bruch und/oder Kratzer an der Abdeckung zu verhindern, die Kühldüse über dem Zellprozessor zu fixieren, die Abdeckung vor übermäßiger Verformung durch den hohen Druck der eingespeisten Luft zu schützen, das Gewicht der Düse zu tragen und schließlich die maximale Sicherheit für den Bediener sicherzustellen, um während des Versuchsablaufs freien und sicheren Zugriff auf alle erforderlichen Funktionen des Zellprozessors zu gewährleisten.
    3. Verbinden Sie das Kühlsystem mit dem Zellprozessor, indem Sie die Kühldüse in das Loch im Plexiglas einführen. Sichern Sie sie mit Halterungen und Schaumstoffpolstern.
    4. Platzieren Sie das Kälteaggregat bis zu 2,44 m (8 ft) entfernt von der Düse. Unterbringen Sie die Temperaturregelung in einem separaten Gehäuse und platzieren Sie sie innerhalb von 1,83 m (6 ft) zum Kälteaggregat.
    5. Stellen Sie den Sollwert des Kühlers auf -40 °C, um den Luftstrom am Kühler zu kühlen. Die Austrittstemperatur der Luft wird kontinuierlich auf der digitalen Anzeige mit einer Auflösung von 0,1 °C angezeigt. Stellen Sie die Ausgangstemperatur digital auf 0,1 °C mit dem Temperaturregler ein.
    6. Regeln Sie Druck und Durchflussrate der Luftzufuhr am Druck- und Durchflussreglermodul (Abbildung 2), bevor die Luft zum Kühler geleitet wird. Stellen Sie diese auf 55 psi bzw. 4 SCFM ein, um optimale Bedingungen für einen auf -30 °C ± 2 °C gekühlten Luftstrom zu erreichen.
    7. Stellen Sie sicher, dass die medizinische Gasversorgung auf einen Auslassdruck von 5 bar reguliert ist und mindestens 90 Minuten hält, da dies erforderlich ist, damit die Druckluft -30 °C erreicht.
      ​HINWEIS: Medizinische Trockenluft ist ein komprimiertes medizinisches Gas, und vollständig unter Druck stehende trockene Luft entspricht der Standardqualität.
    8. Leiten Sie 5 bar über eine mit dem Zellprozessor-Deckel verbundene Kühldüse durch ein in der Zentrifugenabdeckung gebohrtes Loch. Sprühen Sie die gekühlte medizinische Luft in die Zentrifugierschale des Zellprozessors (Abbildung 2). Wählen Sie die Position der Luftzufuhr so, dass die gekühlte Luft senkrecht auf den Aluminiumrand des Zentrifugenrotors gerichtet ist.
    9. Stellen Sie beim Vorbereiten des Zellprozessors sicher, dass sich der Rotor bei Raumtemperatur (18 °C) befindet. Stellen Sie den automatischen Temperaturregler des Kühlsystems auf -30 °C ein und leiten Sie gekühlte Luftinjektionen zum Rotor.
      HINWEIS: Verschiedene Testbedingungen wurden geprüft, um einen optimalen Temperaturgradienten von +4 °C zu erreichen, der notwendig ist, um den thermischen Widerstand des Zelltrennsystems des Zellprozessors und die Erwärmung des Rotors während der Zentrifugation zu überwinden. Der programmierte Temperaturregler hält während des Verfahrens, insbesondere während der Zentrifugation, bei einer Reinraumtemperatur von +18 °C die optimale Zieltemperatur im Inneren der Zellverarbeitungsmaschine aufrecht.
      1. Richten Sie den Zellprozessor mit der ersten Vorabkühlphase ein, um den Prozessor (ohne das Zellprozessor-Kit) auf +3 °C für 30 bis 45 Minuten abzukühlen, und führen Sie die zweite Vorabkühlphase mit dem Kit durch, das auf +4 °C vorgekühlt wird, bei 134 x g für 5 Minuten.

2. Zählung von luftgetragenen Partikeln

  1. Überprüfen Sie die Einhaltung der Kühlvorrichtung hinsichtlich der GMP-Reinraumumgebung gemäß der Norm ISO 14644-1, um die Auswirkungen von Wärmequellen während der Betriebsphase zu bewerten.
  2. Verwenden Sie die Überwachung der Partikelanzahl, um nachzuweisen, dass am Ruhezustand und im Betrieb an kritischen Kontrollpunkten die erforderliche Reinheit erreicht wird.
    1. Die Mindestanzahl der Probenahmestellen hängt von der gemessenen Fläche ab. Berechnen Sie diese mithilfe der Gleichung
      figure-protocol-1
      ​wobei A die Fläche des Reinraums oder des luftgereinigten Steuerbereichs in m2 ist und NL die auf eine ganze Zahl aufgerundete Anzahl der Probenahmestellen ist.
    2. Das luftgetragene Probenahmevolumen ist das Mindestvolumen an jeder Stelle. Stellen Sie sicher, dass das Luftvolumen groß genug ist, um 20 Partikel der größten vorgegebenen Partikelgröße zu zählen. Berechnen Sie das luftgetragene Probenahmevolumen mithilfe der Gleichung
      V= 20/C × 1000
      wobei V das minimale Einzelprobenahmevolumen pro Stelle in L ist und C die Klassenobergrenze (Anzahl der Partikel/m3) ist.
    3. Entnehmen Sie je nach Fläche an jeder Stelle eine oder mehrere Proben. Stellen Sie sicher, dass das minimale Probenvolumen an jeder Stelle 2 L beträgt und die Mindestprobennahmedauer mindestens 1 min beträgt.
  3. Vor der Probenahme spülen Sie das Partikelzählgerät mit einem Spülfilter aus. Entfernen Sie den Filter und setzen Sie ihn mit der isokinetischen Sonde zur Probenahme ein.
  4. Platzieren Sie das Partikelzählgerät an der festgelegten Probenahmestelle. Starten Sie die Probenahme über den Hauptbildschirm des Partikelzählgeräts.
  5. Nach Abschluss der Probenahme bringen Sie das Partikelzählgerät zur nächsten Stelle. Sobald die Probenahme an allen vorgesehenen Stellen abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Daten und drucken Sie einen Bericht aus.
  6. Wenn die durchschnittliche Partikelkonzentration an allen Probenahmestellen des Bereichs unterhalb der in Tabelle 1 angegebenen Klassenobergrenze liegt, gilt der Raum als bestanden hinsichtlich der zulässigen Partikelkonzentration.

3. Herstellung der Gradienten und Verarbeitung der Zellseparation

  1. Kühlen Sie die leichten und schweren Dichtegradienten sowie die Zellprozessorkits vor der Versuchsdurchführung über Nacht bei +4 °C im Kühlschrank vor.
  2. Kühlen Sie den Zellprozessor 45 Minuten lang im Ruhezustand vor (d. h., schalten Sie den Zellprozessor vor der Verwendung ein). Halten Sie die Temperatur zwischen +2 °C und +5 °C. Setzen Sie das bei +4 °C vorgekühlte Zellprozessorkit ein.
  3. Verbinden Sie für den standardmäßigen mit Ethanol gekühlten Doppelwand-Gradientenhersteller (optional; Abbildung 3) die beiden Glasgefäße und stellen Sie sie auf einen magnetischen Rührer. Klemmen Sie den Schlauch zwischen den beiden Gefäßen ab. Kühlen Sie den Gradientenhersteller mit einem Ethanol-zirkulierenden Kühlaggregat auf 0 °C.
  4. Bereiten Sie zunächst das Beladen der schweren Schicht am Boden des Beutels vor, indem Sie das Gefäß mit 130 mL schwerem Dichtegradienten (HD; 1,087 g/mL) füllen. Beladen Sie mit einer Pumpgeschwindigkeit von 150 mL/min.
  5. Nachdem der schwere Gradient im Beutel ist, fügen Sie 130 mL hoher Dichte (HD) zum vorderen Becherglas und 140 mL niedriger Dichte (ND; 1,063 g/mL) zum hinteren Becherglas hinzu (Klemme geschlossen).
  6. Lösen Sie die Absperrklemme zwischen den beiden Gefäßen und erzeugen Sie einen kontinuierlichen Gradienten mit einer Pumpgeschwindigkeit von 50 mL/min.
  7. Bereiten Sie im Voraus humane mononukleäre Buffy-Coat-Zellen zur Reinigung aus mehreren gepoolten anonymen Buffy-Coats vor, die aus Vollblutabfällen gewonnen wurden (40 mL bis 60 mL Vollblut wurden zu 10 Buffy-Coat-Beuteln hinzugefügt), abhängig von der Verfügbarkeit der Blutbank.
    1. Trennung der MNC
      1. Verwenden Sie die Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen niedriger Dichte. Befolgen Sie dazu die unten beschriebenen Schritte.
      2. Berechnen Sie für die Zellpräparation das Volumen des Blutes (antikoaguliertes Vollblut oder suspendierter Buffy-Coat). Verdünnen Sie das Blut mit 2- bis 4-fachem Pufferlösungsvolumen durch Umstülpenmischen. Je stärker das Blut verdünnt ist, desto besser ist die Reinheit der mononukleären Zellen.
      3. Bereiten Sie den Puffer durch Mischen von Phosphatpuffer mit einem Antikoagulans vor. Berechnen Sie die benötigte Anzahl an Röhrchen, indem Sie das Blutvolumen durch 35 mL teilen, und geben Sie 15 mL der Dichtegradientenlösung mit Dichte 1,073 in jedes Röhrchen.
      4. Schichten Sie vorsichtig 35 mL der verdünnten Blutsuspension über den Dichtegradienten, indem Sie die Suspension mit einer 60-mL-Spritze mit Nadel sanft auf die Oberfläche des Gradienten auftragen; bei kleinen Volumina verwenden Sie eine Pipette. Vermeiden Sie es, die Grenzfläche zu stören, da dies zu einer schlechten mononukleären Schicht führt.
      5. Zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 400 x g bei 20 °C ohne Unterbrechung (Beschleunigung 0, Verzögerung 0). Nach der Zentrifugation entnehmen Sie vorsichtig die Grenzflächenschicht der mononukleären Zellen mit einer sterilen Transferpipette. Überführen Sie die Zellen in ein anderes neues 50-mL-Konischrohr.
      6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Puffer (PBS mit zugesetztem Antikoagulans). Füllen Sie für die erste Wäsche das Zellröhrchen mit Puffer bis 50 mL auf. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 300 x g bei 20 °C, um die Zellen zu pelletieren (Beschleunigung 9, Verzögerung 0). Entfernen Sie vorsichtig die gesamte Überstandslösung.
      7. Führen Sie die zweite Wäsche zur Entfernung von Thrombozyten durch. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Endvolumen von 50 mL mit Puffer. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 200–300 x g bei 20 °C (Beschleunigung 9, Verzögerung 0).
      8. Rekonstituieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von 5 mL; diese Zellen sollten eine spezifische Dichte aufweisen, die niedrigdichten MNC <1,073 entspricht. Messen Sie die spezifische Dichte des Gradienten mit einem Densitometer.
      9. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Endvolumen von 100 mL mit 95 mL Medium hoher Dichte (1,083 g/mL) in einem Transferbeutel. Verwenden Sie dieses Produkt zur Reinigung mittels eines Zellseparators. Das Endvolumen von 100 mL enthält Zellen und Medium hoher Dichte (1,083 g/mL).
        HINWEIS: Der Buffy-Coat kann über Nacht im Kühlschrank in PBS mit 0,5 % BSA oder autologem Plasma aufbewahrt werden. Der Buffy-Coat kann ebenfalls gewaschen werden.
  8. Beladen Sie die vorgebildeten Gradienten mit maximal 30 mL MNC, die aus dem Buffy-Coat isoliert wurden und in 100 mL konzentriertem Konservierungsmedium suspendiert sind, mittels einer peristaltischen Pumpe mit 25 mL/min. Halten Sie den Gradienten bei +4 °C.
  9. Messen Sie kontinuierlich die Temperatur im Inneren des Zellprozessors mit einer vorkalibrierten Thermosonde. Überwachen Sie mithilfe eines digitalen Thermoelements, das mit einer sterilen Thermosonde verbunden ist, die Temperatur der Gradienten und Zellen während des Prozesses.

4. Optimierung verschiedener Schritte des Gradientenauftrags

  1. Setzen Sie das auf +4 °C vorgekühlte Zellprozessor-Kit ein. Laden Sie das schwere Gradientenmedium (130 mL) bei +4,5 °C auf. Stellen Sie am Ende des Gradientenauftrags die Zentrifuge auf eine relativ niedrige Drehzahl (537 x g), um die durch den Rotor erzeugte Wärme zu minimieren.
  2. Schalten Sie den Zellprozessor aus, um dem hydraulischen System zu ermöglichen, auf den Ausgangszustand vor dem Betrieb zurückzukehren, und um Luft abzulassen.
  3. Starten Sie den Zellprozessor erneut mit 537 x g und geben Sie das Medium mit hoher Dichte (130 mL) und das Medium mit niedriger Dichte (140 mL) hinzu, um ein kontinuierliches Dichtegradienten bei +4,3 °C und einer Fließgeschwindigkeit von 50 mL/min zu erzeugen.
  4. Laden Sie die Buffy Coat-Fraktion (30 mL) mit 100 mL kaltem Lagerungsmedium bei +6 °C und einer Fließgeschwindigkeit von 25 mL/min auf. Fügen Sie 50 mL (25 mL x 2) Waschlösung hinzu.
  5. Sammlen Sie nach 5 min bei +5 °C das zentrifugierte Gradientenmedium in 12 Flaschen mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 mL/min.
  6. Füllen Sie die Röhrchen mit Waschmedium (M199 + 20 % menschliches Albumin + 10 % Penicillin-Streptomycin). Füllen Sie Röhrchen 1 mit 100 mL Waschmedium und 150 mL Zellen sowie die Röhrchen 2–12 mit jeweils 225 mL Waschmedium und 25 mL Zellen.

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Ergebnisse

Die Auswirkung des gekühlten Zellprozessors auf den GMP-Reinraum wurde zunächst quantifiziert. Standardisierte Methoden verwendeten einen Partikelzähler, um die luftgetragene Partikelkontamination in einem GMP-Reinraum der Klasse C und Klasse B an kritischen Stellen in der Nähe des Zellprozessors und des Druckluftkühlsystems zu messen. Die Ergebnisse zeigten, dass sich keine Turbulenzen um das Gerät bildeten. Die aufgezeichneten Daten zeigten, dass die Grenzwerte für 0,5 µm und 5 µm luftgetragene Partikel gemäß den GMP-R...

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Diskussion

Inselisolierungsanlagen auf der ganzen Welt setzen seit Jahrzehnten die Reinigung menschlicher Inselzellen in einem umfunktionierten Zellprozessor ein. Obwohl einige Inselproduktionsanlagen Inselzellen weiterhin in einem ungekühlten Zellprozessor verarbeiten, verwenden die meisten Zentren eine gekühlte Version des Zellprozessors 10,11,15. Die Zentren platzieren den Zellprozessor entweder in einem Kühlraum, der den Hauptnachteil ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Die Autoren möchten das Europäische Genomische Institut für Diabetes (ANR-10- LABEX-0046 bis FP) und das Qatar Metabolic Institute - Hamad Medical Corporation, Katar danken. Die Autoren danken auch dem Medical Research Center der Hamad Medical Corporation für die Unterstützung bei den Artikelbearbeitungsgebühren.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Equipment
Air Particles counterLasair III 
AirJet XR40 SP ScientificFTS-System XR40
BiosicherheitswerkbankThermo ScientificEQ-1301
UmlaufkühlerJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
Konische KühlwanneBiorepCCT-01
Doppelwandiger Gradientenherstellerkundenspezifisches
KJT-Thermoelement-ThermometerHanna InstrumentsHI93551NZur Messung der Temperatur von Flüssigkeiten
Magnetrührer Thermo Scientific88880014
Schlauchpumpe MasterFlexMK-77921-79
Thermometer Extech InstrumentsRMS 430Für COBE-Temperatur
WasserlosesBead-Bad Cole-Parmer10122-00
Materialien und Reagenzien
BD Stammzell-ZählkitBD Biosciences 
COBE 2911 SchlauchsatzTerumo BCT90819
Konische Röhrchen 250mlCorning 430776
Gradientendichte 1,1Biochrom L6155
Graduierte EinwegflaschenThermo fisher382019-1000
Humanalbumin 20% Kedrion Biopharma 8091600 M199
Waschlösung Corning 99-784-CM 
Masterflex SchläucheMasterflex96400-6
Medical DryAir Linde Healthcare MediOn 22
Pencillin-StreptomycinGibco 
ThermosondeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan blau Sigma Aldrich15250061
Universität von Wisconsin Belzer (UW) Brücke des LebensRM/N 4055Konservierungsmedium
34456315140122

Referenzen

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