Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Die Ex vivo Präparation eines Rückenmarksschnitts für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in Motoneuronen während der Rückenmarkstimulation

3.8K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/65385

⸱

8. September 2023

 ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine Patch-Clamp verwendet wird, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf die Rückenmarkstimulation (SCS) mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks und der gleichzeitigen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit zu verbessern.

Zusammenfassung

Die Rückenmarkstimulation (SCS) kann die Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung effektiv wiederherstellen. Da die Motoneuronen die letzte Einheit sind, die sensomotorisches Verhalten ausführt, kann uns die direkte Untersuchung der elektrischen Reaktionen von Motoneuronen mit SCS helfen, die zugrunde liegende Logik der spinalen motorischen Modulation zu verstehen. Um gleichzeitig verschiedene Reizeigenschaften und zelluläre Reaktionen zu erfassen, ist eine Patch-Clamp eine gute Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften auf Einzelzellebene zu untersuchen. Es gibt jedoch noch einige komplexe Schwierigkeiten, um dieses Ziel zu erreichen, einschließlich der Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, der schnellen Trennung des Rückenmarks von der knöchernen Struktur und der Verwendung des SCS zur erfolgreichen Induktion von Aktionspotenzialen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das Patch-Clamp verwendet, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf SCS mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks zu verbessern und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zelle aufrechtzuerhalten, um den elektrischen Mechanismus von SCS auf Motoneuronen reibungslos zu untersuchen und unnötige Versuche und Fehler zu vermeiden.

Einleitung

Die Rückenmarkstimulation (SCS) kann die Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung effektiv wiederherstellen. Andreas Rowald et al. berichteten, dass SCS die Funktion des Bewegungsapparates und des Rumpfes der unteren Gliedmaßen innerhalb eines einzigen Tages ermöglicht1. Die Erforschung des biologischen Mechanismus von SCS für die Erholung des Bewegungsapparates ist ein kritisches Forschungsfeld für die Entwicklung einer präziseren SCS-Strategie. Das Team um Grégoire Courtine zeigte beispielsweise, dass exzitatorische Vsx2-Interneuronen und Hoxa10-Neuronen im Rückenmark die Schlüsselneuronen für die Reaktion auf SCS sind, und dass eine zellspezifische Neuromodulation möglich ist, um die Gehfähigkeit der Ratte nach einer Rückenmarksverletzung2 wiederherzustellen. Es gibt jedoch nur wenige Studien, die sich auf den elektrischen Mechanismus von SCS auf Einzelzellebene konzentrieren. Obwohl bekannt ist, dass der überschwellige Gleichstromreiz die Aktionspotentiale (APs) im klassischen Tintenfischexperiment 3,4,5 hervorrufen kann, ist noch unklar, wie sich die gepulste elektrische Wechselstimulation, wie z.B. SCS, auf die motorische Signalerzeugung auswirkt.

Angesichts der Komplexität intraspinaler neuronaler Schaltkreise ist eine geeignete Selektion für die Zellpopulation wichtig, um den elektrischen Mechanismus der SCS zu untersuchen. Obwohl SCS die motorische Funktion durch Aktivierung des propriozeptiven Pfades6 wiederherstellt, sind die Motoneuronen die letzte Einheit, die den motorischen Befehl ausführt, der von der Integration des afferenten Eingangs7 der Propriozeptionsinformation abgeleitet wird. Daher kann uns die direkte Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Motoneuronen mit SCS helfen, die zugrunde liegende Logik der spinalen motorischen Modulation zu verstehen.

Wie wir wissen, ist die Patch-Clamp-Methode die goldene Standardmethode für zellulär elektrophysiologische Aufzeichnungen mit extrem hoher raumzeitlicher Auflösung8. Daher beschreibt diese Studie eine Methode, bei der eine Patch-Klemme verwendet wird, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf SCS zu untersuchen. Im Vergleich zur Gehirn-Patch-Klemme9 ist die Rückenmark-Patch-Klemme aus folgenden Gründen schwieriger: (1) Das Rückenmark wird durch den Wirbelkanal mit winzigem Volumen geschützt, was eine sehr feine Mikromanipulation und eine rigorose eiskalte Wartung erfordert, um eine bessere Zelllebensfähigkeit zu erhalten. (2) Da das Rückenmark zu dünn ist, um auf der Schneideschale befestigt zu werden, sollte es in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt getaucht und nach dem Erstarren gekürzt werden.

Daher liefert diese Methode technische Details bei der Dissektion des Rückenmarks und der gleichzeitigen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, um den elektrischen Mechanismus der SCS auf Motoneuronen reibungslos zu untersuchen und unnötige Versuche und Fehler zu vermeiden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Das Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte alle Tierversuche und die Studien wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Tierschutzbestimmungen durchgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

  1. Tiere
    1. Haltungsinformationen: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (postnatal 10-14 Tage, P10-P14) in einer spezifischen, pathogenfreien Umgebung.
      HINWEIS: Die Raumbedingungen wurden bei 20 °C ± 2 °C gehalten, Luftfeuchtigkeit: 50%-60%, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.
    2. Markierung der Motoneuronen retrograde: Injizieren Sie Fluor-Gold (FG) in den bilateralen Musculus tibialis anterior und den Musculus gastrocnemius (2% in steriler Kochsalzlösung, 50 μl pro Muskel), um die Motoneuronen 2 Tage vor der Opferung retrograd zu markieren.
  2. Lösungen
    1. Schneidlösung vorbereiten: Mischen Sie 120 mM Cholinchlorid, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM Ascorbinsäure, 15 mM Glukose. Die Lösung wird mit 95 % O2 und 5 %CO2 (mit KOH auf pH 7,4 eingestellt) 30 Minuten lang vor dem Sezieren und Schneiden aufgeblasen. Kühlen Sie die Lösung mit Crushed Ice ab.
    2. Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) vorbereiten: Mischen Sie 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 und 10 mM Glukose. Die Lösung wird vor der Inkubation 30 min lang mit 95 % O2 und 5 %CO2 vorgebläubt.
    3. Intrazelluläre Lösung vorbereiten: Mischen Sie 126 mM K-Gluconat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na2 ATP, 0,4 mMNa2GTP, 10 mM K-Phosphokreatin und 0,5% Neurobiotin (pH7,25 und 305 mOsm/Kg). Kühlen Sie die Lösung mit Crushed Ice ab.
    4. Niedrigschmelzendes Agarose-Gel vorbereiten: 4 g Agarose in 100 ml Schneidlösung auflösen und mit einem Magnetrührrotor vollständig auflösen. 30 Minuten vor dem Einbetten wird die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt 1 Minute lang in der Mikrowelle mit hoher Leistung erhitzt und dann in ein 39 °C warmes Wasserbad gegeben, um den flüssigen Zustand zu erhalten.
  3. Vorbereitung des Instruments
    1. Legen Sie Crushed Ice 10 Minuten vor der Perfusion auf die Perfusionsschiene (Ergänzende Abbildung 1A). Platzieren Sie die anatomische Schiene (Ergänzende Abbildung 1B) und die Schneideschiene (Ergänzende Abbildung 1C) mit einem Wasserband im Voraus bei -80 °C.
    2. Stellen Sie die Inkubationskammer mit Nylongewebe über Nacht in den Ofen bei 45 °C.
    3. Verwenden Sie Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, um eine 35°-Neigung und eine 2 mm dicke Plattform vorzufertigen (ergänzende Abbildung 1D). Platzieren Sie sie nach der Erstarrung des Gels in der Mitte einer 35-mm-Petrischale, um das Rückenmark bei den nächsten Eingriffen zu unterstützen.
  4. Intrakardiale Perfusion
    1. Die Ratten werden mit 2,5 % Tribromethanol (160 μl/10 g) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert. Stellen Sie sicher, dass die Ratten vollständig betäubt sind, indem Sie die fehlende Reaktion auf äußere Reize, wie z. B. ein sanftes Kneifen des Zehs, überprüfen.
    2. Wenn die richtige Anästhesie bestätigt ist, legen Sie die Ratten in Rückenlage und immobilisieren Sie sie in der mit Kieselgel gefüllten Petrischale.
    3. Schneiden Sie einen 5 mm langen Längsschnitt der Haut kaudal zum Processus xiphoideus und erweitern Sie dann den subkutanen Raum vollständig. Schneiden Sie einen 2 cm langen Hautschnitt entlang der ventralen Mittellinie, um die äußere Brustwand vollständig freizulegen, beginnend mit dem oben genannten Schnitt und endend mit der Oberseite des Brustkorbs.
    4. Verwenden Sie eine Zahnpinzette, um das Xiphoid anzuheben (Ergänzende Abbildung 2A), und schneiden Sie dann mit einer feinen Schere das Zwerchfell ab. Durchtrennen Sie das Brustbein auf beiden Seiten des Processus xiphoideus, um den Brustkorb zu öffnen und das Herz freizulegen (ergänzende Abbildung 2B).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die inneren Brustgefäße auf beiden Seiten zu erhalten. Andernfalls kann es zu massiven Blutungen kommen.
    5. Verwende eine zahnlose Pinzette, um die linke Herzkammer anzuheben. Eine 22-G-Nadel wird entlang der Längsachse des linken Ventrikels in die linksventrikuläre Spitze eingeführt (ergänzende Abbildung 2C). Beobachten Sie in der Zwischenzeit das rhythmische Pulsieren des Blutes im Perfusionsschlauch, da die Nadel sonst in die rechte Herzkammer stechen kann, was zu einer schlechten Perfusionswirkung führen kann.
      HINWEIS: Eine gezahnte Pinzette sollte nicht verwendet werden. Andernfalls kann es zu einem zusätzlichen Blutaustritt aus der Pinzettenhaltestelle kommen.
    6. Verwenden Sie eine feine Schere, um den rechten Vorhof zu schneiden (ergänzende Abbildung 2C), und injizieren Sie dann manuell 100 ml eiskalte Perfusionsflüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 ml/s innerhalb von 1 Minute.
      HINWEIS: Wenn die Leber und die Pfoten von Ratten blass werden und kein Blut aus dem rechten Vorhof fließt, kann eine gute Durchblutung erreicht werden.
  5. Rückenmarksdissektion (Abbildung 1)
    1. Platzieren Sie die Ratte in Bauchlage und schneiden Sie die Wirbelsäule an der vorderen oberen Darmbeinwirbelsäule (etwa L4-Wirbelhöhe) bzw. am Krümmungsverschiebungspunkt der Brustsäule (etwa T6-Wirbelhöhe) auf (Abbildung 1A). Legen Sie dann sofort die isolierte Wirbelsäule in die sauerstoffhaltige, eiskalte Perfusionslösung, um das restliche Blut- und Fettgewebe abzuwaschen. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, um das Operationsfeld bei den nachfolgenden Eingriffen sauber zu halten.
      HINWEIS: Die paraspinale Muskulatur sollte geschont werden, was für die anschließende Fixierung der Wirbelsäule mittels einer Insektennadel förderlich ist.
    2. Übertragen Sie die isolierte Wirbelsäule sofort auf die anatomische Schiene (Abbildung 1B) mit der dorsalen Seite nach oben und dem rostralen Ende in der Nähe des Bedieners. Füllen Sie die anatomische Schale mit 50 ml kontinuierlich sauerstoffhaltiger, eiskalter Schneidlösung (Abbildung 1B).
    3. Verwenden Sie vier Insektenstifte, um die Wirbelsäule zu fixieren, indem Sie in die paraspinalen Muskeln eindringen (Abbildung 1B).
    4. Unter dem Präpariermikroskop werden die Wirbelstiele beidseits vom rostralen Ende mit der Mikroschere durchtrennt, was als "Laminektomie" bezeichnet werden kann (Abbildung 1C). Achten Sie darauf, das Rückenmark nicht zu beschädigen. Verwenden Sie in der Zwischenzeit die mikroverzahnte Pinzette, um den durchtrennten Wirbelkörper anzuheben.
    5. Trennen Sie nach der Laminektomie das Rückenmark nicht sofort vom Spinalkanal. Verwenden Sie stattdessen eine Mikroschere, um die Dura mater entlang der dorsalen Mittellinie zu schneiden, was für die Nährstoffaufnahme zwischen den Zellen und der sauerstoffreichen ACSF förderlich ist (Abbildung 1D).
      HINWEIS: Reißen Sie niemals die Dura Mater. Nur das Schneiden der Dura mater mit einer Mikroschere ist erlaubt; Andernfalls werden die Nervenwurzel und das Spinalparenchym ernsthaft geschädigt!
    6. Heben Sie den rostralen Teil des Rückenmarks an und schneiden Sie dann die Nervenwurzel vorsichtig mit ca. 1 mm Reserve ab (Abbildung 1E). Nachdem Sie das Rückenmark vom Wirbelkanal getrennt haben, verwenden Sie 2 Insektenstifte, um das Rückenmark mit der ventralen Seite nach oben zu fixieren (Abbildung 1F).
    7. Verwenden Sie eine Mikroschere, um die Dura mater entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden (Abbildung 1F). Schneiden Sie die überflüssigen Nervenwurzeln mit ca. 1 mm Reserve ab.
      HINWEIS: Der Nerv ist viel hartnäckiger als das Rückenmark. Wenn die reservierte Nervenwurzel zu lang ist (>1 mm), kann das Vibratom die Nervenwurzel nicht abtrennen, was zu einem schweren Riss im Spinalparenchym führen kann.
    8. Verwenden Sie eine Mikroschere, um die Lumbalvergrößerung auf eine Länge von 6-7 mm zu trennen (Abbildung 1G).
  6. Einbettung in die niedrigschmelzende Agarose
    1. Platzieren Sie die Lumbalvergrößerung auf der 35°-Neigung (Abbildung 1H) mit der dorsalen Seite nach oben und dem kaudalen Ende nach unten. Verwenden Sie ein saugfähiges Filterpapier, um reichlich Wasser auf der Gewebeoberfläche zu entfernen (Abbildung 1H).
    2. Gießen Sie das geschmolzene Agarose-Gel langsam in die Petrischale mit der lumbalen Vergrößerung (Abbildung 1I).
      HINWEIS: Gießen Sie nicht zu schnell, da sich sonst Blasen im Gel ansammeln.
    3. Stellen Sie die obige Petrischale in die Eis-Wasser-Mischung, um das Gel so schnell wie möglich abzukühlen, was der Aufrechterhaltung der Zellaktivität förderlich ist.
    4. Schneiden Sie das Gel in einen 15 mm x 10 mm x 10 mm großen Würfel und montieren Sie ihn mit Sekundenkleber auf die Probenscheibe (Abbildung 1J).
  7. In Scheiben schneidend
    1. Legen Sie die Probenscheibe in die vorgefrorene Schneidschale und gießen Sie dann die eiskalte Schneidlösung (Abbildung 1K). Kontinuierlich mit 95 % CO2 und 5 %O2 in die Schneidschale blasen.
    2. Stellen Sie die Parameter des Vibratoms ein: Dicke: 350 μm; Geschwindigkeit: 0,14-0,16 mm/s, Amplitude: 1,0 mm und Schwingungsfrequenz: 85 Hz.
    3. Ernten Sie 2-3 geeignete Scheiben pro Tier. Zeichnen Sie 1-2 gesunde FG+-Motoneuronen pro Schnitt auf, mit einem Bereich von 5-6 Zellen pro Tier.
  8. Inkubation
    1. Verwenden Sie eine Pinzette zum Abdeckschieber, um eine Scheibe abzuschneiden (Abbildung 1L) und legen Sie sie in die Inkubationskammer, die mit kontinuierlich sauerstoffhaltigem ACSF gefüllt ist. Stellen Sie die Inkubationskammer für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 32 °C und inkubieren Sie sie dann weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT), bevor Sie sie aufzeichnen.
      HINWEIS: Die oben genannten Verfahren, von der Anästhesie bis zur Entnahme der ersten Scheibe, sollten innerhalb von 20-30 Minuten abgeschlossen werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen so weit wie möglich zu erhalten. Die Motoneuronen in jeder Schicht können ihre Lebensfähigkeit für etwa 6-7 Stunden aufrechterhalten.

2. Patch-Clamp-Aufnahme mit SCS (Abbildung 2)

  1. Vorbereitungen
    1. Die Aufzeichnungskammer mit kontinuierlich geblasenem ACSF mit einer Rate von etwa 1-2 ml/min durchbluten. Stellen Sie die Durchflussmenge individuell über das Bedienfeld an der Schlauchpumpe ein.
    2. Legen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer. Verwenden Sie den U-förmigen Platindraht mit Nylonfäden, um die Scheibe fest zu stabilisieren.
    3. Verwenden Sie ein Infrarot-Differenzinterferenzkontrastmikroskop (IR-DIC), um die Schicht zu beobachten. Vergewissern Sie sich unter dem 4-fach-Objektiv, dass die Länge der Rückenwurzel etwa 1 mm beträgt. Finde den Bereich, in dem die dorsale Wurzel in das Parenchym eintritt, und verschiebe dann das zentrale Sichtfeld auf diesen Bereich.
    4. Verbinden Sie den Impulsgeber mit speziell angefertigten Elektroden (Abbildung 2A).
  2. SCS-Konfiguration
    1. Platzieren Sie die SCS-Anode über das Mikromanipulationssystem in der Nähe der dorsalen Mittellinie (Abbildung 2B).
    2. Platzieren Sie die SCS-Kathode über das Mikromanipulationssystem in der Nähe der dorsalen Wurzeleintrittszone (DREZ) (Abbildung 2B).
  3. Zell-Targeting und Bildgebung
    1. Verwenden Sie IR-DIC mit einer 10-fach-Objektivlinse, um den dorsolateralen Bereich der motorischen Säule zu finden, in dem sich die meisten Motoneuronen befinden. Verschieben Sie dann das zentrale Sichtfeld auf diesen Bereich.
    2. Wechseln Sie zu einem 60-fachen Objektiv, um ein gesundes Neuron mit einer glatten und hellen Oberfläche und unsichtbaren Kernen zu finden (Abbildung 2C,F).
    3. Verringern Sie die IR-Intensität leicht und schalten Sie die Fluoreszenzlichtquelle ein. Schalten Sie den Lichtfilter auf den Breitband-Ultraviolett-Anregungsfilter um (Abbildung 2D,G), um ein geeignetes FG-positives (FG+) Motoneuron auszuwählen (Abbildung 2E,H).
    4. Verwenden Sie Saugelektroden, um eine 1-fache motorische Schwellenstimulation auf die dorsale Wurzel anzuwenden. Wird ein evoziertes Aktionspotential in den Motoneuronen detektiert (ergänzende Abbildung 3), bestätigt dies, dass die Aktivität der dorsalen Wurzel intakt ist. Ist dies nicht der Fall, sollte diese Scheibe verworfen werden.
  4. Patch-Clamp-Aufnahme
    1. Füllen Sie die Mikropipette mit der intrazellulären Lösung und führen Sie sie in den Elektrodenhalter ein. Verwenden Sie das Mikromanipulationssystem, um die Pipette in das ACSF-Bad zu senken. Der Pipettenwiderstand liegt zwischen 5 und 8 MΩ.
    2. Üben Sie einen kleinen Überdruck auf die Pipette aus, um den Staub und die Zelltrümmer wegzublasen.
      1. Senken Sie die Elektrode ab, um sich der Zelle zu nähern. Wenn die Pipette die Oberfläche des FG+-Neurons berührt, wird eine kleine Vertiefung der Membran auf Höhe der Spitze sichtbar. Lassen Sie den Überdruck los.
      2. Üben Sie dann mit einer Spritze einen kleinen Unterdruck auf die Pipette aus. Dadurch entsteht ein kleiner Sog, der die Zellmembran in Kontakt mit der Glaspipette zieht. Achten Sie immer auf den Gesamtwiderstand auf der Software-Schnittstelle, bis der Widerstandswert auf Gigaohm (>1 GΩ) ansteigt. Dann wird das Gigaseal gebildet.
    3. Klemmen Sie das Membranpotential auf -70 mV und drücken Sie dann die Taste für die schnelle Kapazitätskompensation auf der Softwareschnittstelle des Verstärkers. Üben Sie vorsichtig einen vorübergehenden Unterdruck aus, um die Zellmembran zu zerreißen, und drücken Sie dann die Taste zur Kompensation der langsamen Kapazität auf der Softwareschnittstelle des Verstärkers. Zu diesem Zeitpunkt erhält man eine gute Ganzzellkonfiguration.
    4. Wechseln Sie in den Stromzangenmodus, indem Sie auf die IC-Taste auf der Softwareoberfläche klicken, und zeichnen Sie das Ruhemembranpotential (RMP) auf.
    5. Wenden Sie das SCS 1-2 s lang mit einer Amplitude von 1-10 mA an, während die Pulsbreite und -frequenz auf 210 μs bzw. 40 Hz festgelegt sind. Bestimmen Sie die motorische Schwelle, indem Sie die Stimulationsamplitude langsam erhöhen, bis der erste AP beobachtet wird.
    6. Unterscheidung von verzögert und sofort feuernden Motoneuronen mit einer 5 s depolarisierenden Strominjektion um die Rheobase im Strom-Zangen-Modus10,11,12. Sofort feuernde Motoneuronen: Eine niedrige Rheobase kann ein sofortiges und wiederholtes Feuern mit stabiler Feuerfrequenz induzieren; Verzögert feuernde Motoneuronen: Eine hohe Rheobase kann einen verzögerten Beginn des wiederholten Feuerns mit einer sich beschleunigenden Feuerrate induzieren (Abbildung 3).
    7. Wenn SCS ausgeschaltet ist, zeichnen Sie weiterhin das Membranpotenzial auf, um die spontan feuernden APs einzufangen.
    8. Führen Sie Spannungsklemmenaufzeichnungen für erregenden postsynaptischen Strom (EPSC) durch, wenn SCS ein- und ausgeschaltet ist. Der Stimulationsparameter ist 1x motorische Schwelle, 210 μs, 2 Hz.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Dank der rigorosen Tieftemperaturhaltung während des Feinbetriebs (ergänzende Abbildung 1, ergänzende Abbildung 2 und Abbildung 1) war die Lebensfähigkeit der Zellen gut genug, um nachfolgende elektrophysiologische Aufzeichnungen durchzuführen. Um das klinische Szenario so weit wie möglich zu simulieren, haben wir die SCS-Kathode und die Anode mittels Mikromanipulation in der Nähe der dorsalen Mittellinie bzw. der DREZ platziert (Abbildung 2), d...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die durch SCS modulierten Bewegungsinformationen werden schließlich zu den Motoneuronen konvergiert. Daher könnte die Verwendung der Motoneuronen als Forschungsziel das Studiendesign vereinfachen und den Neuromodulationsmechanismus des SCS direkter aufdecken. Um gleichzeitig verschiedene Reizeigenschaften und zelluläre Reaktionen zu erfassen, ist eine Patch-Clamp eine gute Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften auf Einzelzellebene zu untersuchen. Es gibt jedoch immer noch einige Schwierigkeiten, einschließl...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 und 82301657) und dem China Postdoctoral Science Fund (2022M711833) finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Adenosin 5'-triphosphat MagnesiumsalzSigmaA9187
AscorbinsäureSigmaA4034
CaCl2· 2H2OSigmaC5080
Cholin ChlorideSigmaC7527
Cover Slide PinzetteVETUS36A-SAClip a
slice D-GlucoseSigmaG8270
EGTASigmaE4378
FeinschereRWD Life ScienceS12006-10Membran schneiden
Fluoreszenz-LichtquelleOlympus U-HGLGPS
Fluor-GoldFluorochromFluorochromMarkierung des Motoneurons
Guanosin 5′-triphosphate sodium salthydrate SigmaG8877
HEPESSigmaH3375
Infrarot CCD KameraDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-GluconatSigmaP1847
Agarose SigmaA9414
MgSO4· 7H2OSigmaM2773
Mikromanipulator Sutter Instrument MP-200
MikropipettenabzieherSutter InstrumentP1000
Mikroschere Jinzhongwa1020Laminektomie-Mikroskop
für die AnatomieOlympus SZX10
Mikroskop für die EkletrophysiologieOlympus BX51WI
MikrozahnpinzetteRWD Life ScienceF11008-09Heben Sie den geschnittenen Wirbelkörper
an NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-PhosphokreatinSigmaP7936
Objektiv für die EkletrophysiologieOlympus LUMPLFLN60XWArbeitsabstand 2 mm 
Osmometer Erweitert FISKE 210
Patch-Clamp-VerstärkerAxon Multiclamp 700B
Patch-Clamp DigitalisiererAxonDigidata 1550B
pH-MessgerätMettler Toledo FE28
Slice AnchorMehrkanal-SystemSHD-27H
RückenmarkstimulatorPINST901
ZahnpinzetteRWD Life ScienceF13030-10Heben Sie das Xiphoid-Vibratom
an LeicaVT1200S
Breitband-UV-AnregungsfilterOlympus U-MF2

Referenzen

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525(2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385(2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586(2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046(2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696(2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917(2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358(2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312(2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Elektrophysiologische AbleitungZellviabilit tAktionspotenzialeR ckenmarksverletzungVibratomschnitt
Die Ex vivo Präparation eines Rückenmarksschnitts für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in Motoneuronen während der Rückenmarkstimulation
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.