Adjuvante Aktivität von Mycobacterium paratuberculosis bei der Verbesserung der Immunogenität von Autoantigenen während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein alternatives Protokoll vor, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in C57BL/6-Mäusen aktiv zu induzieren, indem wir das immunogene Epitop Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)_35-55 verwenden, das in einem unvollständigen Freund-Adjuvans suspendiert ist, das die hitzeabgetötete Mycobacterium avium-Subspezies paratuberculosis enthält.

Abstract

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), die durch Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) induziert wird, erfordert eine Immunisierung durch ein MOG-Peptid, das in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) mit inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis emulgiert ist. Die antigenen Bestandteile des Mykobakteriums aktivieren dendritische Zellen, um T-Zellen zur Produktion von Zytokinen anzuregen, die die Th1-Antwort über Toll-like-Rezeptoren fördern. Daher stehen die Menge und Art der Mykobakterien, die während der antigenen Herausforderung vorhanden sind, in direktem Zusammenhang mit der Entwicklung von EAE. In dieser Arbeit wird ein alternatives Protokoll zur Induktion von EAE in C57BL/6-Mäusen unter Verwendung eines modifizierten unvollständigen Freund-Adjuvans vorgestellt, das den hitzeabgetöteten Mycobacterium avium-Subspezies Paratuberculosis-Stamm K-10 enthält.

M. paratuberculosis, ein Mitglied des Mycobacterium avium-Komplexes, ist der Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern und wurde als Risikofaktor für mehrere menschliche T-Zell-vermittelte Erkrankungen, einschließlich Multipler Sklerose, identifiziert. Insgesamt zeigten Mäuse, die mit Mycobacterium paratuberculosis immunisiert wurden, einen früheren Krankheitsbeginn und einen höheren Schweregrad der Erkrankung als Mäuse, die mit CFA immunisiert wurden, die den Stamm von M. tuberculosis H37Ra in der gleichen Dosis von 4 mg/ml enthielt. Die antigenen Determinanten des Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) Stammes K-10 waren in der Lage, während der Effektorphase eine starke Th1-Zellantwort zu induzieren, die durch eine signifikant höhere Anzahl von T-Lymphozyten (CD4+, CD27+), dendritischen Zellen (CD11c+, I-A/I-E+) und Monozyten (CD11b+, CD115⁺) gekennzeichnet war) in der Milz im Vergleich zu Mäusen, die mit CFA immunisiert wurden. Darüber hinaus schien die proliferative T-Zell-Antwort auf das MOG-Peptid in M. paratuberculosis-immunisierten Mäusen am höchsten zu sein. Die Verwendung eines Enzephalitogens (z. B. MOG_35-55), das in einem Adjuvans emulgiert ist, das M. paratuberculosis in der Formulierung enthält, kann eine alternative und validierte Methode sein, um dendritische Zellen für das Priming von Myelinepitop-spezifischen CD4⁺ T-Zellen während der Induktionsphase von EAE zu aktivieren.

Introduction

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein gängiges Modell für die Untersuchung menschlicher demyelinisierender Erkrankungen¹. Es gibt verschiedene Modelle der EAE: die aktive Immunisierung mit verschiedenen Myelinpeptiden in Kombination mit potenten Adjuvantien, die passive Immunisierung durch In-vitro-Transfer von myelinspezifischen CD4⁺ -Lymphozyten und transgene Modelle der spontanen EAE². Jedes dieser Modelle verfügt über spezifische Merkmale, die es ermöglichen, verschiedene Aspekte der EAE zu untersuchen, wie z. B. den Beginn, die Effektorphase oder die chronische Phase. Das ....

Protocol

Alle Mausversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Juntendo University School of Medicine genehmigt (Zulassungsnummer 290238) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health für Tierversuche durchgeführt.

1. Allgemeine Bemerkungen zum Experiment

1. Die Mäuse werden in Einzelkäfigen in der Tierhaltung unter kontrollierten, erregerfreien Bedingungen bei 23 °C ± 2 °C mit 50 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser untergebracht.
2. Injizieren Sie den Mäusen phosphatgepufferte Kochs....

Results

Gruppen von C57BL/6-Mäusen (gesamt n = 15/Gruppe) wurden mit MOG_35-55 in einer M. paratuberculosis-haltigen Emulsion oder mit der üblichen Methode mit CFA immunisiert. Alle Gruppen von Mäusen zeigten eine akute monophasische Erkrankung, die durch einen einzigen Höhepunkt der Behinderung nach 14-17 Tagen gekennzeichnet war, gefolgt von einer teilweisen Erholung der Symptome in den nächsten 10 Tagen (Abbildung 1A). Mäuse, die mit dem M. .......

Discussion

Wir demonstrierten ein robustes alternatives Protokoll zur aktiven Induktion schwerer EAE in C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung des Peptids MOG_35-55 , das in einem Adjuvans mit M. paratuberculosis¹⁰ emulgiert wurde. Die Induktion von EAE durch diese Methode führte zu einer schwereren Erkrankung als diejenige, die durch das gemeinsame Protokoll mit CFA induziert wurde. Dieser Unterschied könnte auf die unterschiedlichen Lipidkomponenten in der Zellwand der Mykobakterien zurückzufü.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Maus-CD115-Antikörper	Biolegend, USA	135505	für Zytofluorimetrie 1:1.000
Anti-Maus-CD11b-Antikörper	Biolegend, USA	101215	für Zytofluorimetrie 1:1.000
Anti-Maus-CD11c-Antikörper	Biolegend, USA	117313	für Zytofluorimetrie 1:1.000
Anti-Maus-CD16/32  Antikörper	Biolegend, USA	101302	für Zytofluorimetrie 1:1.000
Anti-Maus CD4  Antikörper	Biolegend, USA	116004	für Zytofluorimetrie 1:1.000
Anti-Maus CD8a  Antikörper	Biolegend, USA	100753	für Zytofluorimetrie 1:1.000
Anti-Maus I-A/I-E Antikörper	Biolegend, USA	107635	für Zytofluorimetrie 1:1.000
Anti-Maus Ly-6C  Antikörper	Biolegend, USA	128023	für Zytofluorimetrie 1:1.000
BBL Middlebrook OADC Anreicherung	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	für die Isolierung und Kultivierung von Mykobakterien
C57BL/6J Mäuse	Charles River Laboratory, Japan		3 Wochen alt, männlich und weiblich
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	für Zellkulturen, warm bei 37 &Grad; C vor Gebrauch
Gefriertrockner	Maschine Eyela, Tokio, Japan	FDU-1200	für Bakterien Lyophilisation
unvollständig e Freund' s Adjuvans	Difco Laboratories, MD, USA	263810	zur Verwendung in Adjuvans
Middlebrook 7H9 Bouillon	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	helfen beim Wachstum von Mykobakterien
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	Bakterien aus Rindern
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, getrocknet	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	zur Verwendung in adjuvanten
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		Wachstumsförderer
Myelin Oligodendrozyten Glykolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	enzephalotigenes
Peptid Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	Negativkontrollantigen  für proliferative
Assay Pertussis Toxin Lösung	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	Aus gramnegativen Bakterien Bordetella pertussi, erhöht die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke
Polytron Homogenisator PT 3100	Kinematica		zum Mischen des Antigens mit dem Adjuvans
RPMI 1640 mit L-Glutamin	Gibco Life Techologies, USA	11875093	Für die Zellkultur
Thymidin, [Methyl-3H], in 2% Ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	für Proliferationsassays, Verwendung (1 μ
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	Zytofluorimetrie, für die Lebensfähigkeit der Zellen