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Methodenartikel

Normothermische isolierte Leberperfusion bei Schweinen

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DOI:

10.3791/65336

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9. Juni 2023

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1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Laboratory of Abdominal Transplantation, KU Leuven, 2Department of Abdominal Transplant Surgery and Coordination, University Hospitals Leuven

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Schweinemodell der normothermen maschinellen Perfusion (NMP) der Leber kann erfolgreich zur Untersuchung von NMP als Konservierungsstrategie, als Instrument zur Bewertung der Lebensfähigkeit und als Plattform für die Organreparatur eingesetzt werden. Es hat einen hohen translationalen Wert, ist jedoch technisch anspruchsvoll und arbeitsintensiv.

Zusammenfassung

Schweinemodelle der ex situ normothermen maschinellen Perfusion (NMP) der Leber werden zunehmend in der Transplantationsforschung eingesetzt. Im Gegensatz zu Nagetieren ist die Leber von Schweinen anatomisch und physiologisch dem Menschen ähnlich, mit ähnlicher Organgröße und Gallenzusammensetzung. NMP konserviert das Lebertransplantat unter nahezu physiologischen Bedingungen, indem es ein warmes, sauerstoffreiches und mit Nährstoffen angereichertes Perfusat auf Basis roter Blutkörperchen durch das Lebergefäßsystem zirkuliert. NMP kann verwendet werden, um Ischämie-Reperfusionsschäden zu untersuchen, eine Leber ex situ vor der Transplantation zu konservieren, die Leberfunktion vor der Implantation zu beurteilen und eine Plattform für die Organreparatur und -regeneration bereitzustellen. Alternativ kann NMP mit einem Perfusat auf Vollblutbasis verwendet werden, um eine Transplantation nachzuahmen. Dennoch ist dieses Modell arbeitsintensiv, technisch anspruchsvoll und mit hohen finanziellen Kosten verbunden.

In diesem schweinischen NMP-Modell verwenden wir warme ischämisch geschädigte Lebern (entsprechend der Spende nach Kreislauftod). Zunächst wird eine Vollnarkose mit mechanischer Beatmung eingeleitet, gefolgt von der Einleitung einer warmen Ischämie durch Abklemmen der thorakalen Aorta für 60 min. Kanülen, die in die Bauchschlagader und die Pfortader eingeführt werden, ermöglichen das Ausspülen der Leber mit Kältekonservierungslösung. Das ausgeschwemmte Blut wird mit einem Zellschoner gewaschen, um konzentrierte rote Blutkörperchen zu erhalten. Nach der Hepatektomie werden Kanülen in die Pfortader, die Leberarterie und die infrahepatische Hohlvene eingeführt und mit einem geschlossenen Perfusionskreislauf verbunden, der mit einem Plasmaexpander und roten Blutkörperchen vorbereitet ist. Ein Hohlfaseroxygenator ist im Kreislauf enthalten und mit einem Wärmetauscher gekoppelt, um einen pO2 von 70-100 mmHg bei 38 °C aufrechtzuerhalten. NMP wird durch einen kontinuierlichen Fluss direkt durch die Arterie und über ein venöses Reservoir durch die Pfortader erreicht. Durchflüsse, Drücke und Blutgaswerte werden kontinuierlich überwacht. Um die Leberschädigung zu beurteilen, werden Perfusat und Gewebe zu vordefinierten Zeitpunkten beprobt; Die Galle wird über eine Kanüle im gemeinsamen Gallengang gesammelt.

Einleitung

Die Lebertransplantation ist die einzige endgültige Behandlung für Leberversagen im Endstadium. Der Erfolg wird jedoch durch ein anhaltendes Ungleichgewicht zwischen Patienten auf der Warteliste und der Verfügbarkeit potenzieller Spenderorgane begrenzt1. Um den Spenderpool zu vergrößern, wurden die Spenderkriterien in den letzten zehn Jahren schrittweise erweitert, einschließlich des höheren Spenderalters, der Lebersteatose und der Spende nach Kreislauftod (DCD)2,3. Während eines DCD-Eingriffs erleidet die Leber ausnahmslos eine Periode warmer Ischämie zwischen dem Absetzen der lebenserhaltenden Therapie, der Erklärung des Todes und der In-situ-Kühlung und -Konservierung, was die Ischämie-Reperfusions-Schädigung (IRI) verschlimmert4. Infolgedessen sind DCD-Lebern mit einer erhöhten Inzidenz von frühen Allotransplantatfunktionsstörungen und Gallenkomplikationen verbunden 5,6.

Für diese Hochrisiko-Spenderlebern bietet die konventionelle Konservierung mit statischer Kühllagerung keinen ausreichenden Schutz vor IRI. In diesem Zusammenhang haben alternative Konservierungsstrategien wie die normotherme maschinelle Perfusion (NMP) erheblich an Bedeutung gewonnen. Bei der normothermen maschinellen Perfusion wird die Leber ex situ an einen isolierten Kreislauf angeschlossen und bei Körpertemperatur mit einem sauerstoffhaltigen und nährstoffangereicherten Perfusat perfundiert. Klinische Studien deuten darauf hin, dass NMP die hepatozelluläre Schädigung reduziert, was sich in einer verringerten maximalen Transaminasefreisetzung und einer frühen Dysfunktion des Allotransplantats widerspiegelt7. Über die Biologie der Leberzellen während des NMP8 ist jedoch wenig bekannt.

Tiermodelle waren für die Evolution der Lebertransplantation von entscheidender Bedeutung. Im Gegensatz zu Nagetiermodellen wird dem Schwein ein höherer translationaler Wert zugeschrieben, da die Schweineleber anatomisch und physiologisch dem Menschen nahe steht und eine ähnliche Organgröße und Gallenzusammensetzung aufweist. Nichtsdestotrotz sind Modelle zur Lebertransplantation von Schweinen arbeitsintensiv, schwer zu standardisieren und mit einem deutlich höheren finanziellen Aufwand verbunden.

Schweineleber-NMP kann für verschiedene Zwecke verwendet werden. Es kann zur Nachahmung einer ex-situ-Transplantation bei Verwendung eines Perfusats auf Vollblutbasis angewendet werden, zur Konservierung einer Spenderleber in einer schützenden Umgebung mit einem leukozytendepletierten Perfusat auf Basis roter Blutkörperchen, zur Bewertung potenzieller Biomarker, die die Leberfunktion ex situ vor der Transplantation vorhersagen, oder als Plattform zur Untersuchung regenerativer Therapien 9,10,11.

Die Einführung von NMP-Modellen für die Schweineleber ist eine Herausforderung, während chirurgische und perfusionsbezogene technische Aspekte kaum beschrieben werden. In unserem Forschungslabor haben wir den ursprünglich von Butler et al.12 beschriebenen NMP-Aufbau übernommen, um ein 24-Stunden-Ex-situ-isoliertes Leberperfusionsmodell für Schweine zu entwickeln und zu validieren, das sowohl zur Konservierung eines Lebertransplantats für die Transplantation als auch zur Nachahmung eines Transplantats verwendet werden kann. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll; Ein methodischer Rahmen und mögliche Fallstricke werden an anderer Stelle veröffentlicht9.

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Protokoll

Alle Versuche wurden nach Genehmigung durch den Tierpflegeausschuss der KU Leuven und in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinien durchgeführt.

1. Informationen über Tiere

HINWEIS: Für dieses Studienprotokoll werden männliche TOPIGS TN70-Schweine im Alter von 3 Monaten, mit einem Körpergewicht von ca. 30 kg und einem Lebergewicht von 600-700 g verwendet.

  1. Halten Sie die Tiere in einem Tag-Nacht-Rhythmus von 12 Stunden in Einzelbuchten mit freiem Zugang zu Futter und Leitungswasser sowie visuellem, olfaktorischem und auditivem Kontakt zwischen ihnen.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Tiere mindestens 2 Tage vor der Operation eintreffen, um sich an ihre Umgebung zu gewöhnen. Fasten Sie die Schweine 12 Stunden vor der Operation mit freiem Zugang zu Wasser.
    HINWEIS: Die Anästhesie wird mit Isofluran und die Analgesie mit Fentanyl aufrechterhalten. Während der Anästhesie werden das Elektrokardiogramm, die Pulsoximetrie, die Kapnographie und der Blutdruck kontinuierlich überwacht. Die Experimente sind endgültig; Die Schweine werden durch Ausblutung eingeschläfert, während die Leber unter fortgesetzter Vollnarkose und Analgesie entnommen wird.

2. Vorbereitung des Perfusionsaufbaus

  1. Installation des Einweg-Perfusionskitus
    1. Befestigen Sie das Reservoir in einer festen Höhe, die ca. 15 cm höher ist als das Lebergefäß.
    2. Verbinden Sie den Pumpenkopf mit dem dafür vorgesehenen Schlitz an der Kreiselpumpe. Verbinden Sie den Sauerstoffschlauch mit dem Oxygenator. Verbinden Sie die Ein- und Auslaufrohre des Heizgeräts/Kühlers mit den dafür vorgesehenen Schlitzen am Oxygenator.
    3. Installieren Sie ein Quetschventil am Abflussrohr unter dem Behälter. Installieren Sie das zweite Quetschventil am Zuflussschlauch zum Reservoir nach dem Y-Anschluss, wo der andere Schlauch die Leberarterie speist.
      HINWEIS: Das erste Quetschventil steuert den Zufluss in die Pfortader. Das Schließen des zweiten Quetschventils erhöht den Durchfluss und damit auch den Druck in der Leberarterie.
    4. Installieren Sie den Durchflusssensor distal vom ersten Quetschventil am Abflussrohr des Behälters. Installieren Sie den zweiten Durchflusssensor am Zuflussrohr zum Pumpenkopf.
      HINWEIS: Der erste Durchflusssensor misst den Durchfluss in die Pfortader. Der zweite Durchflusssensor misst den Abfluss aus der Hohlvene.
    5. Schneiden Sie den Abflussschlauch vom Oxygenator ab und führen Sie den arteriellen Filter in die richtige Richtung ein.
      HINWEIS: Schneiden Sie den Schlauch auf nicht länger als 2 cm nach dem Oxygenator ab. Wenn es zu lange belassen wird, knickt es, wenn der Schlauch weicher wird, wenn er mit einem 37 °C Perfusat durchblutet wird. Wenn er immer noch knickt, stützen Sie den arteriellen Filter, indem Sie ihn an die Stütze des Reservoirs binden.
  2. Einbau des Leckage-Rezirkulationsrohrs
    1. Das Perfusionskit enthält zwei Röhren mit einem 3/16-Ende und einem 1/16-Ende. Verbinden Sie die beiden Rohre miteinander, indem Sie das 1/16-Ende in das 3/16-Ende einführen. Verbinden Sie das 3/16-Ende mit dem Behälter.
    2. Bauen Sie den Schlauch unter Berücksichtigung der Drehrichtung in die Rollenpumpe ein. Stellen Sie den richtigen Schlauchdurchmesser ein und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 15-18 Umdrehungen pro Minute (U/min) ein. Setzen Sie das 1/16-Ende in das Lebergefäß ein und fixieren Sie es gegebenenfalls.
  3. Kontinuierliche Inline-Kalibrierung der Blutgasanalyse
    1. Schalten Sie den Gasanalysator ein und wählen Sie Kalibrieren.
    2. Überprüfen Sie die korrekte Seriennummer auf der Sensorverpackung und drücken Sie OK.
    3. Nehmen Sie den arteriellen Sensorhalter aus der Kassette und verbinden Sie den Sensor mit einer blauen Kappe oben und einem weißen Filter unten.
    4. Schrauben Sie die weiße Kappe unter dem Filter ab und entfernen Sie sie. Schrauben Sie den Filter selbst nicht ab. Lösen Sie die blaue Entlüftungskappe oben, entfernen Sie sie nicht. Setzen Sie den Sensor und die Sensorhalterung fest in die Kalibrierkassette ein.
    5. Starten Sie die Kalibrierung. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Sensor und die Sensorhalterung von der Kalibrierkassette. Entfernen Sie den weißen Filter an der Unterseite und ziehen Sie die blaue Entlüftungskappe oben fest.
    6. Setzen Sie den Sensor in die Probenahmeleitung des Perfusionskits ein. Starten Sie die Gasanalyse erst, wenn der Perfusionskreislauf vorbereitet ist.
  4. Grundierung der Schaltung
    1. Führen Sie eine Infusionsleitung in einen 500-ml-Beutel mit Plasmaexpander ein und befestigen Sie ihn an dem Reservoir. Setzen Sie eine Schlauchschelle auf die Ausflussleitung des Reservoirs und füllen Sie das Reservoir mit 300 mL Plasmaexpander.
    2. Entfernen Sie die Rohrschelle und lassen Sie den Plasmaexpander den Kreislauf füllen
    3. Entlüften Sie den Pumpenkopf und den Oxygenator. Die Schaltung ist nun vorbereitet. Schalten Sie die Heizung/den Kühler ein und stellen Sie sie auf 38 °C ein
  5. Vorbereitung der Infusionsleitungen
    1. Ziehen Sie 5 mL (25.000 E) einer 5 U/mL Heparinlösung in eine 50 mL Spritze. Ziehen Sie weitere 25 ml 0,9%ige NaCl-Lösung, um ein Gesamtvolumen von 30 ml Heparinlösung zu erhalten (Infusionsrate: 1 ml/h).
    2. Lösen Sie 5 g Natriumtaurocholat in 50 ml 0,9 % NaCl auf und ziehen Sie es in 450 ml 0,9 % NaCl auf, um eine Konzentration von 1 % zu erreichen. Es wird ein Gesamtvolumen von 168 mL benötigt (Infusionsrate: 7 mL/h).
    3. Ziehen Sie 2 ml (200 E) einer 100 U/ml-Insulinlösung in eine 50-ml-Spritze. Ziehen Sie weitere 28 ml 0,9%ige NaCl-Lösung, um ein Gesamtvolumen von 30 ml Insulinlösung zu erhalten (Infusionsrate: 1 ml/h).
    4. Ziehen Sie 10 ml Glycinpuffer (Verdünnungsmittel) und geben Sie es in die 0,5 mg Durchstechflasche mit Epoprostenol. Ziehen Sie mit dem im Epoprostenol-Kit enthaltenen mikrobiellen Filter 5 ml aus der Durchstechflasche mit dem mit Glycinpuffer rekonstituierten Epoprostenol in einer 50-ml-Spritze. Ziehen Sie weitere 25 ml 0,9%ige NaCl-Lösung, um ein Gesamtvolumen von 30 ml Epoprostenol-Lösung zu erhalten (Infusionsrate: 1 ml/h).

3. Einleitung der Anästhesie

  1. Beruhigung
    1. Bereiten Sie eine Spritze mit 2 mg/kg Xylazin und 8 mg/kg Zoletil (4 mg/kg Tiletamin und 4 mg/kg Zolazepam), eine Spritze mit 10 ml 0,9 % NaCl, ein Dreiwegeventil, eine Verlängerungsleitung und eine intramuskuläre 21 g Nadel vor.
    2. Führen Sie die Nadel in den Gesäßmuskel ein, injizieren Sie die Mischung aus Xylazin und Tiletamin und spülen Sie die Verlängerungslinie mit dem 0,9%igen NaCl. Nach 15 Minuten wird das Schwein sediert.
    3. Wiegen Sie das Schwein und transportieren Sie es in den Operationssaal.
  2. Anästhesie
    1. Schalten Sie das Beatmungsgerät ein
    2. Legen Sie das Schwein in Rückenlage auf den Operationstisch und fixieren Sie die Extremitäten.
    3. Mit einer Beatmungsmaske mit 1,5 l O2, 1,5 l Luft und 1 % Isofluran voroxygenieren.
    4. Befestigen Sie eine Sättigungssonde am Schwanz oder Ohr. Schließen Sie die drei Elektrokardiogramm-Elektroden für eine kontinuierliche Überwachung an.
    5. Führen Sie einen 22-G-Katheter in eine Ohrvene ein, schließen Sie ihn an ein Dreiwegeventil an und beginnen Sie mit einem Tropf von intravenösen (IV) Flüssigkeiten (Plasmalyte) mit einer Rate von 400 ml/h.
    6. Setzen Sie eine 60-ml-Spritze mit 50 μg/mL Fentanyl in einen automatischen Spritzentreiber ein. Geben Sie einen Bolus von 1 ml und beginnen Sie eine kontinuierliche Infusion mit einer Rate von 0,16 ml/kg/h.
    7. Nehmen Sie die Beatmungsmaske ab und setzen Sie das Laryngoskop ein, wobei Sie die Epiglottis anheben. Führen Sie einen Endotrachealtubus in die Luftröhre ein und blasen Sie den Ballon auf, um ein Austreten von Luft zu verhindern. Fixiere den Schlauch mit Klebeband an der Schnauze des Schweins.
      HINWEIS: Verschließen Sie das Isofluran, wenn Sie die Beatmungsmaske entfernen.
    8. Schließen Sie den Endotrachealtubus an das Beatmungsgerät an.
      HINWEIS: Einstellungen des Beatmungsgeräts: 0,4 l Atemzugvolumen; 0,5 kPa mittlerer Atemwegsdruck; 2,5 kPa Atemwegsdruck; 0,5 kPa positiver Exspirationsdruck; 15/min Frequenz; 4,7-5,3 kPa endtidales CO2.
    9. Verbinden Sie den Kapnographen mit dem Endotrachealtubus.

4. Chirurgie

  1. Tiefer Venenkatheter und arterieller Zugang
    1. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit Betadin und legen Sie Abdecktücher auf beide Seiten der Mittellinie.
    2. Machen Sie einen 7 cm langen Schnitt von der linken Seite der Oberseite des Brustbeins seitlich zum Musculus sternocleidomastoideus und platzieren Sie einen orthostatischen Retraktor.
    3. Präparieren Sie das Unterhautgewebe vom Muskel in lateraler Richtung und identifizieren Sie die Vena jugularis externa. Präparieren Sie die Vene und binden Sie die Seitenäste, falls vorhanden.
    4. Legen Sie zwei 2/0-Ligaturen um die Vena jugularis externa und binden Sie die Schädelligatur ab.
    5. Schneiden Sie die Vene kaudal von der gebundenen Ligatur auf und legen Sie einen 12 französischen Venenkatheter an.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Venenkatheter vor dem Einführen mit heparinisierter Kochsalzlösung gespült wird.
    6. Fixieren Sie den Katheter mit der zweiten Ligatur. Wenn der Venenkatheter in der Ohrvene brüchig oder zu klein ist, wechseln Sie die intravenöse Flüssigkeit und den Fentanyl-Zugang zum tiefen Venenkatheter. Andernfalls verwenden Sie es nicht, bis die Blutentnahme zum Zellsparer erfolgt ist.
    7. Der mediale Rand des Musculus sternocleidomastoideus wird präpariert und der orthostatische Retraktor wird wieder eingesetzt, indem die Ebene zwischen dem Musculus sternocleidomastoideus auf der lateralen Seite und der Luftröhre auf der medialen Seite geöffnet wird.
    8. Entfernen Sie den Thymus, um die Halsschlagader freizulegen. Wiederholen Sie Schritt 4.1.4 für die Arterie.
    9. Den arteriellen Zugang in die Halsschlagader in kaudaler Richtung einführen und fixieren. Verbinden Sie den arteriellen Schlauch mit dem Schlauch des Druckmonitors.
  2. Dissektion der Aorta und der Hohlvene
    1. Führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie vom Xiphoid bis zum Schambein durch.
      HINWEIS: Bei männlichen Schweinen, die kaudal vom Penis sind, 1 cm lateral von der Mittellinie einschneiden, um eine Beschädigung der subkutanen Harnröhre zu vermeiden.
    2. Das Nabelband durchschneiden. Platzieren Sie einen Bauchretraktor. Ziehen Sie den Darm seitlich und kranial nach links, um die Aorta und die Hohlvene sichtbar zu machen.
      HINWEIS: Der Schweinedarm ist nicht rotiert; Daher ist keine Dickdarmmobilisation notwendig, um Zugang zum Retroperitoneum zu erhalten.
    3. Präparieren Sie ca. 3 cm der Aorta direkt kranial der Beckenbifurkation und legen Sie zwei Ligaturen um die Aorta herum.
      HINWEIS: In der Nähe der Aorta befindet sich ein großes Lymphgefäß; Achten Sie darauf, es nicht zu beschädigen, da dies das Operationsfeld verwischt und die Dissektion erschwert.
    4. Die Hohlvene auf gleicher Höhe wie die Aorta frei präparieren und zwei Ligaturen platzieren.
  3. Dissektion des gastroduodenalen Bandes
    1. Beginnen Sie die Dissektion an der lateralen Seite des Gastroduodenalbandes, präparieren Sie den Gallengang communis und umschließen Sie ihn mit einer Gefäßschlaufe.
    2. Ziehen Sie den Gallengang zur medialen Seite zurück und legen Sie die Pfortader frei. Entfernen Sie einen großen Lymphknoten an der lateralen Seite der Pfortader
    3. Befreien Sie die Pfortader zur Bauchspeicheldrüse; Oft gibt es einen Ast aus dem Magen und der Bauchspeicheldrüse, der ligiert und durchtrennt werden muss. Umschließen Sie die Pfortader mit einer Gefäßschlaufe an der Seite der Leber und einer Ligatur an der Seite der Bauchspeicheldrüse. Ziehen Sie die Pfortader seitlich zurück und achten Sie darauf, sie nicht zu verschließen.
    4. Identifizieren Sie die Arteria hepatica communis und umschließen Sie sie mit einer Gefäßschlinge.
  4. Dissektion der thorakalen Aorta
    1. Ziehen Sie die Leber kaudal und öffnen Sie den zentralen sehnenartigen Teil des Zwerchfells ventral von der suprahepatischen Hohlvene. Ziehen Sie die Speiseröhre auf die rechte Seite zurück und legen Sie die thorakale Aorta frei.
    2. Präparieren Sie frei vom umgebenden Gewebe und achten Sie darauf, die Azygos-Vene nicht zu beschädigen.
      HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die thorakale Aorta zu umschließen; Die Dissektion sollte ausreichend ausgedehnt werden, um eine Gefäßklemme zu platzieren.
  5. Vorbereitung des Cell Savers
    1. Hängen Sie das Reservoir in den schwarzen Ring, entfernen Sie die Kappe vom einzelnen Schenkel des Adapters und befestigen Sie den Schlauch an der 3/8-Zoll-Auslassöffnung an der Unterseite des Blutentnahmebehälters.
    2. Lösen Sie den Verschluss des Saug-/Antikoagulanzienschlauchs und schließen Sie ihn an eine der 1/4 Zoll Bluteinlassöffnungen an der Oberkante des Blutentnahmebehälters an.
    3. Setzen Sie die Schüssel des Waschsets durch Drehen ein; Stellen Sie sicher, dass ein Klicken zu hören ist.
    4. Legen Sie den Schlauch in die Rollenpumpe und den Schlauchteiler.
    5. Hängen Sie einen Citratphosphat-Dextroseadenin-(CPDA)-1-Blutentnahmebeutel an die Stange und stellen Sie sicher, dass die Verbindung fest sitzt.
      HINWEIS: Zusammensetzung des CPDA-1-Blutbeutels (63 ml): 2,99 g/l wasserfreie Zitronensäure; 26,3 g/L dyhidröses Natriumcitrat; 2,22 g/L Monohysrat-Natriumphosphat; 31,9 g/l Dextrose-Monohydrat; 0,275 g/L Adenin.
    6. Hängen Sie den Abfallbeutel an die Seite der Maschine (stellen Sie sicher, dass er richtig geschlossen ist) und verbinden Sie ihn mit dem Waschset (gelbe Kappe).
    7. Verbinden Sie beide Y-förmigen Röhrchen (weiße Kappen) mit einem Beutel mit 3 l 0,9 % NaCl.
    8. Befestigen Sie den Schlauch mit der blauen Kappe an dem Adapterrohr an der Unterseite des Blutentnahmebehälters. Schalten Sie das Autotransfusionssystem ein.
  6. Kanülierung der Aorta und der Hohlvene
    1. 500 I.E./kg Heparin verabreichen und 2 Min. zirkulieren lassen. Binden Sie die kaudale Ligatur um die Aorta und führen Sie eine 20er französische Kanüle in die Aorta ein und fixieren Sie sie. Die gleiche Prozedur wird für die Hohlvene wiederholt.
  7. Um ein DCD-Verfahren nachzuahmen, wird eine warme Ischämie induziert, indem die thorakale Aorta für einen bestimmten Zeitraum, in diesem Fall 60 Minuten, abgeklemmt wird.
    HINWEIS: Während der warmen Ischämie werden die Drainage des Hohlraums und der Halsschlagader geöffnet und mit der Blutentnahme zum Zellretter begonnen. Dies führt zur Ausblutung des Schweins.
  8. Spülung der Leber
    1. Am Ende der warmen Ischämie eine Kältespülung mit 2 l eiskalter (4-6 °C) Konservierungslösung durch die Aortenkanüle einleiten und den Bauch mit einer topischen Anwendung von Slush-Eis kühlen.
      HINWEIS: Während der Kältewallung wird das restliche Blut ausgespült und zum Zellsparer gesammelt.
    2. Wenn die ersten 2 L gespült sind, entfernen Sie die Kanüle aus der Aorta, binden Sie die Ligatur an die Pfortader und kanülieren Sie die Pfortader. Fixieren Sie es dann mit der Gefäßschlaufe.
    3. Spülen Sie die Leber über die Pfortader mit weiteren 2 l eiskalter (4-6 °C) Konservierungslösung.
  9. Hepatektomie
    1. Entfernen Sie das Eis vom Bauch. Durchschneiden Sie den Gallengang in der Nähe der Bauchspeicheldrüse.
    2. Entfernen Sie die Pfortaderkanüle und teilen Sie die Pfortader. Ziehen Sie den Darm nach links zurück, um die infrahepatische Hohlvene freizulegen.
    3. Präparieren Sie die Hohlvene frei vom Retroperitoneum und teilen Sie nur die Schädelvenen von den Nierenvenen. Präparieren Sie die Arteria hepatica communis bis zur Arteria coeliacus und entspringen Sie der Aorta.
      HINWEIS: Das Schneiden der richtigen Zwerchfellkrusten kann die Belichtung verbessern.
    4. Teilen Sie die Arteria gastroduodenalis und schneiden Sie die Arteria coeliacus mit einem Fleck der Aorta heraus. Das kleine Omentum in der Nähe des Magens kranial bis zur Speiseröhre durchschneiden
    5. Mobilisieren Sie die linke Leber, indem Sie das linke Dreiecksband durchtrennen. Schneide das Zwerchfell auf der linken Seite der Hohlvene ab.
    6. Mobilisieren Sie die rechte Leber, indem Sie das rechte Zwerchfell von ventral nach dorsal durchtrennen und nur kaudal von der Durchtrennung der infrahepatischen Hohlvene beenden.
    7. Schneiden Sie die suprahepatische Hohlvene und durchtrennen Sie alle verbleibenden Ansätze. Die Leber ist nun frei; Nehmen Sie es heraus und legen Sie es in eine Schüssel mit Eiswasser.
  10. Verfahren für den hinteren Tisch
    1. Wiegen Sie die Leber. Kanülieren Sie die Pfortadera mit einer 25er französischen Kanüle und sichern Sie sie mit Ligaturen. Kanülieren Sie die Leberarterie mit einer verstärkten Kanüle 14 Franzosen und fixieren Sie sie mit Ligaturen.
    2. Kanülieren Sie die infrahepatische Hohlvene und positionieren Sie die Spitze der Kanüle auf der Höhe, auf der die Lebervenen in der Hohlvene abfließen. Fixieren Sie mit Ligaturen.
    3. Legen Sie eine Taschenschnur um den Rand des Zwerchfells, um Blutungen aus den Zwerchfellvenen zu verhindern, und binden Sie die suprahepatische Hohlvene ab.
    4. Entlüften Sie die Pfortaderkanüle und führen Sie eine Spülung der Pfortader mit 250 mL kaltem Plasmaexpander durch. Auf Undichtigkeiten prüfen.
      HINWEIS: Prüfen Sie, ob ein ausreichender Abfluss durch die Kavalkanüle gewährleistet ist.
    5. Setzen Sie nach der Portalspülung eine Schlauchschelle auf die Portalkanüle und stellen Sie sicher, dass keine Luft in die Kanüle und die Pfortader eindringt.
    6. Entlüften Sie die arterielle Kanüle und spülen Sie 250 ml kalten Plasmaexpander durch die Leberarterie. Prüfen Sie, ob es Undichtigkeiten gibt, und schneiden Sie alle Seitenäste ab. Platzieren Sie eine Schlauchklemme auf der Arterien- und Kavalkanüle.

5. Perfusion der Normotherm-Maschine

  1. Perfusat
    1. Während der Vorbereitung auf dem Back-Table fügen Sie die vom Zellschoner produzierten, gewaschenen roten Blutkörperchen dem Kreislauf hinzu, um den gewünschten Hämatokrit von 30 % zu erhalten. Starten Sie die Pumpe, um die roten Blutkörperchen mit dem Plasmaexpander zu vermischen. Starten Sie den kontinuierlichen Gasanalysator.
      HINWEIS: Die Formel für das Volumen der roten Blutkörperchen, um den gewünschten Hämatokrit zu erhalten: (Lebergewicht + Priming-Volumen) x gewünschter Hämatokrit/Hämatokrit nach dem Waschen. Der kontinuierliche Gasanalysator gibt auch eine Rückmeldung über die Perfusionstemperatur, die normalerweise mit der Einstellung der Heizung auf 38 °C übereinstimmt.
    2. Fügen Sie dem Perfusat 10 ml 10% Calciumgluconat, 2 ml Heparin (10.000 IE) und 750 mg Cefuroxim in 10 ml 0,9% NaCl hinzu. Stellen Sie den manuellen Gasmischer auf 0,5 l/min FiO2 von 21% ein.
  2. Einleitung der Perfusion
    1. Schalten Sie die Drucksensoren, Durchflusssensoren und die Rollenpumpe für die Leckagerückführung ein.
    2. Legen Sie die Leber in das Gefäß. Setzen Sie die Schlauchklemmen auf das Portal und den arteriellen Zufluss und den cavalen Abflussschlauch des Kreislaufs und schneiden Sie den Y-Anschluss heraus.
    3. Verbinden Sie die Kanülen mit einem T-Verbindungsstück dazwischen mit den jeweiligen Ein- und Auslaufschläuchen. Verhindern Sie, dass Luft in den Kreislauf gelangt.
    4. Installieren Sie Dreiwege-Hähne an den T-Verbindungsstücken und schließen Sie Druckleitungen an diese an. Null Druck in den Leitungen und Start der kontinuierlichen Drucküberwachung.
    5. Stellen Sie die Quetschklappen ein und schließen Sie sie fast vollständig, um supraphysiologische Strömungen und endothelialen Stress zu vermeiden.
    6. Starten Sie die Perfusion, indem Sie die Schlauchschellen aus dem Portaleinlauf entfernen. Unmittelbar nachdem der Portaleinlauf gestartet ist, entfernen Sie die Klemmen aus dem Kavalauslauf und starten Sie die Pumpe. Die Pumpendrehzahl ist druckgeregelt, streben Sie also einen Druck im Kavalausfluss zwischen -5 mmHg und -2 mmHg an. Streben Sie einen Pfortaderfluss von 0,75 mL/min/g Leber an.
    7. Wenn die Portalperfusion stabil ist und der Kavaldruck ausreichend ist, entfernen Sie die Klemmen aus dem arteriellen Schlauch. Streben Sie einen Druck von etwa 55-60 mmHg und einen Durchfluss von etwa 0,25 mL/min/g Leber an.
  3. Aufrechterhaltung einer stabilen Perfusionshämodynamik
    1. Decken Sie die Leber mit einer Glaskuppel oder Plastikfolie ab, um Wärmeverluste von der Oberfläche zu vermeiden.
    2. Wenn der Portaldurchfluss zu hoch ist, schließen Sie das Quetschventil am Portalzuflussrohr.
    3. Wird der Hohldruck zu negativ, steigt die Gefahr, dass ein Vakuum in der Hohlvene entsteht. Zu hohen Unterdrücken kann durch eine Verlangsamung der Pumpendrehzahl entgegengewirkt werden. Alternativ wird durch die Erhöhung des Zuflusses durch die Pfortader der negative Abflussdruck reduziert, indem der Hohlvene mehr Volumen zugeführt wird.
    4. Wenn der arterielle Druck zu niedrig ist, kann er durch Erhöhen der Pumpendrehzahl oder durch Schließen des Quetschventils in Richtung des Pfortaderreservoirs erhöht werden, um mehr Durchfluss durch den arteriellen Zuflussschlauch zu drücken.
  4. Probenahme
    1. Die Perfusatproben werden aus dem Kavalabfluss-Dreiwegeventil oder einer dafür vorgesehenen Probenahmeleitung zwischen dem Oxygenator und dem Portalreservoir entnommen.
    2. Entnehmen Sie Nadelbiopsien während der gesamten Perfusion. Nadellöcher müssen vernäht werden, da es aufgrund der Heparinisierung des Kreislaufs zu keiner Koagulation kommt.
    3. Sammeln Sie Galle, indem Sie eine 8 französische Kanüle im Gallengang fixieren. Achte darauf, den Ductus cysticus zu ligatisieren.

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Ergebnisse

Das vorgestellte Perfusionsprotokoll nutzt die Selbstregulation des Blutflusses der Leber, um stabile hämodynamische Bedingungen für bis zu 24 h zu erreichen und die physiologische Verteilung des Blutflusses in der Pfortader und Leberarterie zu simulieren. Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über den Perfusionskreislauf. Abbildung 2A zeigt eine konsistente Verteilung des Blutflusses, wobei die Pfortader und die Leberarterie etwa 75 % bzw. 25 % des ge...

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Diskussion

Hier haben wir unsere Erfahrungen mit Schweineleber-NMP detailliert beschrieben. Zu den Vorteilen dieser Technik gehören ein hoher translationaler Wert und eine hohe Vielseitigkeit. Die Schweineleber-NMP kann entweder zur Untersuchung und Verbesserung des Verständnisses dieser verbesserten Konservierungstechnik oder alternativ zur Nachahmung der Transplantation eingesetzt werden. Dieses Setup ermöglicht die manuelle Kontrolle über jeden Aspekt der Perfusion und ermöglicht die Einstellung...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken allen Forschungsstudenten der Medizinischen Fakultät der KU Leuven, die an diesen Experimenten beteiligt waren.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alaris GH Plus SpritzenpumpeBD Care Fusion80023 UN 01-G
AnästhesiegerätDrä GerTitus
Arterienkatheter Cavafix CertoBraun, Melsungen, DeutschlandBRAU4152557
BlutgasanalysatorStrahlungsmesserABL815
Calciumgluconat 10%Braun, Melsungen, Deutschland570/13596667/1214
KapnographDrä GerScio
Zell-SchonerMedtronicAutomatisches Protokollieren
Kreiselpumpe BiomedicusMedtronic85315 REV 3.0
Zentrifuge Rotina 420R HettichVWR521-1156
Maßgeschneiderter PerfusionskreislaufMedtronicM323901C
Einweg-Set ZellsparerMedtronicATLS24
DLP Einstufige Venenkanüle, gerade 20FMedtronic66120
EpoprostenolGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, BelgienFlolan
Fentanyl-Janssen 0,05 mg/mlJanssenNr. HK-08700
Strömungssensor BioPro TTEm-Tec12271
Formaldehyd 4%VWRVWRK4078.9005
Gefrierschrank -80 &Grad; CNew Brunswick ScientificU570-86
KühlschrankLiebherrBECHER 3513
GeloplasmaFresenius-Kabi, Bad Homburg, DeutschlandFreeflex
Kühler der HeizungStö ckert-Shiley, Sorin-Gruppe16-02-1950
Heparin 5000 IE/mLLeo Pharma, Ballerup, DänemarkHeparinLeo
Kanüle der LeberarterieMedtronicBIO-MEDICUS 12F
IGL-1 Lösung zur OrgankonservierungInstitut Georges LopezIGL-1/1000/D
Inline-BlutgasanalysatorTERUMOKalibrator 3MCDI 540/CDI 500
Insulin 200 IE ActrapidNovo Nordisk, Dagsvaerd, DänemarkMEDI-00018
Isofluran 1000 mg/g InhalationsdampfChanelle PharmaIso-Vet
IV-Katheter BD Insyte-W 20 GBD381334
Behälter für flüssigen StickstoffKGW IsothermNr. S22
Mersilene 250CM M3 USP2/0 ohne NadelJNJ MedizinNr. F4503
Mersilene 250CM M3.5 USP0 ohne NadelJNJ MedizinNr. F4504
Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 unvernadeltJNJ MedizinEH6935H
Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 unvernadeltJNJ MedizinEH6734H
Mikropipetten 1000 & Mikro; LSocorex82,51,000
ÜberwachungSiemensSC 8000
Plasmalyte ViafloBaxterPlasmalyte Viaflo
Pfortader-KanüleBERUHIGTE LABORE18F RV-40018
DruckfühlerStö ckert-Shiley, Sorin-Gruppe22-06-2000
Druck-ServoreglerMedtronicBM 9505-2
Prolene 4:0JNJ MedizinEH7151H
RollenpumpeCobe Century USA468048-000 REV C
Natriumbicarbonat 8,4 %Braun, Melsungen, Deutschland362 2339
NatriumtaurocholatSigma Aldrich, Burlington, Vereinigte Staaten von Amerika86339
Chirurgisches Skalpell Nr. 24Swann Morton0211
Venenkatheter, 3 Lumen; 12FRPFEILAK-12123-F
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 Gigapak ohne NadelJNJ MedizinV1205G
Xylazin 2%VMD Viehzucht PharmaXYL-M 2%
Zinacef Cefuroxim 750 mgGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, BelgienNDC 0173-0353-32
Zoletil 100VirbacZoletil 100

Referenzen

  1. Dunson, J. R., Bakhtiyar, S. S., Joshi, M., Goss, J. A., Rana, A. Intent-to-treat survival in liver transplantation has not improved in 3 decades due to donor shortage relative to waitlist growth. Clinical Transplantation. 35 (10), e14433(2021).
  2. Monbaliu, D., Pirenne, J., Talbot, D. Liver transplantation using donation after cardiac death donors. Journal of Hepatology. 56 (2), 474-485 (2012).
  3. Croome, K. P., Taner, C. B. The changing landscapes in DCD liver transplantation. Current Transplantation Reports. 7 (3), 194-204 (2020).
  4. Coffey, J. C., et al. The influence of functional warm ischemia time on DCD liver transplant recipients' outcomes. Clinical Transplantation. 31 (10), (2017).
  5. Meurisse, N., et al. Outcomes of liver transplantations using donations after circulatory death: A single-center experience. Transplantation Proceedings. 44 (9), 2868-2873 (2012).
  6. Ruck, J. M., et al. Temporal trends in utilization and outcomes of DCD livers in the United States. Transplantation. 106 (3), 543-551 (2022).
  7. Nasralla, D., et al. A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation. Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).
  8. Blondeel, J., Monbaliu, D., Gilbo, N. Dynamic liver preservation: Are we still missing pieces of the puzzle. Artificial Organs. 47 (2), 248-259 (2022).
  9. Gilbo, N., et al. Porcine liver normothermic machine perfusion: Methodological framework and potential pitfalls. Transplantation Direct. 8 (1), e1276(2021).
  10. Maione, F., et al. Porcine isolated liver perfusion for the study of ischemia reperfusion injury: A systematic review. Transplantation. 102 (7), 1039-1049 (2018).
  11. Gilbo, N., et al. Coagulation factors accumulate during normothermic liver machine perfusion regardless of donor type and severity of ischemic injury. Transplantation. 106 (3), 510-518 (2021).
  12. Butler, A. J., et al. Successful extracorporeal porcine liver perfusion for 72 hr. Transplantation. 73 (8), 1212-1218 (2002).
  13. Eshmuminov, D., et al. An integrated perfusion machine preserves injured human livers for 1 week. Nature Biotechnology. 38 (2), 189-198 (2020).
  14. Xu, J., Buchwald, J. E., Martins, P. N. Review of current machine perfusion therapeutics for organ preservation. Transplantation. 104 (9), 1792-1803 (2020).
  15. Martins, P. N., Turco, S. D., Gilbo, N. Organ therapeutics during ex-situ dynamic preservation. a look into the future. European Journal of Transplantation. 1, 63-78 (2023).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Normotherme Maschinenperfusionporcine LeberperfusionLebertransplantationsmodellIsch mie ReperfusionsschadenEx situ Leberkonservierunghepatischer BlutflussPerfusatzusammensetzungGallengangskan lierungvaskul rer Widerstandregenerative Therapie
Normothermische isolierte Leberperfusion bei Schweinen
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