Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Summary

Wir haben einen speziesübergreifenden vergleichenden Onkogenomik-Ansatz entwickelt, der genomische Analysen und funktionelle genomische Screenings verwendet, um therapeutische Ziele in Tumoren, die in gentechnisch veränderten Mausmodellen auftreten, und den entsprechenden menschlichen Tumortyp zu identifizieren und zu vergleichen.

Abstract

Maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) stammen von Schwann-Zellen oder ihren Vorläufern ab. Bei Patienten mit dem Tumor-Suszeptibilitäts-Syndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) sind MPNSTs die häufigste Malignität und die häufigste Todesursache. Diese seltenen und aggressiven Weichteilsarkome bieten mit einer krankheitsfreien 5-Jahres-Überlebensrate von 34-60% eine düstere Zukunft. Die Behandlungsmöglichkeiten für Menschen mit MPNST sind enttäuschend begrenzt, wobei eine entstellende Operation die wichtigste Behandlungsoption ist. Viele einst vielversprechende Therapien wie Tipifarnib, ein Inhibitor des Ras-Signalwegs, haben klinisch versagt. Auch klinische Phase-II-Studien mit Erlotinib, das auf den epidermalen Wachstumsfaktor (EFGR) abzielt, und Sorafenib, das auf den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptor (VEGF), den Thrombozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (PDGF) abzielt, und Raf in Kombination mit einer Standard-Chemotherapie haben bei den Patienten kein Ansprechen hervorgerufen.

In den letzten Jahren haben sich funktionelle genomische Screening-Methoden in Kombination mit der genetischen Profilierung von Krebszelllinien als nützlich erwiesen, um essentielle zytoplasmatische Signalwege zu identifizieren und zielspezifische Therapien zu entwickeln. Bei seltenen Tumorarten wird zunehmend eine Variante dieses Ansatzes, die sogenannte speziesübergreifende vergleichende Onkogenomik, eingesetzt, um neue therapeutische Ziele zu identifizieren. In der artübergreifenden vergleichenden Onkogenomik werden genetische Profilierung und funktionelle Genomik in gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEM) durchgeführt und die Ergebnisse dann in den seltenen menschlichen Proben und Zelllinien validiert, die zur Verfügung stehen.

In diesem Artikel wird beschrieben, wie Kandidaten-Treibergenmutationen in menschlichen und Maus-MPNST-Zellen mittels Whole-Exom-Sequenzierung (WES) identifiziert werden können. Anschließend beschreiben wir, wie shRNA-Screenings auf Genomebene durchgeführt werden können, um kritische Signalwege in MPNST-Zellen von Mäusen und Menschen zu identifizieren und zu vergleichen und medikamentöse Ziele in diesen Signalwegen zu identifizieren. Diese Methoden bieten einen effektiven Ansatz zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele bei einer Vielzahl von Krebsarten beim Menschen.

Introduction

Maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) sind hochaggressive Spindelzellneoplasien, die in Verbindung mit dem Tumor-Suszeptibilitätssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) sporadisch in der Allgemeinbevölkerung und an Stellen früherer Strahlentherapie auftreten ^1,2,3. NF1-Patienten werden mit einer Wildtyp-Kopie des NF1-Tumorsuppressorgens und einem zweiten NF1-Allel mit einer Loss-of-Function-Mutation geboren. Dieser Zustand der Haploinsuffizienz macht NF1-Patienten anfällig für eine zweite Loss-of-Function-Mutation in ihrem Wildtyp-NF1-Gen, d....

Protocol

Lassen Sie vor Beginn der Studien Tierverfahren und -protokolle für den Umgang mit viralen Vektoren vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und dem Institutional Biosafety Committee (IBC) überprüfen und genehmigen. Die hier beschriebenen Verfahren wurden von den IACUC- und IBC-Gremien der Medical University of South Carolina genehmigt und von entsprechend geschultem Personal in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den institutionellen Tierpflegerichtlinien des MUSC durchgeführt.

1. WES-Seq-Analysen und Identifizierung pathogener Varianten

1. Isolierun....

Results

Abbildung 5 zeigt die Depletionswerte von essentiellen Kerngenen (CEGs), die als WAHR markiert sind, im Vergleich zu Nicht-CEGs (als FALSCH markiert) in jeder gescreenten menschlichen Zelllinie. Die Punkte stellen log2 der Fold-Depletion-Scores für einzelne Gene dar, die über einer Boxplot-Darstellung der Gesamtscore-Verteilung dargestellt werden. Der Student's t-Test wurde verwendet, um einen signifikanten Unterschied im Mittelwert der Depletionswerte zwischen den beiden Gruppen in.......

Discussion

Die hier vorgestellten detaillierten Methoden wurden entwickelt, um die Neoplasie des peripheren Nervensystems und die MPNST-Pathogenese zu untersuchen. Obwohl wir festgestellt haben, dass diese Methoden effektiv sind, sollten wir uns darüber im Klaren sein, dass es einige potenzielle Einschränkungen für die hier beschriebenen Methoden gibt. Im Folgenden diskutieren wir einige dieser Einschränkungen und mögliche Strategien, um sie in anderen Modellsystemen zu überwinden.

Wir haben herausgefund.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor-Beschallungssystem	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer und Dekonvoluter-Software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-Well, schwarze Mikroplatte	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml konische Röhrchen	Diagenode
dNTP-Mischung	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elutionspuffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGAGCAT-3'
GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'			HPLC-gereinigtes
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hämatoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyd (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfektionsreagenz	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfektionsreagenz	Millipore Sigma TR1003G
PureLink Quick PCR Aufreinigungskit	Invitrogen	K310001
Qiagen Puffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel-Extraktionskit	Qiagen	28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
Titan-Taq-Polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic	Software-www.usadellab.org