Method Article

Bewertung der Auswirkungen eines neuen Kühlzellenprozessorsystems auf die Inselzellisolationsanlage

DOI:

10.3791/65321

⸱

August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll hier beschreibt ein kundenspezifisches Kühlzellenprozessorsystem, das mit einem Reinraum für gute Herstellungspraktiken (GMP) kompatibel ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Verarbeitung zu verbessern.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standard-Zelltherapiegeräte, einschließlich des Goldstandard-Zellprozessors zur Reinigung menschlicher Inselzellen für die klinische Transplantation, werden selten gekühlt, wodurch die Zellen während des Zentrifugationsschritts möglicherweise erhöhten Temperaturen ausgesetzt werden. Kundenspezifische Kühlsysteme haben einen direkten Nutzen für die Lebensfähigkeit und Funktion der menschlichen Inseln. Die aktuelle Studie wurde konzipiert, um die Wirksamkeit eines neu entwickelten, leicht verfügbaren gekühlten Zellprozessorsystems zu testen, das minimale Modifikationen erfordert, und um seine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit menschlicher Zellen und die GMP-Reinraumumgebung zu bewerten. Das Kühlsystem, ein mechanisch gekühlter Wärmetauscher, der auf -30 °C eingestellt ist, wurde verwendet, um gekühlte trockene Luft in medizinischer Qualität durch ein Loch in der Zentrifugenabdeckung in die Zellprozessorschüssel zu leiten. Angesichts der begrenzten Verfügbarkeit von Bauchspeicheldrüsenspendern in Katar wurde die Systemvalidierung mit einer kontinuierlichen Dichtegradientenreinigung von gepooltem menschlichem Knochenmark-Buffy-Coat durchgeführt. Sterilität, Turbulenz und Partikelzahl wurden in Reinraumumgebungen der Klassen C und B gemessen. Um den gekühlten Zellprozessor herum bildeten sich keine Turbulenzen, und es wurden keine überschüssigen 0,5 μm und 5 μm Partikel in der Luft gemäß den GMP-Standards des Reinraums erzeugt. Zu Beginn und am Ende der Entnahmeschritte stieg die Temperatur auf 21,50 °C ± 0,34 °C bzw. 21,93 °C ± 0,20 °C im ungekühlten Zellprozessor und auf nur 10,9 °C ± 0,17 °C und 11,16 °C ± 0,35 °C im Kühlzellenprozessor an (p <0,05). Der gekühlte Zellprozessor führte sowohl zu einer verbesserten Rückgewinnung (98 %) der mononukleären Zellfraktion als auch zu einer verbesserten Viabilität (100 % ± 2 %) nach der Verarbeitung. Das neue Kühlsystem reduziert effektiv die vom Zellprozessor erzeugte Wärme, ohne dass die Partikel die GMP-Reinraumumgebung beeinträchtigen. Der hier beschriebene gekühlte Zellprozessor ist eine kostengünstige (16.000 US-Dollar ohne Steuern, Zollabfertigung und Transport) und minimalinvasive Methode zur Bereitstellung einer robusten Kühlung. Derzeit wird diese Technologie in der GMP-Zelltherapieanlage für die Isolierung und Transplantation menschlicher Inselzellen für das klinische Programm eingesetzt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inseltransplantation bei schwerem Typ-1-Diabetes kann die endogene Insulinsekretion wiederherstellen und ist in einer Reihe von Ländern zum Behandlungsstandard geworden1. Die Inselisolierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das einen warmen enzymatischen und mechanischen Aufschluss der Bauchspeicheldrüse umfasst, gefolgt von gekühlten Phasen zur Rückgewinnung des verdauten Gewebes und der Inselreinigung mit kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Dichtegradienten auf einem Zellprozessor. Die schnelle Abkühlung verlangsamt die enzymatische Verdauungsphase und schützt die Inselzellen vor Verdauungsenzymen, die durch die Kontamination der Azinuszellen freigesetzt werden. Der Zellprozessor wurde ursprünglich entwickelt, um zelluläre Blutbestandteile bei Umgebungstemperatur zu trennen2. Es wurde 1989 zur Reinigung der menschlichen Pankreasinseln von Langerhans umfunktioniert3. Seit drei Jahrzehnten werden menschliche Inselzellen für klinische Studien und in jüngerer Zeit für die Standardbehandlung gereinigt, entweder in einem Zellprozessor mit diskontinuierlichen Gradienten4 oder in kontinuierlichen Dichtegradienten1, der mit einem Gradient Maker1 oder einem gleichwertigen computergesteuerten Mixer hergestellt wurde5,6,7. Andere Gruppen haben berichtet, dass die Reinigung von Inselzellen durch große Säugetiere und Menschen mit großen zylindrischen Plastikflaschen durchgeführt wurde8,7,9, was die Wirksamkeit der Reinigung und die Qualität der Inselzellen erheblich verbesserte.

In der Tat, unter Berücksichtigung des Goldstandards zur Reinigung menschlicher Inselzellen für klinische Transplantationen10,11, war der hergestellte Zellprozessor ohne Kühlung. Als direkte Folge der fehlenden Kühlung wurden die Inselzellen während des Reinigungsschritts steigenden Temperaturen ausgesetzt. Während der Zentrifugation kommt es aufgrund der mechanischen Reibung des Rotors zu einem unkontrollierten Temperaturanstieg12,13. Die Zellprozessoren wurden mit einem Kühlsystem in Inselisolationszentren ausgestattet, das die glukoseinduzierte Insulinsekretion und die Zellviabilität statistisch erhöhte, was den Vorteil bestätigte, die Pankreasinseln während des Reinigungsverfahrens bei niedrigen Temperaturen zu halten14,15.

Es sollte beachtet werden, dass in den späten 1980er Jahren 10 gekühlte Prototypen gebaut wurden, um die Beschädigung von Inselzellen während der Reinigung durch Dichtegradienten zu reduzieren, aber keine weitere Aufmerksamkeit erhielten. Die Prototypen der Zellprozessoren basierten auf einer Spindel- und Trommelkühlung mit gekühltem Polyethylenglykol. Insbesondere Lösungen zur Reinigung von Inselzellen, einschließlich Lösungen zur Organkonservierung und Polysaccharid-Dichtegradienten, können für die Lebensfähigkeit von Inselzellen schädlich sein, wenn sie bei oder über Raumtemperatur verwendet werden16,17,18. Ein Vergleich verschiedener Kühlstrategien des Zellprozessors für die Reinigung von Inselzellen mit dem ursprünglichen ungekühlten Zellprozessor wurde evaluiert, um dem unkontrollierten Temperaturanstieg entgegenzuwirken, der durch die Reibung des Rotors auftritt. Es wurden mehrere Versuche unternommen, den Zellprozessor während der Reinigung menschlicher Inselzellen abzukühlen. Der Zellprozessor kann vorübergehend oder dauerhaft in einem speziell entwickelten Kühlraum untergebracht werden, um eine Temperatur von 0-8 °C aufrechtzuerhalten19 während der Gradientenzentrifugation, die derzeit in den Inselisolationszentren an der University of Illinois Chicago verwendet wird, 19, University of Miami14, University of Oxford facilities15und die University of San Francisco (die benutzerdefinierte Kühleinheit umhüllt den Zellprozessor). Eine weitere Modifikation umfasst die Kernkühlung der Zellprozessorspindel mit einem Kühlsystem unter Verwendung elektronisch gesteuerter Flüssigstickstoffkühlung in Genf, Schweden, und der Tschechischen Republik15,19. Eine weitere Alternative war Mitte 2000 die Kernkühlung des Zellprozessors mit einer Klimaanlage 12 oder durch Flüssigkeitskühlung des Schachtes an der Universität Lille.

Kühlmodifikationen des Zellenprozessors sind nicht ohne weiteres verfügbar und bergen Risiken (Feuchtigkeit, Kondensationsbildung) in GMP-Reinraumumgebungen, einschließlich des Verlusts der Garantie und der Weigerung des Erbauers, die Maschine zu warten. Folglich verwenden einige Inselzentren, darunter Mailand, Italien, Oslo, Norwegen und Edinburgh, Schottland, kein Kühlsystem für Zellprozessoren während des Inselreinigungsprozesses15.

Die aktuelle Studie wurde konzipiert, um die Wirksamkeit eines neu entwickelten, leicht verfügbaren Kühlers in Verbindung mit einem minimal modifizierten Zellprozessorsystem zu testen. Kurz gesagt, der hier beschriebene luftbasierte Kühler ist ein mechanisch gekühlter Wärmetauscher, der die Temperatur von 1 Standardkubikfuß pro Minute (SCFM) trockenen Gases zwischen -40 °C und -100 °C regelt. Dieses Kühlsystem erfordert eine trockene medizinische Luftzufuhr. Die Luft strömt durch die Leitung und den Wärmetauscher und durch die Düse (7,9 mm) nach außen. Eine Heizung, die sich in der Düse befindet, liefert Wärme, um die Temperatur des Luftstroms zu regeln. Es wurde eine Ersatzabdeckung für eine Zentrifuge aus festem Kunststoff gekauft, und es wurden nur minimale Änderungen vorgenommen. In den Deckel wurde ein Loch mit einem Durchmesser von 13,3 mm gebohrt und über das Loch im Zentrifugendeckel gekühlte Luft aus der Kühlerdüse zum Zellprozessor geleitet. Die gekühlte medizinische Luft wurde in die Zentrifugationstrommel des Zellprozessors injiziert, wobei die Temperatur der Flüssigkeiten oder Dichtegradienten ständig kontrolliert wurden.

Wir haben die technische Leistung des gekühlten Zellprozessors und den Einfluss des Kühlelements auf die GMP-Reinraumumgebung bewertet. Das Hauptaugenmerk lag darauf, eine robust niedrige Temperatur (<10 °C) während der Reinigung menschlicher Inselzellen zu erreichen, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Unter Verwendung einer Buffy-Coat-Dichtetrennung als Proxy für die Inselisolierung haben wir die Wirksamkeit dieses Kühlprotokolls auf die Zellviabilität bestimmt.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll verwendete weggeworfenes Vollblut, das gemäß den Entsorgungsrichtlinien der Institution nicht verwendet werden kann. Die IRB-Genehmigung und die Einwilligungserklärung nach Aufklärung sind nicht anwendbar.

1. Aufbau des Kühlzellenprozessors

HINWEIS: Alle Verfahren müssen in einer Reinraumumgebung durchgeführt werden, und das Personal muss die Bekleidungsverfahren in Reinräumen einhalten.

  1. Kauf von Ausrüstung
    1. Kaufen Sie einen Ersatzdeckel aus Plexiglas. Kaufen Sie das Kühlgerät, den Kühler mit mechanisch gekühltem Gasstrom-Temperaturregler, den Lufttrockner, den Druck- und Durchflussregler sowie die Garantie (optional). Siehe Materialtabelle für Referenzen.
      HINWEIS: Die Gesamtkosten betragen 16.133 USD ohne Versand- oder Zollgebühren.
    2. Bestellen Sie medizinische Trockenluft, ein komprimiertes medizinisches Gas, das der Standardqualität (Europäisches Arzneibuch Referenz 1238) entspricht, beim örtlichen medizinischen Gaslieferanten. Kaufen Sie 2 Zylinder à 6,8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; Durchmesser x Länge).
  2. Aufbau der Ausrüstung (Abbildung 1 und Abbildung 2)
    1. Betreten Sie die Geräte in den GMP-Reinraum (desinfizieren Sie vor dem Betreten des Reinraums gemäß GMP-Verfahren.
    2. Für die medizinische Druckluft installieren Sie eine Gasleitung, anstatt die Gasflasche direkt im Reinraum aufzustellen.
  3. Modifikation des Zellprozessors zur Kühlung
    1. Entfernen Sie zunächst die Plexiglasabdeckung. Bewahren Sie die Original-Plexiglasabdeckung auf, falls es ein Problem mit der Garantie gibt. Bohren Sie ein Loch in den Ersatzdeckel des Zellprozessors mit einem Durchmesser, der dem Außendurchmesser der Düsenspitze des Kühlgeräts entspricht und passt, um ein Reißen der Zentrifugenabdeckung zu verhindern (empfohlen 13,3 mm).
    2. Befestigen Sie die Halterungen mit einem kreisförmigen Stück Schaumstoff. Dies geschieht, um einen Bruch und/oder Kratzer des Deckels zu verhindern, die Kühlerdüse über dem Zellprozessor an Ort und Stelle zu halten, den Deckel vor übermäßigem Verbiegen aufgrund des hohen Drucks der eingespritzten Luft zu schützen, das Gewicht der Düse zu tragen und schließlich die maximale Sicherheit für den Bediener zu gewährleisten, während des Versuchsverfahrens freien und sicheren Zugang zu allen erforderlichen Funktionen des Zellprozessors zu haben.
    3. Verbinden Sie das Kühlsystem mit dem Zellprozessor, indem Sie die Kühldüse an dem Loch im Plexiglas befestigen. Befestigen Sie es mit Halterungen und Schaumstoffkissen.
    4. Platzieren Sie das Kühlgehäuse bis zu 2,44 m (8 Fuß) von der Düse entfernt. Bewahren Sie den Temperaturregler in einem separaten Schrank auf und platzieren Sie ihn innerhalb von 1,83 m (6 Fuß) vom Kühlgehäuse.
    5. Stellen Sie den Sollwert des Kühlers auf -40 °C ein, um den Luftstrom am Kühler zu kühlen. Die Austrittslufttemperatur wird kontinuierlich auf der Digitalanzeige mit einer Auflösung von 0,1 °C angezeigt. Stellen Sie die Austrittstemperatur mit dem Temperaturregler digital auf 0,1 °C ein.
    6. Steuern Sie den Druck und die Durchflussmenge der Luftzufuhr am Druck- und Durchflussreglermodul (Abbildung 2), bevor Sie dem Kühler zuführen. Stellen Sie sie auf 55 psi bzw. 4 SCFM-Durchflussraten ein, um die optimalen Bedingungen bei einem bei -30 °C ± 2 °C gekühlten Luftstrom zu erreichen.
    7. Stellen Sie sicher, dass die Versorgung mit medizinischen Gasen auf einen Ausgangsdruck von 5 bar geregelt ist und mindestens 90 min dauern kann, da dies erforderlich ist, damit die Druckluft -30 °C erreicht.
      HINWEIS: Medizinische Trockenluft ist ein komprimiertes medizinisches Gas, und trockene Druckluft unter vollem Druck entspricht der Standardqualität.
    8. Geben Sie 5 bar aus einer Kühlerdüse, die mit dem Deckel des Zellprozessors verbunden ist, durch ein Loch in der Zentrifugenabdeckung ab. Injizieren Sie die abgekühlte medizinische Luft in die Zentrifugationstrommel des Zellprozessors (Abbildung 2). Wählen Sie die Position der Lufteinblasung so, dass die gekühlte Luft senkrecht zum Aluminiumrand des Zentrifugenrotors geleitet wird.
    9. Achten Sie bei der Vorbereitung des Zellprozessors darauf, dass der Rotor Raumtemperatur (18 °C) hat. Stellen Sie den automatischen Thermoregler des Kühlsystems auf -30 °C und leiten Sie die Kühllufteinblasung auf den Rotor.
      HINWEIS: Es wurden verschiedene Versuchsbedingungen getestet, um einen optimalen Temperaturgradienten von +4 °C zu erreichen, der erforderlich ist, um den Wärmewiderstand des Zellprozessor-Zellseparatorsystems und die Erwärmung des Rotors während der Zentrifugation zu überwinden. Der programmierte Thermoregler hält die optimale Zieltemperatur in der Zellbearbeitungsmaschine während des Eingriffs, insbesondere während der Zentrifugation, bei einer Reinraumtemperatur von +18 °C aufrecht.
      1. Richten Sie den Zellenprozessor mit der ersten Vorkühlphase ein, um den Prozessor (ohne das Cellprozessor-Kit) 30 bis 45 Minuten lang auf +3 °C abzukühlen, und die zweite Vorkühlphase des Betriebs des Zellenprozessors sollte mit dem Kit bei +4 °C bei 134 x g für 5 Minuten vorgekühlt werden.

2. Anzahl der Partikel in der Luft

  1. Bewerten Sie die Konformität des Kühlgeräts mit der GMP-Reinraumumgebung gemäß der Norm ISO 14644-1, um die Auswirkungen von Wärmegeräten während der Betriebsphase zu bewerten.
  2. Nutzen Sie die Partikelzählungsüberwachung, um den Nachweis zu erbringen, dass das erforderliche Maß an Sauberkeit an kritischen Kontrollpunkten im Ruhezustand und im Betrieb erreicht wird.
    1. Die Mindestanzahl der Probenstellen hängt von der gemessenen Fläche ab. Berechnen Sie dies mit der Gleichung
      figure-protocol-1
      Dabei ist A die Fläche des Reinraums oder des Reinluft-kontrollierten Raums in m2 und NL die Anzahl der Probenstellen, aufgerundet auf eine ganze Zahl.
    2. Das Probenahmevolumen in der Luft ist das Mindestvolumen an jedem Standort. Stellen Sie sicher, dass das Luftvolumen groß genug ist, um 20 Partikel der größten angegebenen Partikelgröße zu zählen. Berechnen Sie das Probenahmevolumen in der Luft durch die Gleichung
      V= 20/C x 1000
      Dabei ist V das minimale Einzelprobenvolumen pro Stelle, ausgedrückt in L, und C die Klassengrenze (Anzahl der Partikel/m3).
    3. Verwenden Sie für jeden Standort je nach Gebiet eine oder mehrere Proben. Stellen Sie sicher, dass das kleinste Probenvolumen an jedem Standort 2 l und die minimale Probenzeit mindestens 1 Minute beträgt.
  3. Spülen Sie vor der Probenahme das Partikelzählergerät mit einem Spülfilter. Entfernen Sie den Filter und legen Sie ihn zur Probenahme in die isokinetische Sonde.
  4. Platzieren Sie das Partikelmessgerät an der angegebenen Probenahmestelle. Starten Sie die Probenentnahme über den Hauptbildschirm des Partikelzählers.
  5. Sobald die Probenahme abgeschlossen ist, bringen Sie das Partikelmessgerät zum nächsten Standort. Wenn alle Speicherorte für die Probenahme abgeschlossen sind, überprüfen Sie die Daten, und drucken Sie einen Bericht.
  6. Wenn die durchschnittliche Partikelkonzentration für alle Probenahmestellen in dem Gebiet unter die in Tabelle 1 angegebene Klassengrenze fällt, ist der durchgelassene Raum als zulässige Partikelkonzentration zu betrachten.

3. Gradientenvorbereitung und Zelltrennungsprozess

  1. Vor dem Experimentieren sollten die leichten und schweren Dichtegradienten sowie die Zellprozessor-Kits über Nacht bei +4 °C im Kühlschrank vorgekühlt werden.
  2. Kühlen Sie den Zellprozessor 45 Minuten lang im Ruhezustand vor (d. h. schalten Sie den Zellprozessor vor der Verwendung ein). Halten Sie die Temperatur zwischen +2 °C und +5 °C. Setzen Sie das Zellenprozessor-Kit vorgekühlt bei +4 °C ein.
  3. Für den standardmäßigen ethanolgekühlten doppelwandigen Gradientenmacher (optional; Abbildung 3) Verbinden Sie die 2 Glaskammern und legen Sie sie auf einen Magnetrührer. Klemmen Sie den Schlauch zwischen die 2 Kammern. Kühlen Sie den Gradientenmacher mit einem Ethanol-Umlaufkühler auf 0 °C.
  4. Bereiten Sie zunächst das Laden der schweren Schicht am Boden des Beutels vor, indem Sie die Kammer mit 130 mL starkem Dichtegradienten (HD; 1,087 g/ml). Belastung mit einer Pumpendrehzahl von 150 mL/min.
  5. Sobald sich der starke Gradient im Beutel befindet, geben Sie 130 mL hoher Dichte (HD) in das vordere Becherglas und 140 mL mit niedriger Dichte (LD; 1,063 g/mL) Gradienten nach hinten (Klemme geschlossen).
  6. Lösen Sie den Hämostat/die Klemme zwischen den 2 Kammern und erzeugen Sie einen kontinuierlichen Gradienten bei einer Pumpendrehzahl von 50 mL/min.
  7. Bereiten Sie im Voraus humane mononukleäre Buffy-Coat-Zellen für die Reinigung aus mehreren gepoolten anonymen Buffy-Coats vor, die aus Vollblutabfallprodukten gesammelt wurden (40 ml bis 60 ml Vollblut wurden in 10 Buffy-Coat-Beutel gegeben), je nach Verfügbarkeit aus der Blutbank.
    1. MNC-Trennung
      1. Verwenden Sie die Dichtegradientenzentrifugation für die Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen mit geringer Dichte. Führen Sie dazu die unten beschriebenen Schritte aus.
      2. Berechnen Sie für die Zellvorbereitung das Blutvolumen (antikoaguliertes Vollblut oder suspendierter Buffy Coat). Verdünnen Sie das Blut mit 2x-4x Pufferlösung, indem Sie die Inversion mischen. Je verdünnter das Blut ist, desto besser ist die Reinheit der mononukleären Zellen.
      3. Bereiten Sie den Puffer vor, indem Sie den Phosphatpuffer mit einem Antikoagulans mischen. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Röhrchen, indem Sie das Blutvolumen durch 35 ml dividieren und 15 ml 1,073 Dichtegradientenlösung in jedes Röhrchen gießen.
      4. Schichten Sie nach und nach 35 ml der verdünnten Blutsuspension über den Dichtegradienten, indem Sie mit einer 60-ml-Spritze, die mit einer Nadel verbunden ist, vorsichtig über die Oberfläche des Dichtegradienten gleiten; für kleine Volumina verwenden Sie eine Pipette. Versuchen Sie, die Grenzfläche nicht zu stören, da dies zu einer schlechten mononuklearen Schicht führt.
      5. Zentrifugieren bei 400 x g für 20 min bei 20 °C ohne Unterbrechungen (Beschleunigung 0, Verzögerung 0). Nach der Zentrifugation wird die Grenzschicht mononukleärer Zellen mit einer sterilen Transferpipette schonend geerntet. Übertragen Sie die Zellen in ein weiteres neues konisches 50-ml-Röhrchen.
      6. Waschen Sie die Zellen 2x mit Puffer (PBS mit Zusatz von Antikoagulans). Füllen Sie für die erste Wäsche das Röhrchen mit den Zellen mit Puffer bis zu 50 mL. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 20 °C zu Pelletzellen (Beschleunigung 9, Verzögerung 0). Entfernen Sie vorsichtig alle Überstände.
      7. Führen Sie die zweite Wäsche zur Entfernung von Blutplättchen durch. Resuspendieren Sie das Pellet mit Puffer auf ein Volumen von 50 mL. Zentrifugieren bei 200-300 x g für 10 min bei 20 °C (Beschleunigung 9, Verzögerung 0).
      8. Rekonstituieren Sie die Zellen bis zu einem Endvolumen von 5 ml, diese Zellen sollten ein spezifisches Gewicht haben, das dem MNC <1,073 mit niedriger Dichte ähnelt. Messen Sie die spezifische Dichte des Gradienten mit einem Dichtemesser.
      9. Resuspendieren Sie das Pellet auf ein Endvolumen von 100 mL mit 95 mL Gradientenmedium hoher Dichte (1,083 g/mL) in einem Transferbeutel. Verwenden Sie dieses Produkt zur Aufreinigung mit einem Zellseparator. Das endgültige Volumen von 100 mL enthält Zellen und 1,083 Gradientenmedium mit hoher Dichte.
        HINWEIS: Der Buffy Coat kann über Nacht im Kühlschrank in PBS mit 0,5 % BSA oder autologem Plasma aufbewahrt werden. Der Buffy Coat kann auch gewaschen werden.
  8. Die vorgeformten Gradienten mit maximal 30 mL MNC, isoliert vom Buffy Coat, in 100 mL konzentriertem Konservierungsmedium suspendiert, mit einer Peristaltikpumpe bei 25 mL/min von oben beladen. Halten Sie den Gradienten bei +4 °C.
  9. Messen Sie kontinuierlich die Temperatur im Zellprozessor mit einem vorkalibrierten Thermofühler. Überwachen Sie mit einem digitalen Thermoelement, das mit einer sterilen Thermosonde verbunden ist, die Temperatur von Gradienten und Zellen während des Prozesses.

4. Optimierung verschiedener Schritte der Gradientenbelastung

  1. Setzen Sie das bei +4 °C vorgekühlte Zellenprozessor-Kit ein. Laden Sie den starken Gradienten (130 mL) bei +4,5 °C. Am Ende der Gradientenbelastung stellen Sie die Zentrifuge auf eine relativ niedrige Drehzahl (537 x g) ein, um die vom Rotor erzeugte Wärme zu minimieren.
  2. Schalten Sie den Zellenprozessor aus, damit das Hydrauliksystem wieder auf das Niveau vor dem Lauf zurückkehrt und Luft ablassen kann.
  3. Starten Sie den Zellprozessor bei 537 x g neu und fügen Sie die starken (130 mL) und niedrigen (140 mL) Dichtegradienten hinzu, um einen kontinuierlichen Dichtegradienten bei +4,3 °C und eine Flussrate von 50 mL/min zu erzeugen.
  4. Befüllen Sie den Buffy Coat (30 mL) mit 100 mL Kühlmedium bei +6 °C und einer Durchflussrate von 25 mL/min. Fügen Sie 50 mL (25 mL x 2) Waschlösung hinzu.
  5. Nach 5 min bei +5 °C den geschleuderten Gradienten in 12 Flaschen bei einer Durchflussrate von 100 mL/min auffangen.
  6. Füllen Sie die Röhrchen mit Waschmedien (M199 + 20 % Humanalbumin + 10 % Penicillin, Streptomycin). Füllen Sie das Röhrchen 1 mit 100 mL Waschmedium und 150 mL Zellen und die Röhrchen 2-12 mit 225 mL Waschmedium und 25 mL Zellen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Einfluss des gekühlten Zellprozessors auf den GMP-Reinraum wurde zunächst quantifiziert. Standardisierte Methoden verwendeten einen Partikelzähler, der die Kontamination von Partikeln in der Luft in einer Reinraumumgebung der GMP-Klasse C und Klasse B an kritischen Punkten in der Nähe des Zellprozessors und des Druckluftkühlersystems misst. Die Ergebnisse zeigten, dass sich keine Turbulenzen um die Anlage herum entwickelten. Die aufgezeichneten Daten zeigten, dass es keinen Überschuss an 0,5 μm und 5 μm Partikeln in ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inselisolierungsanlagen auf der ganzen Welt setzen seit Jahrzehnten die Reinigung menschlicher Inselzellen in einem umfunktionierten Zellprozessor ein. Obwohl einige Inselproduktionsanlagen Inselzellen weiterhin in einem ungekühlten Zellprozessor verarbeiten, verwenden die meisten Zentren eine gekühlte Version des Zellprozessors 10,11,15. Die Zentren platzieren den Zellprozessor entweder in einem Kühlraum, der den Hauptnachteil ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten das Europäische Genomische Institut für Diabetes (ANR-10- LABEX-0046 bis FP) und das Qatar Metabolic Institute - Hamad Medical Corporation, Katar danken. Die Autoren danken auch dem Medical Research Center der Hamad Medical Corporation für die Unterstützung bei den Artikelbearbeitungsgebühren.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Air Particles counterLasair III 
AirJet XR40 SP ScientificFTS-System XR40
BiosicherheitswerkbankThermo ScientificEQ-1301
UmlaufkühlerJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
Konische KühlwanneBiorepCCT-01
Doppelwandiger Gradientenherstellerkundenspezifisches
KJT-Thermoelement-ThermometerHanna InstrumentsHI93551NZur Messung der Temperatur von Flüssigkeiten
Magnetrührer Thermo Scientific88880014
Schlauchpumpe MasterFlexMK-77921-79
Thermometer Extech InstrumentsRMS 430Für COBE-Temperatur
WasserlosesBead-Bad Cole-Parmer10122-00
Materialien und Reagenzien
BD Stammzell-ZählkitBD Biosciences 
COBE 2911 SchlauchsatzTerumo BCT90819
Konische Röhrchen 250mlCorning 430776
Gradientendichte 1,1Biochrom L6155
Graduierte EinwegflaschenThermo fisher382019-1000
Humanalbumin 20% Kedrion Biopharma 8091600 M199
Waschlösung Corning 99-784-CM 
Masterflex SchläucheMasterflex96400-6
Medical DryAir Linde Healthcare MediOn 22
Pencillin-StreptomycinGibco 
ThermosondeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan blau Sigma Aldrich15250061
Universität von Wisconsin Belzer (UW) Brücke des LebensRM/N 4055Konservierungsmedium
34456315140122

References

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