Effektive Techniken für die Fütterung und Ex-situ-Kultivierung einer brütenden Skleractinien-Koralle, Pocillopora acuta

Viele Korallenriff-Ökosysteme weltweit gehen verloren und degradieren als Folge von Hochtemperaturstress, der durch den Klimawandel verursacht wird ^1,2. Korallenbleiche (d.h. der Zusammenbruch der Korallen-Algen-Symbiose³) galt in^{der Vergangenheit als} relativ selten 4, tritt aber jetzt häufiger auf⁵, wobei eine jährliche Bleiche in vielen Regionen bis Mitte bis Ende des Jahrhunderts erwartet^{wird 6,7}. Diese Verkürzung der Übergangszeit zwischen Bleichereignissen kann die Fähigkeit zur Widerstandsfähigkeit von Riffen einschränken⁸. Die direkten Auswirkungen von Hochtemperaturstress auf Korallenkolonien (z. B. Gewebeschäden⁹; Energiemangel¹⁰) sind untrennbar mit indirekten Auswirkungen auf der Ebene der Riffe verbunden, von denen eine Verringerung der Fortpflanzungs-/Rekrutierungskapazität besonders besorgniserregend ist¹¹. Dies hat eine Reihe von angewandten Forschungsarbeiten angeregt, die sich beispielsweise mit der aktiven In-situ-Verbesserung der Rekrutierung (z. B. Riffimpfung¹²), neuen Technologien zur Skalierung der Korallenwiederherstellung¹³ und der Simulation von Reproduktionsreizen zur Induktion der Fortpflanzung in Ex-situ-Systemen ^{befassen 14}. Komplementär zu diesen aktiven Interventionen sind die kürzlich erfolgte Anerkennung der Vorteile der heterotrophen Ernährung von Korallen unter Hochtemperaturstress¹⁵ und die Erforschung der Rolle, die die Nahrungsbereitstellung bei der Fortpflanzung spielen kann¹⁶.

Es ist bekannt, dass heterotrophe Fütterung die Leistung von Korallen^{beeinflusst 17} und wurde speziell mit einem erhöhten Korallenwachstum^18,19 sowie mit thermischer Beständigkeit und Widerstandsfähigkeit ^20,21 in Verbindung gebracht. Die Vorteile der Heterotrophie sind jedoch bei Korallenarten nicht allgegenwärtig²² und können je nach Art der verzehrten Nahrung²³ sowie dem Grad der Lichtexposition²⁴ unterschiedlich sein. Im Zusammenhang mit der Korallenreproduktion hat die heterotrophe Fütterung unterschiedliche Ergebnisse gezeigt, wobei Beobachtungen einer höheren²⁵- und einer niedrigeren^{26-Reproduktionskapazität} nach heterotropher Fütterung berichtet wurden. Der Einfluss heterotropher Ernährung auf die Fortpflanzung von Korallen über ein Temperaturspektrum hinweg wird selten untersucht, jedoch wurde festgestellt, dass die Heterotrophie in der gemäßigten Koralle Cladocora caespitosa für die Fortpflanzung unter niedrigeren Temperaturbedingungen wichtiger ist²⁷. Ein besseres Verständnis der Rolle der Temperatur und der Nahrungsaufnahme für die Fortpflanzungsleistung ist wahrscheinlich erforderlich, um festzustellen, ob bestimmte Riffe (z. B. Riffe, die mit einer hohen Nahrungsverfügbarkeit verbunden sind²⁸) unter dem Klimawandel eine höhere Rekrutierungskapazität besitzen.

Ähnlich wie bei der Fortpflanzungsleistung ist der Einfluss von Temperatur und Nahrungsaufnahme auf den Fortpflanzungszeitpunkt in Korallen noch relativ wenig untersucht, obwohl die Synchronisierung der Fortpflanzung mit abiotischen/biotischen Bedingungen ein wichtiger Faktor für den Rekrutierungserfolg in einem sich erwärmenden Ozean ist²⁹. Es wurde gezeigt, dass wärmere Temperaturen in Studien zur thermischen Konditionierung von Korallen, die im Labor durchgeführt wurden³⁰, zu einer früheren Fortpflanzung führen, und dies wurde auch bei Korallen beobachtet, die in den³¹. Jahreszeiten von natürlichen Riffen gesammelt wurden. Interessanterweise wurde jedoch kürzlich der gegenteilige Trend bei gefütterten Korallen beobachtet, die im Laufe eines Jahres in einem Ex-situ-Durchflusssystem kultiviert wurden (d. h. die Fortpflanzung erfolgte früher im Mondzyklus bei kühleren Wintertemperaturen und später im Mondzyklus bei wärmeren Sommertemperaturen)³². Dieses gegensätzliche Ergebnis deutet darauf hin, dass das Fortpflanzungstiming unter Bedingungen, die mit reichlich vorhandenen energetischen Ressourcen verbunden sind, von typischen Mustern abweichen kann.

Kontrollierte Langzeitexperimente unter verschiedenen Temperaturszenarien könnten dazu beitragen, den Einfluss der Heterotrophie auf die Fortpflanzung in skleraktinischen Korallen besser zu verstehen. Die Aufrechterhaltung der Reproduktion von Korallenkolonien unter Ex-situ-Bedingungen für mehrere Fortpflanzungszyklen kann jedoch eine Herausforderung sein (siehe aber frühere Forschung^32,33). Hier werden einfache und effektive Techniken für die aktive Fütterung (Nahrungsquelle: Artemia nauplii) und Langzeitkultur einer brütenden Koralle (Pocillopora acuta) in einem Durchfluss-Aquakultursystem beschrieben; Es ist jedoch zu beachten, dass alle beschriebenen Techniken auch in rezirkulierenden Aquakultursystemen eingesetzt werden können. Um diese Techniken zu demonstrieren, wurde ein vorläufiger Vergleich der Reproduktionsleistung und des Zeitpunkts von Korallenkolonien durchgeführt, die bei 24 °C und 28 °C unter "gefütterten" und "ungefütterten" Behandlungen gehalten wurden. Diese Temperaturen wurden so gewählt, dass sie sich den Meerwassertemperaturen im Winter bzw. Sommer im Süden Taiwans annähern^30,34; Eine höhere Temperatur wurde nicht gewählt, da die Förderung einer langfristigen Ex-situ-Kultur ein primäres Ziel dieses Experiments war, anstatt die Reaktion der Korallen auf thermischen Stress zu testen. Darüber hinaus wurde die Dichte der Artemia-Nauplien vor und nach den Fütterungssitzungen quantifiziert, um die Durchführbarkeit einer heterotrophen Fütterung bei beiden Temperaturbehandlungen zu vergleichen.

Konkret wurden 24 Kolonien von P. acuta (mittlere lineare Gesamtausdehnung ± Standardabweichung: 21,3 cm ± 2,8 cm) aus Durchflusstanks in den Forschungseinrichtungen des National Museum of Marine Biology & Aquarium im Süden Taiwans gewonnen. Pocillopora acuta ist eine weit verbreitete Korallenart, die sowohl eine Broadcast-Laich-, aber typischerweise eine brütende Fortpflanzungsstrategie besitzt^35,36. Die Elternkolonien dieser Korallen wurden ursprünglich etwa 2 Jahre zuvor für ein anderes Experiment³² aus dem Outlet-Riff (21.931°E, 120.745°N) gesammelt. Folglich waren die im vorliegenden Experiment verwendeten Korallenkolonien ihr ganzes Leben lang unter Ex-situ-Kulturbedingungen gezüchtet worden; Konkret wurden die Kolonien bei Umgebungstemperatur und einem 12 h:12 h Licht-Dunkel-Zyklus bei 250 μmol Quanten m−2·s⁻1 exponiert und zweimal pro Woche mit Artemia-Nauplien gefüttert. Wir erkennen an, dass diese Langzeit-Ex-situ-Kultur die Reaktion der Kolonien auf die Behandlungsbedingungen in diesem Experiment beeinflusst haben könnte. Wir möchten daher betonen, dass das primäre Ziel hier darin besteht, zu veranschaulichen, wie die beschriebenen Techniken effektiv zur Kultivierung von Korallen ex situ eingesetzt werden können, indem ein Anwendungsbeispiel demonstriert wird, in dem die Auswirkungen von Temperatur und Fütterung auf die Korallenreproduktion bewertet wurden.

Die Korallenkolonien waren gleichmäßig auf sechs Flow-Through-System-Kulturtanks verteilt (Länge des Beckens x Breite x Höhe: 175 cm x 62 cm x 72 cm; Lichtregime des Beckens: 12 h:12h Licht-Dunkel-Zyklus bei 250 μmol Quanten m−²·s⁻¹) (Abbildung 1A). Die Temperatur in drei der Tanks wurde auf 28 °C und die Temperatur in den anderen drei Tanks auf 24 °C eingestellt. Jeder Tank verfügte über einen Logger, der alle 10 Minuten die Temperatur aufzeichnete (siehe Materialtabelle). Die Temperatur wurde in jedem Tank mit Hilfe von Kühlern und Heizungen unabhängig voneinander geregelt, und die Wasserzirkulation wurde mit Durchflussmotoren aufrechterhalten (siehe Materialtabelle). Die Hälfte der Völker in jedem Becken (n = 2 Kolonien/Tank) wurde zweimal pro Woche mit Artemia-Nauplien gefüttert, während die anderen Völker nicht gefüttert wurden. Jede Fütterungssitzung dauerte 4 Stunden und wurde in zwei unabhängigen temperaturspezifischen Fütterungstanks durchgeführt. Während der Fütterung wurden alle Kolonien, einschließlich der ungefütterten Kolonien, in die Futtertanks gebracht, um den potenziellen Stresseffekt des Bewegens der Kolonien zwischen den Tanks zu standardisieren. Die Kolonien in den gefütterten und ungefütterten Behandlungen wurden in einem eigenen Kompartiment unter Verwendung eines Netzrahmens innerhalb der temperaturspezifischen Futtertanks positioniert, so dass nur die Kolonien im gefütterten Zustand Nahrung erhielten. Die Fortpflanzungsleistung und der Zeitpunkt der Fortpflanzung der Korallen wurden für jede Kolonie täglich um 09:00 Uhr bewertet, indem die Anzahl der Larven gezählt wurde, die über Nacht in die Larvensammelbehälter entlassen worden waren.

1. Hängende Korallenkolonienin Ex-situ-Aquakulturbecken

1. Positionieren Sie eine gekerbte Stange (Länge x Breite x Höhe: 75 cm x 1 cm x 3 cm), im Folgenden "Hängestange" genannt, quer über das Kulturbecken, um die Korallenkolonien aufzuhängen.
   HINWEIS: Die in diesem Experiment verwendete Aufhängestange war eine Sonderanfertigung, aber ein einfaches PVC-Rohr mit hervorstehenden Schrauben (d. h. als Kerben) wäre ausreichend, solange es stabil über die Oberseite des Kulturbeckens positioniert werden kann und stark genug ist, um die Korallen zu halten.
2. Messen Sie ein Stück Angelschnur (siehe Materialtabelle) auf ~1,5 m Länge und falten Sie es dann zweimal in der Mitte.
   HINWEIS: Die Anfangslänge der Angelschnur sollte auf der Grundlage der gewünschten Endposition der Korallenkolonie im Kulturbecken gewählt werden.
3. Machen Sie einen kleinen Überhandknoten am Ende der gefalteten Angelschnur, der die ersten Enden der Angelschnur hat.
   HINWEIS: Nachdem Sie den Knoten gemacht haben, sollten unten zwei große Schlaufen und oben eine kleine Schlaufe sein.
4. Platzieren Sie die Korallenkolonie in der Mitte der beiden großen Schlaufen, so dass die Schlaufen um die Kolonie herum positioniert sind und die Koralle sicher halten können, wenn sie ins Wasser gehängt wird.
5. Haken Sie die kleine obere Schlaufe der Angelschnur in eine Kerbe an der Aufhängestange ein (Abbildung 1B).

2. Fütterung von Korallen

1. Herstellung des Futterbehälters
   1. Konstruieren Sie einen rechteckigen Rahmen aus Acrylrohr (Länge x Breite x Höhe: 25 cm x 60 cm x 25 cm). Machen Sie zwei separate Fächer im Rahmen, in denen die gefütterten bzw. ungefütterten Korallen platziert werden können (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Das Acrylrohr wurde verwendet, weil es leicht ist (d. h. im Gegensatz zu schwereren PVC-Rohren) und daher eine einfachere Bewegung des Zufuhrbehälters in die Kulturtanks erleichtern könnte.
   2. Verwende eine Heißklebepistole, um 100 μm Planktongitter auf den Boden und die Seiten des Rahmens zu kleben.
   3. Bohren Sie insgesamt ~10 kleine Löcher (0,5 cm Durchmesser) in die Rohre (insbesondere an den Seiten und am Boden des Rahmens), um zu verhindern, dass der Futterbehälter schwimmt, wenn er in den Kulturtank gestellt wird.
   4. Bohren Sie Löcher (~0,5 cm Durchmesser) durch das Planktonnetz an jeder Ecke des Futterbehälters.
   5. Führe einen 8 cm langen Schlauch mit einem Durchmesser von 0,5 cm durch die Ecklöcher und fixiere ihn mit einer Heißklebepistole.
      HINWEIS: Diese Schlauchstücke werden während der Fütterung mit einer Luftpumpe und Blasensteinen verbunden (siehe Schritt 2.3.2 für weitere Details).
2. Artemia-Anbau
   1. Sammeln Sie 2 l Meerwasser aus einem unabhängigen Futtertank und gießen Sie das Meerwasser in einen Artemia-Schlupfbehälter (Abbildung 1D).
      ANMERKUNG: In dem vorliegenden Experiment, das zur Demonstration der Protokolle verwendet wurde, wurden zwei unabhängige behandlungsspezifische Fütterungstanks verwendet, was die Vorbereitung von zwei Schlupfbehältern für die Artemia-Kultivierung erforderlich machte.
   2. Schließen Sie eine Luftpumpe für ca. 10 Minuten an den Schlauch an, der mit dem Boden des Schlupfbehälters verbunden ist, bevor Sie Artemia-Zysten hinzufügen.
   3. Während der Wartezeit mit einer Waage 8 g Artemia-Zysten abmessen (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Um eine mittlere Dichte von 35 einzelnen Artemia-Nauplien/ml zu erhalten, wie von Huang et ^al.19 vorgeschlagen, verwenden Sie ein Verhältnis von 4 g Artemia-Zysten zu 1 l Meerwasser.
   4. Nach 10 Minuten die 8 g Artemia-Zysten in den Schlupfbehälter geben.
   5. Inkubieren Sie die Artemia-Zysten 48 Stunden lang.
3. Vorbereiten des Fütterungsbehälters
   1. Stellen Sie den Futterbehälter so in den Futterbehälter, dass sich die Oberseite des Behälters über der Wasseroberfläche befindet.
   2. Verbinden Sie den äußeren Teil des Eckschlauchs des Futterbehälters mit einer Luftpumpe, die die Blasensteine mit Luft versorgt, um die Wasserzirkulation während der Fütterung zu erleichtern.
   3. Schalten Sie die Luftpumpe ~5 Minuten vor Beginn der Fütterung ein.
4. Artemia Nauplien Anreicherung und Sammlung
   1. 1,5 ml Anreicherungsfutter (siehe Materialtabelle) 2 h vor der gewünschten Fütterungszeit in den Schlupfbehälter geben.
      HINWEIS: Ein Verhältnis von 0,75 ml Anreicherungsdiät zu 1 l Meerwasser wird von Huang et ^al.19 empfohlen.
   2. Nach 2 h wird das Ventil für die Luftzufuhr zum Schlupfbehälter abgeschaltet.
   3. Decken Sie den Schlupfbehälter mit einem Karton ab, um Umgebungslicht auszuschließen, und platzieren Sie eine Lichtquelle (eine Handy-Taschenlampe ist ausreichend) für 5 Minuten am Boden des Schlupfbehälters, um Artemia-Nauplien auf den Boden des Behälters zu locken und so die Trennung von lebenden Artemia-Nauplien von leeren Schalen zu erleichtern.
   4. Entfernen Sie nach 5 Minuten die Box und die Lichtquelle.
   5. Stellen Sie einen 3-Liter-Messbecher unter den Schlupfbehälter.
   6. Lösen Sie den Schlauch vom Schlupfbehälter, damit die Artemia-Nauplien und die Meerwasserlösung in den Messbecher fließen können. 1 L der Artemia-Nauplien-Meerwasser-Lösung auffangen.
      HINWEIS: Sammeln Sie nur die Hälfte des Volumens im Schlupfbehälter, um unerwünschte leere Schalen auszuschließen.
   7. Während Sie in unmittelbarer Nähe des Futtertanks stehen, gießen Sie die Artemia-Nauplien und die Meerwasserlösung durch ein 100-μm-Sieb, um die Artemia-Nauplien (die im Sieb verbleiben) vom Meerwasser zu trennen.
   8. Spülen Sie die Artemia-Nauplien , die sich im Sieb befinden, zweimal mit Wasser aus dem Futterbehälter ab.
   9. Die Artemia-Nauplien sind nun gebrauchsfertig.
5. Fütterung der Korallenkolonien
   1. Entleeren Sie die Artemia-Nauplien , indem Sie das Sieb aus Schritt 2.4.8 in den Futterbehälter legen.
   2. Rühren Sie das Wasser im Tank von Hand um, um die Artemia-Nauplien gleichmäßig zu verteilen.
      HINWEIS: Sammeln Sie nach diesem Schritt Proben für die "Pre-Feeding"-Quantifizierung der Artemia-Naupliendichte (siehe Schritt 3.1 für weitere Details).
   3. Bewegen Sie jede Aufhängestange (wobei die Korallenkolonien noch an der Stange hängen) vom Kulturtank zum Futtertank und positionieren Sie die Stange so, dass sie sicher über der Oberseite des Futtertanks liegt. Die Zeit, in der die Korallen der Luft ausgesetzt sind, sollte so kurz wie möglich gehalten werden.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Völker nicht berühren und genügend Platz haben, um Nahrung zu fangen (z. B. ~5 cm voneinander entfernt).
   4. Schalten Sie die Lichter in den Futtertanks aus oder verwenden Sie einen nicht luftdichten Deckel, um den Futtertank abzudecken, um Lichtstörungen während der Fütterung zu vermeiden.
   5. Lassen Sie die Völker 4 h ungestört fressen.
   6. Nach 4 Stunden werden die Proben für die "Post-Fütterung"-Quantifizierung der Dichte der Artemia-Nauplien entnommen (siehe Schritt 3.1 für weitere Details).
6. Reinigung nach der Fütterung
   1. Nach Beendigung der Fütterung entfernen Sie die Korallenkolonien. Nehmen Sie die Aufhängestangen einzeln aus dem Futtertank und spülen Sie jede Koralle gründlich mit Meerwasser aus ihrem jeweiligen Kulturbecken ab, um alle Reste von Artemia-Nauplien zu entfernen.
      HINWEIS: Spülen Sie die Kolonien auf einer stabilen Oberfläche und nicht hängend ab, um das Risiko von Schäden zu verringern, die auftreten könnten, wenn die Kolonien während des Spülens hin und her schwingen. Halten Sie die Zeit, in der die Korallen der Luft ausgesetzt sind, so kurz wie möglich.
   2. Lege die Hängestangen (mit aufgehängten Korallen) zurück in die Kulturbecken.
   3. Lösen Sie die Schläuche, die den Futterbehälter mit der Luftpumpe verbinden, und nehmen Sie den Futterbehälter aus dem Zuführbehälter.
   4. Spülen Sie den Futterbehälter gründlich mit frischem Wasser aus, um alle verbliebenen Artemia-Nauplien zu entfernen.

3. Quantifizierung der Dichte der Artemia-Nauplien vor und nach der Fütterung

1. Entnahme der Proben
   1. Die Proben sind zu zwei Zeitpunkten zu entnehmen: zuerst, wenn die Artemia-Nauplien entladen und gleichmäßig im Futterbehälter verteilt wurden (Schritt 2.5.2), und erneut nach Beendigung der Fütterung (Schritt 2.5.6).
   2. Verwenden Sie für jeden Zeitpunkt drei Spritzen, um 20 ml Wasser von der Oberfläche, der mittleren Schicht bzw. der unteren Schicht des Zuführbehälters zu entnehmen.
2. Verdünnung der Probe
   1. Für jede Spritze werden die 20 ml Wasserprobe in ein unabhängiges 500-ml-Becherglas überführt.
   2. 180 ml heißes Wasser (~60 °C) in das Becherglas geben (1:10 Verdünnung).
      HINWEIS: Das heiße Wasser wird verwendet, um die Artemia-Nauplien ruhig zu stellen, um die Genauigkeit der Zählung zu erhöhen.
   3. Geben Sie 2 ml der Wasserprobe aus dem Becherglas in jede Vertiefung einer 9-Well-Platte.
      HINWEIS: Mischen Sie die Probe im Becherglas, um die Artemia-Nauplien gleichmäßig in der Wassersäule zu verteilen, bevor Sie die 2 ml der Probe entnehmen.
   4. Zählen Sie die Anzahl der Artemia-Nauplien in jeder Vertiefung unter einem Stereomikroskop mit 6,5-facher Vergrößerung (siehe Materialtabelle).
3. Berechnung der Dichte von Artemia-Nauplien
   1. Teilen Sie die Anzahl der Artemia-Nauplien in jeder Vertiefung durch 2, um die Anzahl der Artemia-Nauplien pro ml zu erhalten. Multiplizieren Sie diese Zahl dann mit 10 (um die Verdünnung zu berücksichtigen), um die Dichte der Artemia-Nauplien zu berechnen.
   2. Berechnen Sie die mittlere Dichte der Artemia-Nauplien (d. h. die durchschnittliche Dichte über die 27 Well-Replikate vor und nach der Fütterung), um die Artemia-Naupili-Dichte zwischen der Vor- und Nachfütterung zu vergleichen.

4. Sammlung von Korallenlarven

1. Herstellung des Larvensammelbehälters (Abbildung 1E)
   1. Wählen Sie eine 6-Liter-Plastikwasserflasche und schneiden Sie den Boden der Flasche vollständig ab.
      HINWEIS: Diese Öffnung wird zum Ein- und Ausfüllen der Völker in den Larvensammelbehälter verwendet.
   2. Schaffe zwei Fenster, indem du von jeder Seite der Flasche ein Rechteck von ~15 cm x 20 cm ausschneidest.
      HINWEIS: Eine 6-Liter-Plastikwasserflasche ist für Korallen mit einem Durchmesser von ~15 cm geeignet. Ändern Sie die Größe der Flasche basierend auf der Größe der untersuchten Korallen.
   3. Verwenden Sie eine Heißklebepistole und dann Epoxidharz, um ein 100 μm dickes Planktonnetz auf jedes der Fenster zu kleben.
   4. Mache zwei kleine Löcher (~0,5 cm Durchmesser) auf jeder Seite des Flaschenbodens.
   5. Führe eine Schnur durch die beiden kleinen Löcher und binde beide Enden zusammen, um einen Griff zu schaffen, mit dem du den Larvensammelbehälter an der Aufhängestange einhängen kannst.
   6. Stellen Sie die Flaschen vor dem ersten Gebrauch für mindestens 24 Stunden in einen Durchflusstank (ohne Korallen), um alle Klebstoffreste zu entfernen.
2. Vorbereitungen für die Korallensammlung
   1. Tauchen Sie den Larvensammelbehälter vollständig in den Kulturtank ein.
   2. Legen Sie die Kolonie in den Larvensammelbehälter und lassen Sie sowohl die Kolonie als auch den Behälter in Wasser getaucht.
   3. Haken Sie den Griff des Larvensammelbehälters an der Aufhängestange ein.
      HINWEIS: Stellen Sie nach dem Aufhängen sicher, dass sich die Oberseite des Auffangbehälters ~3 cm über dem Wasser befindet.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1-4.2.3, bis sich alle Völker in ihren Larvensammelbehältern befinden.
3. Sammeln und Zählen der Korallenlarven
   1. Bereiten Sie einen 3-Liter-Messbecher, eine Schüssel, eine 3-ml-Pipette und 50-ml-Röhrchen vor.
   2. Löse die Angelschnur von der Aufhängestange und entferne eine Kolonie aus dem Larvensammelbehälter. Setze die Kolonie sofort wieder in den Kulturtank.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dauer der Lufteinwirkung so kurz wie möglich ist.
   3. Legen Sie eine Hand auf das Kappenende des Larvensammelbehälters.
      HINWEIS: Wenn der Larvensammelbehälter mit Wasser gefüllt ist, kann er schwer sein. Ohne die richtige Unterstützung kann der Behälter brechen, wenn er aus dem Wasser genommen wird.
   4. Haken Sie den "Griff" des Larvenauffangbehälters von der Aufhängestange ab.
   5. Heben Sie den Larvensammelbehälter langsam aus dem Wasser.
   6. Halten Sie den Auffangbehälter einige Sekunden lang in einem ca. 45°-Winkel über den Kulturtank, damit überschüssiges Wasser über die Fenster des Larvensammelbehälters in den Tank zurückfließen kann.
      HINWEIS: Winkeln Sie den Behälter nicht über 45° ab, um die Gefahr zu verringern, dass Larven von der Oberseite des Behälters ausströmen.
   7. Nehmen Sie den Larvenauffangbehälter aus dem Tank und stellen Sie ihn auf den Messbecher.
   8. Bevor Sie die Kappe abschrauben, üben Sie mit einem Finger einen mäßigen Druck auf die Kappe aus und schrauben Sie dann die Kappe ab.
      HINWEIS: Das Wasser im Inneren des Auffangbehälters kann schnell freigesetzt werden, wenn die Kappe entfernt wird, wenn sie nicht zuerst mit dem Finger gestützt wird (d. h. was zu einem Verlust von Larven führen kann).
   9. Einen Teil des Wassers im Messbecher in eine Schüssel geben.
   10. Zählen Sie die Anzahl der Larven in der Schüssel manuell, indem Sie die Larven mit einer 3-ml-Pipette in ein 50-ml-Röhrchen befördern.
       HINWEIS: Beachten Sie, dass einige der Larven in der Pipette stecken bleiben können. Wenn dies geschieht, ziehen Sie etwas Meerwasser in die Pipette und schütteln Sie es vorsichtig, während Sie die Pipette mit einem Finger verschließen, um die Larven zu lösen.
   11. Fahren Sie mit Schritt 4.3.9 und Schritt 4.3.10 fort, bis alle Larven gezählt sind. In diesem Stadium können die Larven in nachfolgenden Experimenten verwendet werden.
   12. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.2-4.3.10 für alle anderen Korallenkolonien.
       HINWEIS: Der Messbecher und die Schüssel sollten zwischen den Kolonien gespült werden.
   13. Spülen Sie nach Beendigung der Zählung jeden Auffangbehälter gründlich mit frischem Wasser aus, insbesondere die Fenster.

Die beschriebenen Protokolle ermöglichten (1) den Vergleich der Fortpflanzungsleistung und des Zeitpunkts einzelner Korallenkolonien zwischen verschiedenen Fütterungs- und Temperaturbehandlungen und (2) eine Bewertung der Durchführbarkeit der Fütterung von Artemia-Nauplien bei verschiedenen Temperaturen. Hier wird ein kurzer Überblick über die Ergebnisse gegeben, aber Vorsicht ist geboten in Bezug auf die breite Interpretation der berichteten Auswirkungen von Temperatur und Nahrungsaufnahme auf die Korallenreproduktion, da dieses Experiment kurzfristig ist (d.h. nur ein Fortpflanzungszyklus) und die Verwendung von Korallenkolonien, die an Ex-situ-Bedingungen gewöhnt sind.

Jede Kolonie hat sich im Laufe unseres Beobachtungszeitraums (Mondseptember 2022) vermehrt, und die gesamte monatliche Reproduktionsleistung zeigte eine hohe Variation zwischen den Kolonien. Die Gesamtzahl der von den Kolonien freigesetzten Larven schwankte zwischen 6 und 319, mit Ausnahme einer Kolonie (bei der ungefütterten 24 °C-Behandlung), die 528 Larven produzierte; Die Daten für alle Kolonien sind in Abbildung 2 dargestellt, aber die stark produzierende Ausreißerkolonie wurde nicht in die Datenanalyse einbezogen. Die Reproduktionsleistung wurde durch die Temperatur (generalisiertes lineares Mixed-Effects-Modell; z = 5,35, p < 0,001) und die Fütterung (z = 3,01, p < 0,003) beeinflusst, wobei eine signifikante Wechselwirkung zwischen der Temperatur und den Fütterungsbehandlungen (z = 12,22, p < 0,001) festgestellt wurde. Kolonien, die bei 28 °C kultiviert wurden, setzten mehr Larven frei, wenn sie nicht gefüttert wurden (Mittelwert ± Standardabweichung; 151 ± 82) als wenn sie gefüttert wurden (131 ± 133) (verallgemeinertes lineares Mixed-Effects-Modell, Post-hoc-Kontrast; z = 3,01, p = 0,014), aber der gegenteilige Trend wurde bei Völkern gefunden, die bei 24 °C kultiviert wurden, wobei die gefütterten Völker (80 ± 78) mehr Larven produzierten als die ungefütterten Völker (12 ± 6) (z = 11,91, p < 0,001).

Die Fortpflanzung fand in allen Kolonien vor dem Vollmond (Mondtag 15) statt (Abbildung 3). Der mittlere Mondtag (MLD) der Larvenfreisetzung (gewichtet nach Fortpflanzungsleistung) reichte vom Mondtag 6,5 bis zum Mondtag 11,1, wobei ein signifikanter Unterschied zwischen den Behandlungen nur zwischen den "ungefütterten 28 °C"-Kolonien, die sich früher im Mondzyklus fortpflanzten, und den "gefütterten 24 °C"-Kolonien, die sich später im Mondzyklus fortpflanzten, festgestellt wurde (lineares Mixed-Effects-Modell, Post-hoc-Kontrast, t = 4,10, p = 0,006).

Im Monat vor der formellen Fortpflanzungsüberwachung (August 2022) wurde die Dichte der Artemia-Nauplien vor und nach den Fütterungssitzungen bestimmt; Dies wiederholte sich zu drei Zeitpunkten: zu Beginn der Korallenkultur für dieses Experiment (T0) und 2 Wochen und 4 Wochen in der Korallenkultur unter Behandlungsbedingungen (Abbildung 4). Die Erstbeurteilung bei T0 ergab keinen Unterschied zwischen der Prä- und Postfütterungsdichte von Artemia-Nauplien in beiden Temperaturbehandlungen. Nach 2 Wochen und 4 Wochen Kultur war die Artemia-Naupliendichte nach Fütterung in beiden Temperaturbehandlungen niedriger (Woche 2: Zwei-Wege-ANOVA, F 1.104 = 128,45, p < 0,001; Woche 4: Zwei-Wege-ANOVA, F1.104 = 294,71, p < 0,001). Zu keinem der drei untersuchten Zeitpunkte gab es einen Unterschied in der Dichte vor der Fütterung zwischen den Temperaturbehandlungen (p > 0,05) oder der Dichte nach der Fütterung zwischen den Temperaturbehandlungen (p > 0,05).

Alle Analysen wurden in R mit den Paketen lme437, lmerTest 38, emmeans39, car 40 und Hmisc41 durchgeführt. Die Daten und das R-Skript, die für die Analysen verwendet werden, sind auf GitHub öffentlich verfügbar (https://github.com/CJ-McRae/Lam-et-al_JoVE-submission).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus und repräsentativer Materialien für die Fütterung und Ex-situ-Kultur einer brütenden skleraktinischen Koralle. (A) Kolonien von Pocillopora acuta wurden in Durchflussaquarien bei 24 °C oder 28 °C unter gefütterten und ungefütterten Bedingungen kultiviert. Die schwarzen Kreise stellen die Kolonien dar. (B) Die Völker wurden mit Angelschnüren aufgehängt, um den Stress bei der Handhabung zu verringern und eine effiziente Bewegung zwischen der Kultur und den Futterbecken zu fördern. (C) Während der Fütterungssitzungen wurden alle Kolonien in einen vermaschten Rahmen in temperaturspezifischen Futtertanks gebracht. Gefütterte Kolonien wurden in einem Fach des Rahmens positioniert, und ungefütterte Kolonien wurden in dem anderen Fach des Rahmens positioniert. Nur gefütterte Völker wurden mit Nahrung versorgt. (D) Angereicherte Artemia-Nauplien wurden den Kolonien in der gefütterten Behandlung zweimal wöchentlich verabreicht. (E) Die Kolonien wurden über Nacht in Larvensammelbehälter gesetzt, um die tägliche Fortpflanzungsleistung im Laufe eines Mondzyklus zu quantifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Reproduktionsleistung von Pocillopora acuta-Kolonien unter verschiedenen Temperaturen (24 °C vs. 28 °C) und Fütterungsbehandlungen (gefüttert vs. ungefüttert). Die Buchstaben sind repräsentativ für signifikante Unterschiede in der Fortpflanzungsleistung zwischen den Behandlungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zeitpunkt der Fortpflanzung von Pocillopora acuta-Kolonien unter verschiedenen Temperaturen (24 °C vs. 28 °C) und Fütterungsbehandlungen (gefüttert vs. ungefüttert). Die vertikal gestrichelte Linie zeigt den mittleren Mondtag (MLD) der Reproduktion für jede Behandlung. Die Farbtöne innerhalb der einzelnen Balken der behandlungsspezifischen Diagramme (A-D) geben den Beitrag der einzelnen Völker zur täglichen Gesamtreproduktion an. Die Briefe sind repräsentativ für signifikante Unterschiede in der Fortpflanzungszeit zwischen den Behandlungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Dichte der Artemia-Nauplien vor und nach der Korallenfütterung innerhalb der 24 °C und 28 °C Temperaturbehandlungen. Die Dichte vor der Fütterung wurde vor der Korallenfütterung und die Dichte nach der Fütterung nach Abschluss einer 4-stündigen Korallenfütterung berechnet. Die Dichte der Artemia-Nauplien wurde zu Beginn der Korallenkultur (T0) und dann nach 2 Wochen und 4 Wochen unter Behandlungsbedingungen in einer Durchfluss-Aquakulturanlage bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.