Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Membrantransportproteine sind entscheidend für die Kommunikation zwischen Zellen sowie für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Unter den Membrantransportproteinen dienen Ionenkanäle dazu, das Wachstum und die Entwicklung von Zellen voranzutreiben und den Zustand von Zellen in herausfordernden und sich verändernden Umgebungen aufrechtzuerhalten. Es wurde auch berichtet, dass Ionenkanäle die Entwicklung solider Tumore sowohl systemisch als auch im Zentralnervensystem (ZNS) vorantreiben und ^{unterstützen1,2}. Zum Beispiel sind KCa3.1-Kanäle für die Regulierung des Membranpotenzials und die Kontrolle des Zellvolumens verantwortlich, was für die Regulation des Zellzyklus wichtig ist. Es wurde berichtet, dass defekte KCa3.1-Kanäle zur abnormalen Proliferation von Tumorzellen beitragen³. Darüber hinaus können Ionenkanäle zur metastatischen Ausbreitung von Krebserkrankungen beitragen. Transiente Rezeptorpotentialkanäle (TRP) sind beispielsweise am Ca2+- und^Mg2+-Einstrom beteiligt; Dieser Einstrom aktiviert mehrere Kinasen und Hitzeschockproteine, die die extrazelluläre Matrix, die einen Tumor umgibt, regulieren, was wiederum für die Initiierung von Krebsmetastasen wichtig ist⁴.

Da Ionenkanäle zur Entstehung von Krebs beitragen können, können sie auch Ziele für die medikamentöse Krebsbehandlung sein. Zum Beispiel ist die Resistenz gegen Behandlungsmodalitäten, einschließlich Chemotherapie und neuartige Immuntherapie, mit einer Dysregulation der Ionenkanalfunktion verbunden ^5,6,7. Darüber hinaus entwickeln sich Ionenkanäle zu wichtigen Angriffspunkten für Medikamente, um das Wachstum und die Entwicklung von Krebs zu hemmen, wobei umfunktionierte niedermolekulare (von der FDA zugelassene) Medikamente sowie Biopolymere, einschließlich monoklonaler Antikörper 1,2,8,9^, untersucht werden. Obwohl es an dieser Front große Fortschritte gegeben hat, ist die Entdeckung von Medikamenten gegen Ionenkanalkrebs nach wie vor unterentwickelt. Dies ist zum Teil auf die besonderen Herausforderungen bei der Untersuchung von Ionenkanälen in Krebszellen zurückzuführen. Zum Beispiel gibt es technische Einschränkungen bei der Einrichtung von elektrophysiologischen Assays für langsam wirkende Verbindungen und zeitliche Unterschiede in der Kanalaktivierung und Arzneimittelwirkung. Darüber hinaus kann auch die Löslichkeit von Verbindungen den Fortschritt behindern, da die meisten der heute üblichen automatisierten elektrophysiologischen Systeme hydrophobe Substrate verwenden, die durch die Adsorption von Verbindungen zu Artefakten beitragen können. Darüber hinaus ist es technisch schwierig, große bioorganische molekulare Therapeutika wie Naturstoffe, Peptide und monoklonale Antikörper mit herkömmlichen elektrophysiologischen Assays zu screenen¹⁰. Schließlich sind die bioelektrischen Eigenschaften von Krebszellen nach wie vor unzureichend verstanden¹¹.

Inzwischen ist die Immunfluoreszenzfärbung von Ionenkanälen oft eine Herausforderung. Dies ist zum Teil auf die Komplexität ihrer Strukturen und ihren Kontext in der Membran zurückzuführen, die sich auf die Fähigkeit auswirken, Antikörper für mikroskopische Studien sowohl zu generieren als auch einzusetzen. Es ist besonders wichtig, dass die Antikörper, die zur Färbung von Ionenkanälen verwendet werden, auf Spezifität, Affinität und Reproduzierbarkeit validiert sind. Kommerzielle Antikörper für Ionenkanäle sollten auf der Grundlage ihrer Validierungsstrategie und ihrer Publikationsbilanz in Betracht gezogen werden. Die Experimente sollten Negativkontrollen enthalten, um das Fehlen einer unspezifischen Bindung durch Knockdown oder Knockout des Zielproteins nachzuweisen. Alternativ können Zelllinien, in denen das Zielprotein fehlt oder in geringer Häufigkeit auf der Grundlage von mRNA- oder Proteinbestimmungen vorhanden ist, als Negativkontrollen dienen. Zum Beispiel zeigt diese Studie die Lokalisation der (GABA)-Rezeptor-Untereinheit Gabra5 in einer Medulloblastom-Zelllinie (D283). D283-Zellen mit einem siRNA-Knockdown und Daoy-Zellen, eine weitere Kleinhirn-Medulloblastom-Zelllinie, wurden für Gabra5 gefärbt und zeigten keine nennenswerte Färbung (Daten nicht gezeigt).

Hier werden Methoden vorgestellt, um die Funktion von Ionenkanälen sowie die Wirkung von Ionenkanalmodulatoren auf Krebszellen zu analysieren und zu testen. Es werden Protokolle für (1) die Färbung von Zellen für einen Ionenkanal, (2) die Prüfung des polarisierten Zustands von Mitochondrien, (3) die Feststellung der Ionenkanalfunktion mittels Elektrophysiologie und (4) die In-vitro-Validierung von Medikamenten bereitgestellt. Diese Protokolle konzentrieren sich auf Studien des Typ-A-Gamma-Aminobuttersäure-Rezeptors (GABA-A) 2,12,13,14,15,16^, eines Chlorid-Anionenkanals und eines wichtigen inhibitorischen Neurotransmitterrezeptors. Die hier vorgestellten Methoden lassen sich jedoch auch auf viele andere Krebszellen und Ionenkanäle anwenden.

1. Immunmarkierung von Ionenkanälen in kultivierten Zellen

1. Vorbereitung der Zellen und Versuchsaufbau
   1. Halten Sie die Zellen als aktiv wachsende Kultur in 75 cm² Kulturkolben. Passieren Sie die Zellen einmal, bis sie zu 50 % bis 90 % konfluent sind, abhängig von der Verdopplungszeit der verwendeten Zelllinie.
      HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden D283-Zellen, eine Medulloblastom-Zelllinie der Gruppe 3, verwendet.
   2. Die Zellen werden aus dem Kulturkolben in ein Zentrifugenröhrchen (15 ml oder 50 ml) aufgenommen und 2 ml 0,25%iges Trypsin-EDTA zugegeben, um adhärente Zellen abzulösen. 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Klopfen Sie nach 5 Minuten drei- bis fünfmal auf den Kolben, um die Zellen zu lösen. Sammeln Sie die Zellen in 10 ml Medium mit 10% FBS, um die Wirkung des Trypsins zu stoppen.
   3. Bei 480 x g 5 min bei RT zentrifugieren. Das Medium vorsichtig absaugen. Das Zellpellet darf nicht gestört werden.
   4. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml bis 10 ml Medium, abhängig von der Dichte der Kultur.
      ANMERKUNG: Die Dichte muss mit den aktiv wachsenden Zellen übereinstimmen und hängt vom Zusammenfluss der Zellen im Kolben ab. Die visuelle Beurteilung sollte verwendet werden, um sich der optimalen Zelldichte anzunähern. Konkret sollten die Zellen zwischen 40 % und 90 % konfluent und gleichmäßig verteilt sein.
   5. Entnehmen Sie 100 μl Zellen und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 100 μl 0,4%igem Trypanblau, um nicht lebensfähige Zellen zu markieren. Inkubieren Sie 5-15 Minuten bei RT, abhängig von der Zelllinie.
   6. Zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämozytometer (siehe Materialtabelle) in 10 μl Lösung. Zählen Sie die lebenden, ungefärbten Zellen in jeder der vier Ecken der 16 Quadrate des Hämozytometers. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Zellzahl mit dem Verdünnungsfaktor und mit 10.000, um die Zellen pro Milliliter (Zellen/ml) zu erhalten. Alternativ kann ein automatisierter Zellzähler verwendet werden.
   7. Die Zellen werden auf 1 x 10⁵ Zellen/ml in das für jede Zelllinie angegebene Kulturmedium verdünnt. Saatgut 1. 8 ml Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, die ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas enthält, das mit 0,1 mg/ml Poly-D-Lysin gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbeschichtet ist (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Man kann die Verwendung von Poly-D-Lysin und Poly-L-Lysin testen, da es Berichte über zelllinienspezifische Präferenzen gibt^17,18. Einige Zelllinien haben Proteasen, die Poly-L-Lysin abbauen können, während es Berichte gibt, dass Poly-D-Lysin für einige Zelllinien toxisch ist. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass neuronale Zellen wie PC12 auf Poly-D-Lysin-Oberflächen gesünder sind.
   8. Züchten Sie die Zellen in einem Inkubator mit einer befeuchteten Umgebung von 5 % CO₂ bei 37 °C über Nacht, damit sich die Zellen an das Deckglas anheften können. Untersuchen Sie die Anhaftung der Zellen unter einem inversen Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv.
      HINWEIS: Die Zellen müssen vor der Behandlung oder der direkten Immunfärbung vollständig am Deckglas befestigt werden. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen mit Arzneimitteln (oder Vehikelkontrolle) behandelt werden, indem entweder ein konzentrierter Stamm (z. B. 600 μl einer 4-fachen Stammlösung) hinzugefügt wird oder das Medium durch frisches Medium ersetzt wird, das das Arzneimittel in der gewünschten 1-fachen Konzentration enthält; Die Zellen können dann für bis zu weitere 48 h in den Inkubator zurückgeführt werden. Lösungsmittelbehandelte Zellen werden eingeschlossen, um die Auswirkungen des Arzneimittels auf den Gehalt und die Lokalisation des Zielmoleküls zu beurteilen. In der vorliegenden Studie wurden D283-Zellen 48 Stunden lang mit 600 μl einer 3,2 μM-Lösung eines GABA-A-Rezeptor-positiven allosterischen Modulators, QH-II-066¹⁴ (siehe Materialtabelle), behandelt. Die Kontrollzellen wurden mit einem äquivalenten Volumen DMSO behandelt.
2. Vorbereitung für die Immunmarkierung: Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung
   1. Spülen Sie die Zellen mit 2,5 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2_HPO4, 2 mM KH₂PO₄, siehe Materialtabelle) und saugen Sie die Lösung sofort ab.
   2. Fixieren Sie die Zellen mit 1 ml 4% PFA in 1x PBS für 1 h bei RT.
      HINWEIS: Während 4% PFA das Standard-Fixiermittel für die Immunfärbung ist, können Glutaraldehyd oder Glyoxal auch zur Fixierung von Membranproteinen für die Immunfluoreszenz verwendet werden. Alkoholbasierte Fixierungsmethoden, wie z. B. Behandlungen mit eiskaltem Methanol, können zu einer weniger gut erhaltenen Morphologie und einem Verlust von Membranproteinen führen^19,20.
   3. Sechsmal mit 2,0 ml 1x PBS (5 min pro Waschgang) durch Rühren auf einem Shaker waschen. Inkubieren Sie für 1 Stunde bei RT in einem Blockierungspuffer, der aus 1x PBS mit 0,8 % Triton X-100 und 10 % normalem Serum besteht, das der Wirtsspezies des primären Antikörpers entspricht (alternativ können 3 % BSA oder bovines Serumfraktions-V-Albumin anstelle von normalem Serum verwendet werden).
      Hinweis: Dieser Schritt wird verwendet, um unspezifische Bindungen zu blockieren.
3. Immunmarkierung
   HINWEIS: Nach der Zugabe der an Fluorophore konjugierten Antikörper müssen bald Messungen durchgeführt werden, um ein Photobleichen zu verhindern. Inkubationen mit konjugierten Antikörpern müssen vor Licht geschützt werden. Die Verwendung eines Eindeckmediums, das Mittel enthält, die freie Radikale abfangen, reduziert das Photobleaching. Bewahren Sie die Objektträger nach dem Verschließen der Deckgläser in einem lichtdichten, blickdichten Behälter (bei 4 °C) auf. Bei der Bildgebung kann das Photobleaching minimiert werden, indem die Intensität der Anregungsbeleuchtung und die Belichtungszeiten begrenzt werden.
   1. Bereiten Sie eine befeuchtete Kammer vor, indem Sie den Boden einer 150-mm-Kulturschale mit Filterpapier auskleiden. Befeuchten Sie das Filterpapier mit sterilem destilliertem Wasser. Zeichnen Sie ein 3 x 2-Raster auf ein Stück Laborfolie, das so zugeschnitten ist, dass es auf das Filterpapier passt, und beschriften Sie es, um die Ausrichtung der Deckgläser in der 6-Well-Platte beizubehalten. Legen Sie die Laborfolie auf das Filterpapier und legen Sie den oberen und unteren Rand frei, um die Kammer zu befeuchten.
   2. Bereiten Sie 100 μl pro Deckglas der gewünschten Verdünnung des Primärantikörpers in 1x PBS mit 3% BSA vor. Um das GABRA-Genproteinprodukt nachzuweisen, verwenden Sie den rekombinanten monoklonalen Primärantikörper des Kaninchens in einer Verdünnung von 1:200 (Gabra5-Antikörper, mittlerer Bereich; siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Um die Primärantikörperkonzentration empirisch zu bestimmen, die das optimale Signal über den Hintergrund erzeugt, verwenden Sie eine Verdünnungsreihe des Primärantikörpers, während die Sekundärkonzentration konstant gehalten wird. Verdünnungen von 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 und 1:1.000 werden empfohlen, um optimale Primärantikörperkonzentrationen zu ermitteln.
   3. Übertragen Sie das Deckglas von der Blocklösung in der 6-Well-Platte an die richtige Stelle auf dem auf der Laborfolie gezeichneten Raster. Entsorgen Sie die Blocklösung von der 6-Well-Platte und bewahren Sie die Platte für die Waschschritte auf.
   4. Geben Sie vorsichtig 100 μl verdünnten Primärantikörper in die Mitte jedes Deckglases. Vermeiden Sie es, die Lösung über den Rand des Deckglases zu legen. 1 Stunde bei RT inkubieren.
   5. Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in jede Vertiefung der 6-Well-Platte. Legen Sie das Deckglas zurück an die entsprechende Stelle in der 6-Well-Platte.
   6. Führen Sie sechs Wäschen für jeweils 5 Minuten mit 2,5 ml 1x PBS durch.
      HINWEIS: Lassen Sie die Deckgläser während der Spülschritte nicht trocknen, da dies zu einem Hintergrundfluoreszenzsignal beitragen kann.
   7. Legen Sie die Deckgläser an die richtige Stelle auf der Laborfolie zurück. Geben Sie für jedes Deckglas 100 μl Sekundärantikörper hinzu, der in 1x PBS + 1%-5% BSA verdünnt ist.
      HINWEIS: Zunächst werden sekundäre Antikörper, die an Alexa Fluor 488 konjugiert sind (siehe Materialtabelle), in einer Verdünnung von 1:1.000 in 1x PBS + 3% BSA verwendet. Die sekundäre Antikörperkonzentration kann optimiert werden, indem die Konzentration erhöht wird, um Zielproteine mit geringer Häufigkeit zu detektieren, oder die Konzentration verringert wird, um den Hintergrund zu verringern, falls erforderlich.
   8. Minimieren Sie für die verbleibenden Schritte die Lichtexposition, um das Photobleichen des konjugierten sekundären Antikörpers zu verhindern. Decken Sie die Kulturschale mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei RT.
   9. Übertragen Sie die Deckgläser zurück auf die 6-Well-Platte. Führen Sie mit einem Shaker sechs Wäschen für jeweils 5 Minuten mit 2,5 ml 1x PBS durch. Entfernen Sie das PBS, indem Sie die Platte über dem Waschbecken oder einem Abfallbehälter umdrehen. Lassen Sie das PBS nach der letzten Wäsche in der Vertiefung, um das Entfernen des Deckglases zu erleichtern.
   10. Beschriften Sie für jedes Deckglas einen Objektträger. Geben Sie einen Tropfen Glycerin-haltiges Eindeckmedium mit DAPI (zum Färben der Kerne) (siehe Materialtabelle) in die Mitte des Objektträgers.
   11. Nehmen Sie das Deckglas mit einer Pinzette aus der Vertiefung und legen Sie es vorsichtig auf den Tropfen des Eindeckmediums in der Mitte des Objektträgers.
       HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen im Eindeckmedium.
   12. Verwenden Sie kleine Stücke Filterpapier, um überschüssiges Eindeckmedium zu entfernen. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack und lassen Sie den Lack vor dem Fotografieren vollständig trocknen. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C in einer undurchsichtigen Kunststoffbox.
4. Bildgebung und Analyse
   1. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop unter einem 40-fach-Objektiv mit Immersionsöl auf (siehe Materialtabelle).
   2. Visualisieren Sie die Fluoreszenzbilder mit den entsprechenden Filtern.
   3. HINWEIS: Verwenden Sie für Alexa Fluor 488 eine Anregung/Emission von 496 nm/519 nm; Verwenden Sie für DAPI eine Anregung/Emission von 358 nm/461 nm.
   4. Erfassen und speichern Sie die digitalen Bilddateien. Ein Binning-Wert von 4 x 4 wird verwendet, um die Bilderfassungsraten zu erleichtern und den Hintergrund zu reduzieren.
   5. Bereiten Sie die endgültigen Bilder vor. Die Bilder können mit ImageJ oder handelsüblicher Software bearbeitet werden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.

2. Testen des polarisierten Zustands der Mitochondrien

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet den TMRE-Assay (Tetramethylrhodamin, Ethylester), um das Membranpotenzial in aktiven Mitochondrien zu markieren und eine negative Ladung^21,22 aufrechtzuerhalten. TMRE ist ein zelldurchlässiger, rot-oranger, positiv geladener Farbstoff, der sich in aktiven Mitochondrien aufgrund ihrer relativen negativen Ladung anreichert. Inaktive oder depolarisierte Mitochondrien haben ein reduziertes Membranpotenzial und sind nicht in der Lage, TMRE proportional zu sequestrieren. FCCP (Carbonylcyanid 4-[trifluormethoxy] phenylhydrazon), ein Ionophor-Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS), depolarisiert die Mitochondrienmembranen und verhindert so die Akkumulation und Sequestrierung von TMRE²³. Dies ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Vorbereitung der Zellen und Versuchsaufbau
   1. Bewahren Sie die Zellen in 75 cm² Kulturflaschen auf. Saugen Sie das Nährmedium an und spülen Sie die Zellen mit 1x PBS ohne Kalzium und Magnesium.
   2. Fügen Sie 2 ml 0,25%iges Trypsin-EDTA hinzu, um die adhärenten Zellen zu lösen. Inkubieren Sie 5 Minuten lang bei RT und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml Medium.
   3. Die Zellen werden aus dem Kulturkolben in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt. Zentrifugieren Sie bei 480 x g für 5 min bei RT. Saugen Sie das Medium an.
   4. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml bis 10 ml Medium, abhängig von der ursprünglichen Konfluenz der Kultur, so dass die Zellkonzentration 50-100 Zellen pro Quadrat auf dem Hämozytometer beträgt. Passen Sie die Lautstärke bei Bedarf an, um die erforderliche Zelldichte für eine genaue Zählung bereitzustellen.
   5. Entnehmen Sie 100 μl Zellen und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 100 μl 0,4%igem Trypanblau. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Verdünnen Sie die Zellen auf 3 x 10⁴ Zellen/ml in Nährmedium ohne Phenolrot.
      HINWEIS: DMEM-Medium, dem Phenolrot fehlt, wird verwendet, da die Exposition gegenüber Phenolrot die Membranpermeabilität hemmt und zur Hintergrundautofluoreszenz beitragen kann.
   6. Säen Sie 2,5 ml der Zellsuspension (75.000 Zellen) pro Well in eine 6-Well-Platte, die ein 22 x 22 mm großes Deckglas enthält, das gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Poly-D-Lysin vorbeschichtet ist (siehe Materialtabelle).
   7. Züchten Sie die Zellen in einem Inkubator mit befeuchteten 5 % CO₂ bei 37 °C über Nacht, damit sich die Zellen an das Deckglas anheften können.
   8. Untersuchen Sie die Anhaftung von Zellen unter einem inversen Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv. Die Zellen müssen vollständig mit dem Deckglas verbunden sein, bevor Sie fortfahren können.
2. Vorbereiten von Stammlösungen
   1. Zur Herstellung einer 1 mM Stammlösung (1.000x) TMRE (MW = 514,96 g/mol) (siehe Materialtabelle) wird 1 mg TMRE in 1,94 ml DMSO gelöst. Aliquotieren und bei −20 °C lichtgeschützt lagern. Vermeiden Sie wiederholte Einfrier-/Auftauzyklen.
   2. Zur Herstellung einer 50 mM (2.500x) Stammlösung von FCCP (MW = 254,17 g/mol) (mitochondrialer oxidativer Phosphorylierungsentkoppler) werden 10 mg FCCP in 786,9 μl DMSO gelöst. Aliquotieren und bei −20 °C lichtgeschützt lagern. Vermeiden Sie wiederholte Einfrier-/Auftauzyklen.
   3. HINWEIS: Vorbereitete Stammlösungen sind Teil des TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kits (siehe Materialtabelle).
3. Bestimmung der TMRE-Konzentration für die Zelllinien
   1. Bereiten Sie eine 500 nM funktionierende TMRE-Lösung in Zellkulturmedium vor. Schützen Sie die Arbeitslösung vor Licht.
   2. TMRE wird den auf den Deckgläsern gezüchteten Zellen in einem mittleren bis endgültigen Konzentrationsbereich zwischen 50 und 200 nM zugegeben. Saugen Sie dazu zunächst das Nährmedium an und ersetzen Sie es durch ein TMRE-haltiges Nährmedium.
   3. 20 min bei 37 °C inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Behandlungszeiten gestaffelt sind, um eine Bildgebung zu ermöglichen, da die Zellen live betrachtet werden.
   4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS und drehen Sie das Deckglas auf einem Objektträger um, der mit der endgültigen TMRE-Konzentration beschriftet ist.
   5. Sofortige Abbildung der lebenden Zellen (Peak E_x/E_m = 549 nm/575 nm).
      HINWEIS: Fotografieren Sie die Proben sofort, sobald sie aus den Kulturbedingungen entnommen wurden, da die Gesundheit der Mitochondrien beeinträchtigt ist, sobald die Zellen aus dem Medium entnommen und auf einen Objektträger gelegt werden. Als Alternative zu Deckgläsern können die Zellen in Glasbodenschalen abgebildet werden.
   6. Nehmen Sie die Bilder mit dem verfügbaren Mikroskop und der Software auf.
      HINWEIS: Legen Sie während des TMRE-Konzentrationsoptimierungsprozesses experimentelle mikroskopische Bildgebungsparameter fest und behalten Sie die gleichen Bedingungen in nachfolgenden Experimenten bei, um einen genauen Datenvergleich zu gewährleisten. Für das detaillierte Protokoll wurden ein konfokales Mikroskop und kompatible Software verwendet (siehe Materialtabelle).
   7. Wählen Sie die optimale TMRE-Konzentration, die von der Zelllinie abhängt.
      HINWEIS: Die TMRE-Konzentration, die das beste Signal zur Auflösung von Veränderungen der mitochondrialen TMRE-Spiegel liefert, ist im Allgemeinen die niedrigste TMRE-Konzentration, die ein gleichmäßiges und leicht nachweisbares Fluoreszenzsignal ergibt.
4. Testen des polarisierten Zustands einer Zelle
   1. Vorbereitung des Assays
      1. Bereiten Sie die Behandlungsstammlösungen in den gewünschten Konzentrationen vor und bereiten Sie Medien mit der endgültigen Konzentration, die untersucht werden soll, vor. Für FCCP sollte die Stammlösung 20 mM betragen (hergestellt mit DMSO aus einer 50 mM Stammlösung).
      2. Bearbeiten Sie jeweils ein einzelnes Deckglas und geben Sie 1,8 ml des Mediums und die Testverbindung zu den Zellen.
      3. Inkubieren Sie die Zellen mit der Testverbindung bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer befeuchteten Umgebung für den gewünschten Zeitraum.
         HINWEIS: Die Behandlungszeiten variieren je nach dem Mechanismus, durch den die Testverbindung das Potenzial der mitochondrialen Membran verändern kann. Potente Protonophore wie FCCP, die die mitochondrialen Membranpotentiale schnell und direkt depolarisieren, müssen kurz nach der Behandlung (innerhalb von Minuten) analysiert werden. Im Gegensatz dazu kann es bei Behandlungseffekten mit Verbindungen, die sich indirekt auf die mitochondriale Elektronentransportkettenfunktion auswirken, wie z. B. solche, die die Proteinaktivierung oder den Proteinumsatz verändern oder eine Proteinsynthese erfordern, länger dauern, bis sie eine Wirkung zeigen.
      4. Schalten Sie während der Inkubation das Mikroskop ein und stellen Sie es auf die vorgegebenen optimalen Bildgebungsparameter ein, einschließlich der Verstärkung, der Laserintensität, der Bildaufnahmerate, der Mittelwertbildung und der Belichtungszeit.
      5. Nach der medikamentösen Behandlung werden 200 μl 10x TMRE (oben festgelegte optimale Konzentration) zu den Kontroll- und medikamentenbehandelten Zellen gegeben.
      6. 15-30 min bei 37 °C in 5% CO₂ in einer befeuchteten Umgebung inkubieren. Saugen Sie das Medium vorsichtig an und spülen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS ab.
      7. Wiederholen Sie den 1-fachen PBS-Spülschritt, um einen durch das Zellkulturmedium oder die Behandlungssubstanzen verursachten Hintergrund zu vermeiden, und drehen Sie das Deckglas auf einem Objektträger um, der mit den Behandlungsbedingungen beschriftet ist.
      8. Bild der Zellen live bei E_x/E_m = 549 nm/575 nm. Erfassen Sie mit einem konfokalen Mikroskop mehrere Z-Stapel-Felder mit Hochgeschwindigkeits-Bilderfassung (512 Pixel x 512 Pixel, Mittelwertbildung = 4), bevor die Zellintegrität verloren geht.
      9. Speichern und speichern Sie die Bilddatei für die Analyse. Die Prozedur wird für die nächste Versuchsbedingung wiederholt.
   2. Experimentelle Kontrollen
      1. Es wird eine (Negativ-)Kontrolle ohne Behandlung verwendet, die wie oben beschrieben (Schritte 3.1.1-3.1.8) durchgeführt wird, ohne dass die Testverbindung im Medium enthalten ist.
      2. Verwenden Sie eine mitochondriale Membranpotential-Störungskontrolle (Positivkontrolle), die aus der Protonophorverbindung FCCP besteht. Geben Sie 1,8 ml 20 μM FCCP (siehe Materialtabelle) in Medium zu den Zellen. Wie vorstehend beschrieben (Schritte 3.1.1-3.1.2; und Zellbildgebung, wie in den Schritten 3.1.3-3.1.8 beschrieben), wird vor der Färbung mit TMRE 10 min bei 37 °C in 5 %_CO2 in einer befeuchteten Umgebung inkubiert.
         HINWEIS: Für diese Experimente sind sowohl Positiv- als auch Negativkontrollen erforderlich.
   3. Quantifizierung
      1. Messen Sie die erfassten Pixelintensitäten einzelner Zellen anhand eines einzigen repräsentativen Bildes aus dem zentralen Bereich jedes Z-Stapels. In dieser Arbeit wurde eine einzige Fokusebene gewählt, um die Analyse zu erleichtern.
      2. Analysieren Sie die Pixelintensitäten von mindestens 30 Zellen (in ihrer Gesamtheit) pro Behandlung. Verwenden Sie Excel oder Prisma, um die Pixelintensitäten für jede Behandlung zu mitteln, und stellen Sie sie im Balkendiagrammformat mit dem Standardfehler des Mittelwerts dar.
         HINWEIS: ImageJ kann auch zur Fluoreszenzquantifizierung verwendet werden. Alternativ kann die TMRE-Färbefluoreszenz mit kommerziellen Softwareplattformen quantifiziert werden.

3. Etablierung der Ionenkanalfunktion mittels Elektrophysiologie

HINWEIS: Das Verfahren in diesem Abschnitt beschreibt die Verwendung eines automatisierten Elektrophysiologie-Assays zum Screening von Testverbindungen in einer Krebszelllinie (Abbildung 3).

1. Vorbereitung der Zellen
   1. Ernten Sie Zellen aus einer gesunden Kultur, die keine abgestorbenen Zellen und/oder kein übermäßiges Wachstum der Zellen aufweist. Verwenden Sie entweder die chemische Zellablösungslösung TrypLE oder einen manuellen Zellschaber, um adhärente und geclusterte Zellen zu ernten. Dissoziieren Sie Zellen, die in Klumpen oder Kugeln wachsen, was besonders häufig bei ZNS-Krebszellen vorkommt.
      HINWEIS: Die sanfte Dissoziation der Zellen trägt dazu bei, die Integrität der Membranproteine zu erhalten, die für die Ionenleitfähigkeit unerlässlich sind.
   2. Die Zellen werden bei 561 x g für 10 min bei RT zentrifugiert. Den Überstand verwerfen und das Pellet in DMEM (ohne Phenolrot), HEPES und Penicillin/Streptomycin mit 20 % FBS und 4 mM L-Glutamin (siehe Materialtabelle) bei 37 °C suspendieren.
      HINWEIS: DMEM-Medium, dem Phenolrot fehlt, wird verwendet, da die Exposition gegenüber Phenolrot die Membranpermeabilität hemmt.
   3. Platten Sie die Zellen auf ein mit Poly-L-Lysin beschichtetes Deckglas mit geringer Dichte, so dass eine Trennung zwischen den einzelnen Zellen besteht.
      HINWEIS: Hier wird Poly-L-Lysin und nicht Poly-D-Lysin verwendet, da Poly-L-Lysin bessere Beschichtungseigenschaften hat.
   4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer befeuchteten Kammer für 12 bis 24 Stunden (ein optimaler Zeitpunkt muss festgelegt werden), bevor Sie eine Aufnahme machen.
2. Elektrophysiologische Aufzeichnung
   1. Entfernen Sie das Medium aus den Deckgläsern. Waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 1x PBS. Fügen Sie ~300 μl TrypLE-Lösung hinzu. Pipettieren Sie mit der Pipette vorsichtig vier- bis fünfmal nach oben/unten, bis sich die Zellen gelöst haben.
   2. Fügen Sie serumfreies Medium (DMEM) (phenolrotfrei) hinzu und halten Sie eine endgültige Zellzahl pro Volumen von mindestens 1 Million Zellen/ml aufrecht. Entrümpeln Sie die Zellen mit einer 1-ml-Pipette, um eine Zellsuspension ohne Zellcluster zu erhalten.
   3. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 1-ml-Röhrchen. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 10 Minuten, um die Zellmembran zu stabilisieren. Lassen Sie die Zellen auf einem Schüttler rotieren (Schonzyklus), um die Bildung von Zellklumpen zu vermeiden.
   4. Bereiten Sie das Port-a-Patch-Setup vor (siehe Materialtabelle). Schalten Sie den Computer, den Verstärker und das Perfusionssystem ein. Öffnen Sie die Patch-Master-Software und erstellen Sie eine neue Datei.
   5. Bringen Sie die Puffer (extrazellulär und intern) auf RT und laden Sie dann die Puffer in die entsprechenden Perfusionsröhrchen.
      ANMERKUNG: Für die Aufnahme des GABA-A-Rezeptors ist sowohl eine "extrazelluläre (Bad-)Lösung" erforderlich, die 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES und 6 mM D-Glucose enthält (pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt) als auch eine "interne Lösung", die 120 mM KCl, ₂ mM MgCl2_{, 10} mM EGTA enthält. und 10 mM HEPES (pH-Wert mit NaOH auf 7,2 eingestellt).
   6. Füllen Sie die Unterseite eines Elektrodenchips (vom Hersteller bereitgestellt) mit 5 μl interner Lösung und legen Sie den Elektrodenchip auf die Faraday-Oberseite des Port-a-Patch. Geben Sie 10 μl externe Lösung in den Chip und beobachten Sie den rechteckigen Impuls auf dem Oszilloskop mit der Patch-Master-Software (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Der Widerstand kann im Bereich von 2-3 MΩ liegen, dies ist jedoch von der Zelllinie abhängig.
   7. Beginnen Sie mit der Aufnahme, sobald der rechteckige Impuls sichtbar ist, nach den ersten elektronischen Einstellungen und nachdem die Software den Benutzer aufgefordert hat, Zellen hinzuzufügen.
   8. Geben Sie vorsichtig 20 μl Einzelzellsuspension auf den zentralen Teil der Elektrode und warten Sie, bis der Zellfleck gefolgt von einer Giga-Ohm-Versiegelung vorhanden ist, indem Sie die Widerstandswerte in der Software beobachten.
   9. Der Live-Fortschritt des Zell-Patchings kann in der linken Spalte der Software beobachtet werden. Sobald die Zelle "im Ganzzellenmodus gehalten wird", beginnen Sie mit den Aufnahmen, indem Sie ein Protokoll in der Software öffnen.
   10. Stellen Sie das Haltepotential auf −80 mV ein. Führen Sie ein lückenloses kontinuierliches Aufzeichnungsprotokoll mit der Patch-Master-Software aus, um den Strom aus der Zelle aufzuzeichnen.
   11. Erhalten Sie eine stabile Basislinie und wechseln Sie für eine bestimmte Dauer zu einem Liganden und der entsprechenden Wirkstoffanwendung, indem Sie die Registerkarte "Automatisierte Perfusion" im linken Bereich der Software verwenden.
   12. Erfassen Sie Daten mit der Patch-Master-Software.
       HINWEIS: Die Daten werden mit 1 kHz tiefpassgefiltert und mit 100 kHz digitalisiert.
   13. Führen Sie eine Datenanalyse durch, indem Sie die maximale Amplitude des Stromverhaltens mit der Nest-o-Patch-Software berechnen (siehe Materialtabelle).

4. In-vitro-Potenz

HINWEIS: Dieses Verfahren beschreibt einen MTS-Assay zur Bestimmung der Arzneimittelwirksamkeit. Der One Solution Cell Proliferation Assay kombiniert alle erforderlichen Assay-Reagenzien zu einer vorbereiteten Lösung, die in einem Schritt in Zellkulturvertiefungen gegeben werden kann, um die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen nach der Behandlung mit experimentellen Verbindungen zu beurteilen. Das Reagenz wird gemäß den Empfehlungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) rekonstituiert, aliquotiert und bei −20 °C gelagert. In diesem Abschnitt wird die Verwendung des Assays zur Bestimmung des IC₅₀ von Testverbindungen in einer bestimmten Zelllinie beschrieben (Abbildung 4). Dieses MTS-Reagenz kann auch für das Hochdurchsatz-Screening einer großen Anzahl von Verbindungen in bekannten Konzentrationen verwendet werden.

1. Vorbereitung der Zellen
   HINWEIS: Die Zellzahl hängt vom Wachstum und Stoffwechsel jeder einzelnen Zelllinie ab. Bestimmen Sie die optimale Zellzahl experimentell, bevor Sie den Assay zur Bewertung von Prüfbehandlungen verwenden.
   1. Entnehmen Sie adhärente Zellen aus der Kultur durch Trypsinisierung und verwenden Sie Accutase (siehe Materialtabelle), um die Zellen, die in Klumpen oder Kugeln wachsen, zu dissoziieren.
      HINWEIS: Glioblastom- und primäre Medulloblastom-Zelllinien benötigen oft Accutase, da sie dazu neigen, in Klumpen oder Kugeln zu wachsen.
   2. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie eine Zelllösung mit 10.000 Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 75 μl her. Verdünnen Sie den Stamm für die zu testenden Zellzahlen. Bereiten Sie mindestens 1 ml pro Verdünnung vor.
   3. 75 μl jeder Verdünnung in Sätze von fünf aufeinanderfolgenden Vertiefungen in einer 96-Well-Platte auftragen. Inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO₂ über Nacht in einer befeuchteten Umgebung (z. B. einem Inkubator).
      HINWEIS: Zelllinien mit langsamem Wachstum oder Stoffwechsel (die ihr Wachstumsmedium in mehr als 3 Tagen ansäuern) können mehr als 10.000 Zellen als oberen Zellzahlbereich benötigen, während Zelllinien, die schnell wachsen (im Allgemeinen schneller als 20 Stunden Verdopplungszeit), weniger Zellen benötigen. Zelllinien mit einem hohen Stoffwechsel benötigen möglicherweise weniger als 1.000 Zellen pro Well. Der Zellbereich kann angepasst werden, um die optimale Plattierungsdichte für den MTS-Assay für diese Zelllinien zu bestimmen.
2. Kontrolle der Scheinbehandlung
   1. Fügen Sie 25 μl Medium pro Vertiefung hinzu, um die Zugabe der Testverbindung im MTS-Assay zu simulieren.
      HINWEIS: Im eigentlichen MTS-Assay werden 25 μl eines 4-fachen Stamms der gewählten Behandlungskonzentration für die Testverbindung (hier ein GABA-A-Rezeptormodulator, QH-II-066) zu den Zellen gegeben, um die 1-fache endgültige Behandlungskonzentration in einem Gesamtvolumen von 100 μl pro Well zu erhalten.
   2. 48 h bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer befeuchteten Umgebung inkubieren. Dies simuliert die Standardinkubation in Gegenwart eines Medikaments.
3. MTS-Assay
   1. Tauen Sie die erforderlichen Aliquots des MTS-Reagenzes auf. Fügen Sie 20 μl MTS-Reagenz pro Vertiefung hinzu. Bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer befeuchteten Umgebung für 1 h inkubieren.
   2. Zentrifugieren Sie die Platte (1.350 x g für 5 min) bei Raumtemperatur, um Blasen zu entfernen, die die Absorptionsmessung beeinträchtigen können.
      HINWEIS: Entfernen Sie alle Blasen mit einer feinen Nadel.
   3. Lesen Sie die Absorption bei 490 nm ab. Speichern Sie die Daten als Excel-Datei.
   4. Die Platten werden auf 37 °C in 5 % CO₂ zurückgesetzt und innerhalb des 4-stündigen linearen Bereichs des Assays wiederholt abgelesen.
      HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, vor dem Ablesen der Extinktion erneut zu zentrifugieren. Daten aus späteren Messungen, insbesondere aus der 2-Stunden-Messung, können wichtig sein, um zu untersuchen, wie schnell eine Zelllinie das MTS-Reagenz metabolisiert, und sind nützlich bei der Auswahl der Anzahl der Zellen auf der Platte für den Assay.
   5. Zeichnen Sie die optische Absorptionsdichte (OD) bei 490 nm (OD₄₉₀) im Vergleich zur plattierten Zellzahl mit Excel oder Prisma auf.
   6. Wählen Sie die Zellnummer für den Assay aus. Die optimale Anzahl der Zellen liegt im linearen Bereich und unterhalb der Sättigung (OD₄₉₀ = 1).
      HINWEIS: Bei Zellen mit langsamem Wachstum kann die höchste plattierte Zellzahl auf 20.000 Zellen pro Well eingestellt werden, und 500 Zellen pro Well können aus dem Assay herausgelassen werden.
4. Bestimmung des IC₅₀
   1. Tag 1: Platte der Zellen für den MTS-Assay
      1. Notieren Sie den Zellliniennamen und die Durchgangsnummer jeder Linie in der Studie. Um der Verdunstung während des Assays entgegenzuwirken, füllen Sie mindestens die oberen und unteren Reihen des äußeren Umfangs sowie die linken und rechten Endumfangssäulen der 96-Well-Platte mit 1x PBS, 100 μl pro Well, um der Verdunstung während des Assays entgegenzuwirken.
      2. Platte mit der optimalen Anzahl von Zellen für jede Zelllinie, die vor Beginn des Assays bestimmt wurde. Platten Sie die Zellen in 75 μl pro Vertiefung mit phenolrotem, antibiotikafreiem Medium, das keinen HEPES-Puffer enthält. Das FBS kann auf 20% erhöht werden, um das Wachstum der Zelllinien zu unterstützen.
         HINWEIS: Es wird ein Medium ohne Phenolrot verwendet, da die Exposition gegenüber Phenolrot die Membranpermeabilität hemmt.
      3. Die Probe wird für die Behandlungskonzentration mit mindestens Fünffach befüllt. Zählen Sie die Zellen mit einem manuellen oder automatisierten Hämozytometer.
         HINWEIS: Um ein manuelles Hämozytometer zu verwenden, (1) bereiten Sie eine 1:1-Verdünnung von Zellen vor, die in Medium in Trypanblau resuspendiert wurden; (2) je nach Zelllinie 5-15 Minuten inkubieren; (3) 10 μl der Zellen in Trypanblau in die Hämozytometer-Zählkammer laden; (4) Zähle die lebensfähigen Zellen in den vier Ecken und mittleren Quadraten und bestimme die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Quadrat; (5) Berechnen Sie die lebensfähigen Zellen pro Milliliter wie folgt:
         Lebensfähige Zellen pro ml = Durchschnittliche lebensfähige Zellen × 2 (Verdünnungsfaktor) × 10⁴
      4. Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen, um die gewünschte Zellkonzentration in phenolrotem, antibiotikafreiem Medium herzustellen, das keinen HEPES-Puffer enthält (d. h. 75 μl pro Vertiefung x 60 Vertiefungen pro Platte = 4,5 ml Zellen pro Platte).
         HINWEIS: Jede Platte muss über einen Regler verfügen, der nur für die Subtraktion des Hintergrunds bestimmt ist. Die Mediumsteuerung kann bei Bedarf die PBS-Wells ersetzen.
   2. Tag 2: Zugabe der Behandlungsmasse
      1. Bereiten Sie die Versuchsbehandlungen mit dem 4-fachen der gewünschten Endkonzentration vor, um die gewünschte Endkonzentration zu erhalten, wenn 25 μl Behandlungslösungen zu Zellen hinzugefügt werden, die mit 75 μl Medium beschichtet sind (= 100 μl Gesamtvolumen pro Well).
      2. Bereiten Sie die Testlösungen (in diesem Fall den GABA-A-Rezeptormodulator QH-II-066) durch serielle Verdünnung der am höchsten konzentrierten Vorräte vor. Wenn beispielsweise die endgültigen Arzneimittelkonzentrationen 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM und 0,3125 μM betragen sollen, dann bereiten Sie 1:1-Serienverdünnungen vor, beginnend mit 20 μM, um Konzentrationen von 10 μM, 5 μM, 2,5 μM bzw. 1,25 μM zu erhalten.
         HINWEIS: Jede Platte erfordert zusätzlich zur Nur-Medium-Kontrolle zwei zellbasierte Kontrollen: unbehandelte Zellen (nur Medium) und Zellen, die mit Lösungsmitteln (oft DMSO) in einer bekannten Konzentration behandelt wurden. Es empfiehlt sich, sicherzustellen, dass das Vehikel die Zellproliferation im aktiven Bereich der Verbindung nicht beeinträchtigt.
      3. Nach Zugabe der Testverbindung werden die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer befeuchteten Umgebung für 48 h inkubiert.
   3. Tag 3: Durchführung des Zellproliferations-Assays (MTS)
      1. Berechnen Sie das Volumen des benötigten MTS-Reagenzes (20 μl pro 100 μl Testkultur) und tauen Sie das erforderliche Volumen des aliquotierten MTS-Reagenzes auf (siehe Materialtabelle).
      2. Vortex und stellen Sie sicher, dass das Reagenz vollständig in Lösung ist, bevor Sie es verwenden. Das aufgetaute Reagenz wird in ein steriles 25-ml-Reagenzreservoir pipetiert.
      3. Pipetieren Sie 20 μl MTS-Reagenz (mit einer Mehrkanalpipette) in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die Proben in 100 μl Nährmedium enthält.
      4. Die Platte wird bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer befeuchteten Umgebung für 1 h bis 4 h inkubiert. Platten können zu mehreren Zeitpunkten gelesen werden. In der Regel werden die Platten nach 1 h und nach 2 h oder 3 h abgelesen.
      5. Blasen im Medium können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Schleudern Sie die Platte vor dem Ablesen im Plattenleser 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.350 x g . Eine Nadel oder eine Pipettenspitze kann verwendet werden, um alle Blasen zu entfernen, die nach dem Zentrifugieren zurückbleiben.
      6. Messen Sie die Extinktion bei 490 nm mit einem geeigneten Mikroplatten-Reader oder Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
      7. Speichern Sie die Daten als Excel-Datei.
         HINWEIS: Die Inkubationszeit in Gegenwart der Testverbindung hängt von der Stoffwechselrate und dem Wachstum der untersuchten Zelllinie sowie von der zu testenden Verbindung ab. Eine Inkubationszeit von 48 h ist für die meisten Zelllinien und Testsubstanzen ein guter Ausgangspunkt.
5. Datenanalyse
   1. Übertragen Sie die Daten in eine Excel-Datei, und organisieren Sie die Daten für jede Replikation, indem Sie die Konzentration der Testverbindung erhöhen. Mitteln Sie den Nur-Medium-Kontrollwert, und subtrahieren Sie diesen Wert von den experimentellen Daten.
   2. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Zellproliferation in den Behandlungsvertiefungen im Vergleich zu den Vehikelvertiefungen (oder lösungsmittelbehandelten Kontrollvertiefungen), indem Sie die Kontrolle für jedes Replikat auf 100 % Proliferation einstellen.
   3. Übertragen Sie die in Excel generierten Daten in ein Programm Ihrer Wahl. Die Autoren verwenden in der Regel die Prism-Software (siehe Materialtabelle), um die Wirkstoffkonzentration zu bestimmen, die die Zellproliferation um 50 % hemmt (IC₅₀).
   4. Erstellen Sie in der Prism-Software eine Datentabelle mit der X-Spalte als Zellennummer und der Y-Spalte als durchschnittlichem OD für fünf Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten.
   5. Geben Sie die Werte für die Behandlungskonzentration in die Spalte X ein, wenn Sie eine medikamentöse Behandlung analysieren. Beschriften Sie die x-Achse mit dem Namen der Behandlungsverbindung und den Konzentrationseinheiten.
   6. Geben Sie die berechneten Werte für die Viabilität von Replizierungszellen aus der Excel-Analyse in die Unterspalten Y ein. Beschriften Sie die y-Achse als Zellproliferation (%).
   7. Wählen Sie im Analysewerkzeug unter XY-Analysen die Option Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) aus.
   8. Wählen Sie Dosis-Wirkungs-Verhältnis [Hemmung] vs. normalisiertes Ansprechen - variable Steigung.
   9. Führen Sie die Analysefunktion aus. Zeigen Sie die Ergebnistabelle an, um die berechneten Best-Fit-Werte für IC₅₀ und das Kurvenanpassungsdiagramm anzuzeigen. Die x-Achse des Diagramms kann auf Wunsch in einen logarithmischen Maßstab geändert werden.

Oben sind ausgewählte Verfahren aufgeführt, die zur Charakterisierung von Ionenkanälen in Krebszellen eingesetzt werden können. Das erste Protokoll hebt die Färbung eines Ionenkanals hervor. Wie bereits erwähnt, gibt es viele Herausforderungen bei der Färbung eines Ionenkanals oder eines Proteins, das in der extrazellulären Membran vorhanden ist. In Abbildung 1 ist die Färbung für eine Untereinheit des pentameren GABA-A-Rezeptors dargestellt. Das zweite Protokoll hebt die Ergebnisse der Untersuchung des polarisierten Zustands von Mitochondrien in Krebszellen hervor. Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für die Lebensfähigkeit und Proliferation von Zellen sowie für den Zelltod. In Säugetierzellen aktivieren Mitochondrien die Apoptose als Reaktion auf zellulären Stress durch die Freisetzung der Proteine der Bcl-2-Familie, die sich zwischen den inneren und äußeren Membranen der Mitochondrien befinden. Im Zytosol aktivieren die Proteine der Bcl-2-Familie Caspase-Proteasen, die den programmierten Zelltod vermitteln. Veränderungen in der Funktion des Ionenkanals der Plasmamembran können zu einer Störung der intrazellulären Ionenhomöostase führen, auch in Bezug auf die Ionenspiegel in den Mitochondrien, was zu einem Verlust des Membranpotentials und damit zur Auslösung der Apoptose führenkann 14. Die Spiegel von Ca2+, K+, Na+ und H+ sind wichtige Determinanten bei Signalereignissen, die den mitochondrial initiierten Zelltod auslösen können. In Abbildung 2 ist die Färbung mit dem zellpermeablen, positiv geladenen Farbstoff TMRE zur Markierung und Abbildung des Membranpotentials in aktiven Mitochondrien, die eine negative Ladung21,22 aufrechterhalten, dargestellt. TMRE ist ein rot-oranger Farbstoff, der aufgrund ihrer relativ negativen Ladung an aktive Mitochondrien bindet. Depolarisierte oder inaktive Mitochondrien haben ein reduziertes Membranpotenzial und sind daher nicht in der Lage, TMRE zu sequestrieren. In diesem Experiment ist der Ionophor-Entkoppler FCCP eine wichtige Kontrolle, da er die mitochondrialen Membranen depolarisiert und dadurch die Akkumulation von TMRE23 verhindert. Das dritte Protokoll beleuchtet die Einzelzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie. In Abbildung 3 sind repräsentative Aufzeichnungen einer Spur dargestellt, die von der vom Patienten stammenden Medulloblastom-Zelllinie D283 aufgezeichnet wurde. Das vierte Protokoll schließlich hebt einen Assay hervor, um den Zustand der Proliferation von Krebszellen zu bestimmen. Abbildung 4 zeigt Details zur Funktionsweise des MTS-Assays sowie eine Illustration der Platte und des Messwerts, wenn sie mit einem Wirkstoff inkubiert wird, der die Lebensfähigkeit der untersuchten Krebszellen beeinträchtigt (in diesem Fall DAOY).

Abbildung 1: Färbung von Zellen für Ionenkanäle. (A) Färbung des Proteins Gabra5, einer Untereinheit des GABA-A-Rezeptors, in D283-Medulloblastom-Krebszellen. (B) Fixierte Zellen, die mit dem fluoreszierenden Farbstoff 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) behandelt wurden, der an DNA bindet. (C) Verschmelzung von Medulloblastom-Krebszellen, die sowohl für Gabra5 als auch für DAPI gefärbt sind. Maßstabsbalken = 10 μm. Die Abbildung wurde von Kallay et al.14 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Prüfung des polarisierten Zustands von Mitochondrien . (A) Lebende D283-Medulloblastom-Krebszellen werden mit steigenden Konzentrationen des Medikaments QH-II-066 behandelt. Die Zellen werden dann mit positiv geladenem, zelldurchlässigem TMRE (Tetramethylrhodamin, Ethylester) behandelt, das sich in aktiven (negativ geladenen) Mitochondrien anreichert. Depolarisierte oder inaktive Mitochondrien haben ein reduziertes Membranpotenzial und können daher den TMRE-Farbstoff nicht zurückhalten. Dadurch zeigen sie ein geringes Fluoreszenzsignal. Aufgenommen durch Fluoreszenzmikroskopie; FCCP (Carbonylcyanid-4-[trifluormethoxy]phenylhydrazon). Peak: λex, 549 nm; λem, 575 nm. Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Quantifizierung der TMRE-Färbung (Bilder in Tafel A) mit Hilfe der Softwareplattform. Die Daten werden als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Die Abbildung wurde von Kallay et al.14 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Etablierung der Ionenkanalfunktion mit Hilfe der Elektrophysiologie. (A) Dargestellt ist ein Port-a-Patch-Setup oder -Rig, bestehend aus einem Faradayschen Käfig (a), einer Aufzeichnungskammer (b) und einer Absaugeinheit (c, rechts). (B) Draufsicht auf das Port-a-Patch-Rig mit Blick auf die Aufzeichnungskammer, die mit einem Perfusionseinlass (a), einem Auslass (b) und einer Referenzelektrode (c) ausgestattet ist. (C) Der Port-a-Patch ist mit einem Perfusionssystem für den schnellen Lösungsaustausch mit automatisierten und manuellen Betriebsmodi und Lösungsreservoirs verbunden. (D) Repräsentative Stromspur aus einer elektrophysiologischen Aufzeichnung der Ganzzell-Patch-Clamp unter Verwendung eines Port-a-Patch-Rigs (Nanion) und D283-Medulloblastom-Krebszellen. GABA (10 μM) wurde für 5 s mit einem Haltepotential von −80 mV appliziert. (E) Repräsentative Stromspur aus einer elektrophysiologischen Aufzeichnung der Ganzzell-Patch-Clamp unter Verwendung eines Port-a-Patch-Rigs (Nanion) und D283-Medulloblastom-Krebszellen unter gleichzeitiger Anwendung von GABA (1 μM) und dem GABA-A-Rezeptoragonisten (Vollanästhetikum) Propofol (50 μM), der den durch GABA allein induzierten Strom potenziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: MTS-Assay zur Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln. (A) Chemische Reaktionen, die dem "MTS-Assay" zugrunde liegen, der zur Beurteilung der Wirksamkeit eines Wirkstoffs verwendet wird, was sich in einer Verringerung der Zellproliferation widerspiegelt. Reduktion von MTS-Tetrazolium durch lebensfähige Zellen, wodurch der Farbstoff Formazan entsteht. (B) Eine 96-Well-Platte, die die kolorimetrischen Ergebnisse eines MTS-Assays mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen zeigt. In diesem Experiment werden die DAOY-Medulloblastom-Krebszellen mit steigenden Konzentrationen eines präklinischen Medikaments, KRM-II-08, einem positiven allosterischen Modulator des GABA-A-Rezeptors, behandelt. (C) Eine Dosis-Wirkungs-Kurve, die mit dem MTS-Assay (aus der Quantifizierung einer 96-Well-Platte) erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vergleich von manuellen und halb- und/oder vollautomatischen elektrophysiologischen Setups.

D.A.P.K. ist Mitbegründer, Präsident und CEO von Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. ist Mitbegründer von Amlal Pharmaceuticals Inc. und sitzt im Drug Safety Monitoring Board von Bexion Pharmaceuticals, Inc.