Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Abgrenzung des metabolischen Phänotyps von aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen

628 Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/65457

⸱

17. Juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zur Durchführung von metabolischen Profilen von aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen. Der vorgestellte Ansatz wurde an gesunden erwachsenen männlichen Schweinen optimiert und hat das Potenzial, die Echtzeitbewertung der Lebensfähigkeit von Nierentransplantaten zu verbessern. Diese Methode kann auch dazu beitragen, neue Biologien bei mehreren stoffwechselbasierten Nierenerkrankungen aufzudecken.

Zusammenfassung

Die Nierentransplantation ist die optimale Behandlung für Nierenerkrankungen im Endstadium. Transplantierte Nieren gehen jedoch oft vorzeitig verloren, wobei 10 Jahre nach der Transplantation bis zu 50 % der Transplantate verloren gehen. Eine der Hauptursachen für einen vorzeitigen Transplantatverlust ist die Verletzung, die das Transplantat zum Zeitpunkt der Transplantation erleidet, die als Ischämie-Reperfusions-Schädigung (IRI) bekannt ist. Die verzögerte Transplantatfunktion (DGF), definiert als die Notwendigkeit einer Dialyse in der ersten Woche nach der Transplantation, ist eine Manifestation einer schweren IRI, die funktionelle und histologische Merkmale einer akuten Nierenschädigung (AKI) zeigt. Während die Mechanismen, die AKI antreiben, unklar bleiben, deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass eine veränderte Stoffwechselfunktion im Allotransplantat AKI vermittelt und der Grund für DGF sein könnte. Daher wird die Entschlüsselung und Überwachung der metabolischen Grundlagen von IRI unsere Fähigkeit verbessern, AKI zu diagnostizieren und zu verhindern. Dieser Artikel beschreibt eine einzigartige Methode zur Beurteilung der mitochondrialen Atmung (anhand der Sauerstoffverbrauchsrate), der Glykolyse (extrazelluläre Übersäuerungsrate) und der intrazellulären ATP-Spiegel in Nierenzellsuspensionen, die aus der Nadelbiopsie gewonnen wurden. Die Methodik wurde an gesunden erwachsenen männlichen Schweinen optimiert und in einem Schweinemodell der Autotransplantation validiert. Der vorgestellte Ansatz hat das Potenzial, die Echtzeitbewertung der Lebensfähigkeit von Nierentransplantaten in der Klinik zu verbessern. Die Profilierung des Metabolismus in patienteneigenen Biopsien kann auch neue Biologie bei anderen stoffwechselbasierten Nierenerkrankungen aufdecken.

Einleitung

Die Nierentransplantation ist die optimale Behandlung für Nierenerkrankungen im Endstadium 1,2,3,4; Transplantierte Nieren gehen jedoch oft vorzeitig verloren, wobei 10 Jahre nach der Transplantation bis zu 50 % der Transplantate verlorengehen 5. Betroffene Patienten haben eine erhöhte Morbidität und Mortalität und stellen eine große wirtschaftliche Belastung für die Gesundheitssystemedar 6. Eine der Hauptursachen für den vorzeitigen Verlust des Transplantats ist die Verletzung, die das Transplantat zum Zeitpunkt der Transplantation erlitten hat, die als Ischämie-Reperfusions-Schädigung (IRI) bezeichnet wird. IRI ist eine unvermeidliche Verletzung, die durch eine verminderte Durchblutung verursacht wird, gefolgt von einer Reperfusion7. Die Ischämie ist gekennzeichnet durch eine Succinatakkumulation im Gewebe, die den Elektronenrückfluss in der mitochondrialen Atmungskette antreibt, was zu einer Superoxidproduktion und einer anschließenden Schädigung früh nach der Reperfusion führt8. IRI in transplantierten Organen erhöht das Risiko einer primären Nichtfunktion, einer verzögerten Transplantatfunktion (DGF), einer Abstoßung und schlechterer Transplantatergebnisse 8,9. Die DGF, definiert als die Notwendigkeit einer Dialyse in der ersten Woche nach der Transplantation9, ist eine Manifestation der schweren IRI10. Histologisch manifestiert sich die IRI-assoziierte DGF als akute tubuläre Nekrose (ATN) und Schädigung der Mikrogefäße. Funktionell kommt es zu einer Abnahme der glomerulären Filtrationsrate (GFR) und der Urinausscheidung, Merkmale eines akuten Nierenversagens (AKI) im Allotransplantat11. Trotz ihrer Bedeutung gibt es derzeit keine Therapien für Ischämie-Reperfusions-assoziierte AKI nach der Transplantation. Der Mangel an Behandlungen ist auf ein unvollständiges Verständnis der Krankheitsmechanismen und einen Mangel an Markern zurückzuführen, um Patienten mit dem höchsten Risiko für eine Transplantatdysfunktion während der kritischen Zeitpunkte zu identifizieren, in denen die Verletzung reversibel sein kann12.

Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass ein veränderter Energiestoffwechsel im Allotransplantat AKI vermittelt und DGF 13,14,15 untermauern könnte. Nierenzellen erzeugen Energie über zwei Hauptmechanismen: die mitochondriale Atmung und die Glykolyse16. Bei der IRI führt die Reperfusion zu einer mitochondrialen Dysfunktion17. Folglich wird die Glykolyse zur Hauptenergiequelle 13,18,19,20. Die metabolische Verschiebung der IRI fördert den tubulären und mikrovaskulären Endothelzelltod, was zu AKIführt 21,22,23,24. In einer früheren Arbeit wurde ATN mit einer erhöhten Expression glykolytischer Enzyme und veränderten Spiegeln mitochondrialer Proteineassoziiert 25, in Übereinstimmung mit IRI im Transplantat13,18. Darüber hinaus führte in einem Autotransplantationsmodell der Schweineniere eine Ischämie, gefolgt von einer kalten Lagerung, zu einem verringerten Spiegel an mitochondrialen Proteinen der Niere und einer erhöhten Laktatausscheidung26. Insgesamt untermauern diese Befunde die klinische Bedeutung der Überwachung des metabolischen Phänotyps von Nierentransplantaten bereits vor der Transplantation, da die basalen metabolischen Merkmale des Allotransplantats eine Dysfunktion des Allotransplantats vorhersagen können27.

Klinische Vorhersagemodelle für das kurzfristige Risiko einer Abstoßung und eines Verlusts von Allotransplantaten wurden entwickelt28,29. Diesen Modellen mangelt es jedoch an Präzision und sie berücksichtigen nicht die molekularen Merkmale des Transplantats 30,31,32. Jüngste Studien zielten darauf ab, diesen ungedeckten Bedarf durch die Identifizierung molekularer Muster auf Gewebeebene zu decken, die mit schlechteren Transplantatergebnissen verbunden sind, wie z. B. Dysfunktion und Abstoßung von Allotransplantaten 13,14,15,25,33,34. Diese Studien stützen sich auf molekulare Steady-State-Messungen am Gen 33,34,35, Protein25,26 und Metaboliten13,14, was ein unvollständiges Bild des metabolischen Phänotyps des Allotransplantats hinterlässt. Diese Wissenslücke ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es nicht möglich ist, die Stoffwechselfunktion und den Energiezustand von Nierenproben zu einem bestimmten Zeitpunkt zu messen. Die Entwicklung eines standardisierten Protokolls zur Bestimmung des metabolischen Phänotyps von aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen, das möglicherweise in die Untersuchung von Patientenproben übertragen werden kann, ist gerechtfertigt. Dieser Artikel beschreibt einen einzigartigen Arbeitsablauf zur Beurteilung der mitochondrialen Atmung (anhand der Sauerstoffverbrauchsrate), der Glykolyse (extrazelluläre Ansäuerungsrate) und der intrazellulären ATP-Spiegel in aus Biopsien gewonnenen Nierenzellsuspensionen. Die Methodik wurde unter Verwendung von Nierenbiopsiekernen von gesunden erwachsenen männlichen Schweinen optimiert. Um die zukünftige klinische Umsetzung zu erleichtern, wurden die Biopsiekerne mit einer 18-G-Nadel entnommen, wie in den klinischen Standardprotokollen der Nierentransplantatentnahme36,37. Schließlich wurde der Nutzen der Protokollimplementierung unter diskriminierenden experimentellen Bedingungen in einem Schweinemodell der Autotransplantation validiert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Animal Care Committee des Toronto General Research Institute genehmigt (Animal Use Protocol Nummer: 3652). Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der National Society of Medical Research and Guide for the care of laboratory animals, National Institute of Health (NIH), Ontario, Kanada, versorgt. In dieser Studie wurden fünf 3 Monate alte männliche Yorkshire-Schweine mit einem Gewicht von jeweils etwa 30 kg verwendet. Das Protokoll für diese Methodik ist in die folgenden Schritte unterteilt: (1) Dissoziation einzelner Nierenbiopsiekerne in Zellsuspensionen; (2) Metabolische Profilerstellung von aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen; und (3) Messung des ATP-Gehalts in aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen. Alle Biopsieproben, die für die Messung der Stoffwechselfunktion oder des ATP-Gehalts entnommen wurden, wurden innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme in einer Biosicherheitswerkbank dissoziiert. Der Arbeitsablauf der Methodik ist in Abbildung 1 dargestellt. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Dissoziation einzelner Nierenbiopsiekerne in Zellsuspensionen

  1. Es werden drei Biopsiekerne von Gewebe aus der Nierenrinde entnommen, wobei das koaxiale Nadelsystem (d. h. eine äußere Führungsnadel und eine innere Biopsienadel) verwendetwird 38. Für die klinische Translation wird die Verwendung einer 18-G-Biopsienadel empfohlen39.
    HINWEIS: Halten Sie sich bei Biopsien der Nierenrinde an den Winkel der Biopsienadelpistole (~45 °C) und die Tiefe der Punktion (~20 mm).
  2. Legen Sie jeden Biopsiekern vorsichtig in ein 15-ml-Röhrchen mit 2 ml RPMI 1640 auf Eis.
    1. Fragmentieren Sie das Biopsiegewebe in kleine Stücke (≤2 mm lang) mit einem Skalpell auf einer 6 cm großen Petrischale, die auf Eis gestellt wird. Legen Sie mit einer ultradünnen, gekrümmten Pinzette mit feiner Spitze die Gewebefragmente jeder Biopsie in ein anderes 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml Dissoziationsmedium.
      HINWEIS: Das Dissoziationsmedium besteht aus RPMI 1640 Medium, das 0,1 mg/ml DNase I, 10 mg/ml Kollagenase und 2990 Einheiten/ml neutrale Protease aus Bacillus polymyxa enthält. Die Dissoziation menschlicher Nierenbiopsien unter Verwendung dieser Medienzusammensetzung hat sich als Maximierung der Zellviabilität und zur Erhaltung der Repräsentation seltener und fragiler Zellpopulationen erwiesen40.
  3. Lassen Sie die Dissoziation 30 min lang bei 37 °C (Heizblock) unter intermittierendem Rühren erfolgen (es wird empfohlen, die Röhren alle 5 min zu wirbeln).
  4. Nach der Dissoziation filtrieren Sie die Zellsuspensionen durch 35-μm-Zellsieb-Schnappkappenröhrchen.
  5. Spülen Sie das Sieb mit 1:1 Volumen 100% fötalem Rinderserum (FBS) aus.
  6. Poolen Sie die drei aus der Biopsie gewonnenen Nierenzellsuspensionen in einem 15-ml-Röhrchen.
  7. Die Zellen werden durch Zentrifugation (400 x g, 5 min, 4 °C) pelletiert und in 1 ml RPMI 1640 mit 10 % FBS resuspendiert. Diese Zellsuspension ergibt normalerweise 0,8-1,2 × 106 Zellen.

2. Metabolische Profilerstellung von aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen

HINWEIS: Der Schritt der metabolischen Profilerstellung integriert die Messung der Glykolyse (ECAR) und der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in einem Stoffwechselfunktionsanalysator sowie der intrazellulären ATP-Spiegel mit einem kommerziellen Kit.

  1. Hydratation und Kalibrierung der Patronen-Utility-Platte
    1. Einen Tag vor der Probenentnahme sind 200 μl ddH2O in jede Vertiefung der Kartuschenplatte des Stoffwechselfunktionsanalysators zu geben.
    2. Inkubieren Sie die Kartuschenplatte über Nacht in einem CO2 -freien Inkubator bei 37 °C.
    3. Am Tag der Probenentnahme ist das ddH2O durch Aspiration mit einer Pasteurpipette zu entfernen, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist, und 200 μl Kalibrierungslösung (pH = 7,4) in jede Vertiefung der Kartuschenplatte zu geben.
    4. Inkubieren Sie die Cartridge Utility Plate über Nacht in einem CO2 -freien Inkubator bei 37 °C.
  2. Zellplattierung und Vorbereitung von Assay-Medien und Stressorverbindungen für metabolische Funktionsmessungen
    1. Geben Sie 100 μl RPMI mit 10 % FBS in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte für den Stoffwechselfunktions-Assay.
    2. Trennen Sie ein kleines Aliquot (z. B. 10 μl) der Zellsuspension (erhalten in Schritt 1) in ein anderes Röhrchen und färben Sie die Zellen mit einem Trypanblau-Ausschlussfarbstoff.
    3. Mit einer Zählkammer ist die Konzentration der lebenden Zellen (Trypanblau negativ)41 in der ursprünglichen Suspension zu bestimmen.
    4. Die Zellen werden in jeder der Studienvertiefungen der Assay-Platte für die Stoffwechselfunktion bei einer Dichte von 1,0 x 105 lebenden Zellen/Vertiefung ausgesät. Diese Zellzahl wurde nach der Optimierung ermittelt (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse).
      HINWEIS: Entkernen Sie keine Zellen in einer der vier Ecken der Assay-Platte für die Stoffwechselfunktion, da diese als Rohlinge verwendet werden.
    5. Lassen Sie die Zellen anhaften, indem Sie die Platte für den Stoffwechselfunktionstest über Nacht (~16 h) in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator inkubieren.
    6. Bestätigen Sie am nächsten Tag unter dem Mikroskop, dass die Zellen einen minimalen Zusammenfluss von 70%-80% aufweisen (eine gesunde Zellmonoschicht ist wichtig für eine optimale Bestimmung der metabolischen Funktionsparameter).
    7. Tauen Sie ein Aliquot (40-50 ml) phenolrotfreies Basalmedium bei 37 °C mindestens 15 Minuten lang auf.
    8. Bereiten Sie 35 ml Testmedium vor, indem Sie 2 mM Glutamin (350 μl), 1 mM Pyruvat (350 μl) und 5,55 mM Glukose (385 μl) in 33,915 mL voraufgetautes Basalmedium hinzufügen.
    9. Entfernen Sie das RPMI-Medium mit einer Ein- oder Mehrkanalpipette vorsichtig aus jeder Vertiefung der Assay-Platte für die Stoffwechselfunktion. Fügen Sie anschließend 100 μl Basalmedium hinzu, um die Zellen zu waschen.
    10. Entfernen Sie das Basalmedium vorsichtig und geben Sie 150 μl Assay-Medium in jedes Well, auch in die Wells ohne Zellen.
      HINWEIS: Das Verlassen von Vertiefungen ohne Assay-Medien kann die Feuchtigkeitsbedingungen in der Plattenumgebung beeinflussen und zu inkonsistenten Messungen der Stoffwechselfunktion führen (Ergänzende Abbildung 1).
    11. Legen Sie die Platte für den Stoffwechselfunktionstest für ~1 h bei 37 °C in einen CO2 -freien Inkubator (Akklimatisierungsschritt). Nehmen Sie die Kartuschenplatte (zuvor in kalibrierter Lösung inkubiert) zurück in die Biosicherheitswerkbank.
    12. Während der Akklimatisierung werden die folgenden vier Lösungen von Stressorverbindungen in Testmedien hergestellt: 7 μM Oligomycin (7x, für eine Endkonzentration 1 μM Oligomycin); 2,4 μM Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) (8x, für eine Endkonzentration von 0,3 μM FCCP); 450 mM 2-Desoxyglucose (2-DG) (9x, für eine Endkonzentration von 50 mM 2-DG); 10 μM Rotenon und 10 μM Antimycin A (Rot + AA) (10x, für eine Endkonzentration 1 μM Rot + 1 μM AA).
      HINWEIS: Oligomycin hemmt die Aktivität der ATP-Synthase und unterbricht daher die Elektronentransportkette (ETC). Dies senkt die OCR und den ATP-Synthase-getriebenen Einstrom von Protonen in die Mitochondrien. Infolgedessen wird die Glykolyse zur Hauptquelle der ATP-Produktion42. FCCP ist ein Cyanid-Medikament (negative Ladung), das als Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung wirkt, indem es Protonen anzieht (positive Ladung) und einen kontinuierlichen Protoneneinstrom in die Mitochondrien induziert, was den Sauerstoffverbrauch durch das ETC unabhängig von der ATP-Synthase-Aktivität ermöglicht43. 2-DG ist ein synthetisches strukturelles Analogon von Glukose, bei dem die 2-Hydroxylgruppe durch Wasserstoff ersetzt wird und als kompetitiver Inhibitor der Glykolyse wirkt44. Fäulnis und AA sind Inhibitoren der Komplexe I und III der Elektronentransportkettebzw. 45. Die Auswirkungen der Injektion jedes Medikaments in verschiedenen Schritten des Stoffwechselfunktionsassays sind in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt.
    13. Laden Sie 25 μl jedes Arzneimittels in den entsprechenden Anschluss oben auf jeder Vertiefung der Kartuschenplatte, einschließlich der Vertiefungen ohne Zellen. Laden Sie die Medikamente in folgender Reihenfolge: 7x Oligomycin (Port A), 8x FCCP (Port B), 9x 2-DG (Port C), 10x Rot + AA (Port D).
    14. Inkubieren Sie die Kartuschenplatte im CO2 -freien Inkubator, bis dies zum Einrichten des Stoffwechselfunktionsassays erforderlich ist.
  3. Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs und der glykolytischen Raten in aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen
    1. Stellen Sie sicher, dass der Stoffwechselfunktionsanalysator eingeschaltet und mit der Controller-Software in einem Zubehörcomputer verbunden ist.
    2. Starten Sie die Software.
    3. Klicken Sie auf den Button Vorlage > Leer.
    4. Klicken Sie im ersten Tab auf die Schaltfläche Einspritzstrategie. Klicken Sie auf jede Schaltfläche mit den Buchstaben A, B, C oder D, die den vier Injektionsanschlüssen entsprechen. Notieren Sie sich den Namen des Arzneimittels, das über jeden Port injiziert wird: Oligomycin (Port A), FCCP (Port B), 2-DG (Port C), Rot + AA (Port D).
    5. Definieren Sie auf der zweiten Registerkarte alle Versuchsbedingungen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bedingung hinzufügen , um eine neue Bedingung einzuführen. Die Software weist jedem Zustand automatisch eine Farbe zu. Klicken Sie auf den Button Plattenkarte und weisen Sie jeder Vertiefung die entsprechende Versuchsbedingung zu, die entsprechend eingefärbt wird.
      HINWEIS: Die vier Eckvertiefungen müssen als leer (schwarze Farbe) zugewiesen bleiben, da diese zur Subtraktion des Hintergrundsignals verwendet werden.
    6. Klicken Sie im dritten Tab viermal auf die Schaltfläche Injektion, sodass die vier Injektionen (Ports A, B, C und D) zur Sequenz hinzugefügt werden. Der Assay kann unter Verwendung der Standard-Injektionssequenz (A, B, C, D), der Anzahl der Messungen (3 Basalmessungen + 3 Messungen nach jeder Injektion) und der Zeit zwischen den Messungen (3 Minuten) durchgeführt werden.
    7. Füllen Sie im vierten Tab die Felder mit den wichtigsten Studieninformationen aus und klicken Sie auf Ausführen. Das Fach wird geöffnet und die Software fordert den Benutzer auf, die Kassettenplatte zu montieren. Stellen Sie sicher, dass Sie den grünen Deckel entfernen, bevor Sie die Platte auf das Tablett legen.
    8. Nach der Kalibrierung (~15 min) öffnet sich das Tablett wieder, und die Software fordert den Benutzer auf, die Kartuschenplatte zu entfernen und die Assay-Platte für die Stoffwechselfunktion auf das Tablett zu legen. Entfernen Sie erneut den Tellerdeckel, bevor Sie die Platte auf das Tablett montieren. Die Patronenplatte kann entsorgt werden.
    9. Die Analyse wird in etwa 2 Stunden abgeschlossen sein. Speichern Sie nach dieser Zeit die entsprechende '.asyr'-Datei. Analysieren Sie die .asyr-Dateien rechnerisch, um die ECAR- und OCR-Kurven zu untersuchen. Exportieren Sie Daten in das bevorzugte Format.
  4. Messung des DNA-Gehalts zur Normalisierung von Stoffwechselfunktionsdaten
    1. Bestimmen Sie die DNA-Menge in den Zellen in jeder Vertiefung nach dem Stoffwechselfunktionstest mit dem angegebenen Zellproliferations-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
    2. Bereiten Sie das erforderliche Volumen von 1x Zelllysepuffer vor, indem Sie 20x Zelllysepuffer in deionisiertem Wasser verdünnen.
    3. Um eine Standardkurve zu erstellen, bereiten Sie 100 μl Proben des Bakteriophagen-λ-DNA-Standards (im Zellproliferations-Assay-Kit enthalten) vor, die seriell in Zelllysepuffer auf Konzentrationen im Bereich von 0 ng/ml, 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 400 ng/ml, 800 ng/ml verdünnt wurden. Laden Sie jede Verdünnung in eine andere Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Mikroplatte.
    4. Bereiten Sie 1x Farbstoffbindungslösung vor, indem Sie 400x Farbstoffreagenz in 1x Zelllysepuffer verdünnen. Für jedes Standard-Curve-Well- und Metabolic-Assay-Studien-Well sind 100 μl erforderlich.
    5. 100μL 1x Farbstofflösung in die erste Säule verteilen, die bereits die Standards enthält. HINWEIS: Der Prozess bis zu diesem Zeitpunkt kann 30 Minuten vor dem Ende des Stoffwechselfunktions-Assays gestartet werden.
    6. Entfernen Sie das Assay-Medium mit einer Ein- oder Mehrkanalpipette von der Assay-Platte für die Stoffwechselfunktion.
    7. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl 1x Farbstoffbindungslösung in jede Vertiefung der Assay-Platte für die Stoffwechselfunktion. Pipettieren Sie einige Male auf und ab, um die Zellen zu lysieren, und übertragen Sie den Inhalt auf die schwarze Platte.
    8. Schützen Sie die Mikroplatte vor dem Licht und inkubieren Sie sie 2-5 Minuten lang bei 37 °C.
    9. Messen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Probe mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader mit Anregung bei 480 nm und Emissionsdetektion bei 520 nm.

3. Messung des ATP-Gehalts in aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen

HINWEIS: Messen Sie die ATP-Menge in aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen unter Verwendung des angegebenen ATP-Nachweisreagenzes und des rekombinanten ATP (rATP)-Standards (siehe Materialtabelle).

  1. Wenn es eingefroren ist, tauen Sie das ATP-Nachweisreagenz über Nacht bei 4 °C auf.
  2. Nach der Entnahme von aus der Biopsie gewonnenen Zellsuspensionen und der Zellzählung wird eine Platte von 1,0 x 104 lebenden Zellen/Well in jede Vertiefung einer weißen 96-Well-Mikroplatte mit 100 μl RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS gegeben. Lassen Sie die erste Spalte der Mikroplatte leer, da sie am nächsten Tag zum Laden einer rATP-Standardkurve verwendet wird.
  3. Inkubieren Sie die Mikroplatte bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator über Nacht.
  4. Am nächsten Tag wird das ATP-Nachweisreagenz bei Raumtemperatur vorgewärmt.
  5. Generieren Sie die rATP-Standardkurve. Bereiten Sie 100 μl Proben des rATP-Standards vor, der seriell in PBS auf die folgenden Konzentrationen verdünnt ist: 0 nM, 0,001 nM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM.
  6. Laden Sie 50 μl jeder rATP-Standardprobe in die erste Säule der Mikrotiterplatte.
  7. Entfernen Sie das RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS aus jeder Mikrotiterplatten-Studienvertiefung mit einer Ein- oder Mehrkanalpipette.
  8. Waschen Sie jede Studie gut mit 100 μl PBS (in einem 37 °C warmen Wasserbad vorgewärmt).
  9. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 50 μl neues PBS in jede Vertiefung der Studie hinzu.
  10. Geben Sie 50 μl ATP-Nachweisreagenz sowohl in die Standard- als auch in die Studienvertiefung.
  11. Mischen, 2 Min. bei 37 °C und anschließend 10 Min. bei RT inkubieren.
  12. Lesen und Aufzeichnen der Lumineszenz in einem Mikroplatten-Reader.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Der Arbeitsablauf wurde an aus Biopsien gewonnenen Nierenzellen von gesunden 3 Monate alten männlichen Yorkshire-Schweinen getestet. Das Protokoll für die Gewebedissoziation und die Zellplattierung wurde wie oben beschrieben befolgt. Nachdem die Zellen 16 Stunden lang adhäsiert worden waren, wurden OCR und ECAR in den aus der Biopsie gewonnenen Schweinenierenzellen mit einem metabolischen Funktionsanalysator in Echtzeit als Marker für die mitochondriale Atmung bzw. Glykolyse gemessen.

Das erst...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine einzigartige Methode zur Beurteilung der Stoffwechselfunktion von Nierenzellen, die aus Biopsien gewonnen wurden. Ein Protokoll zur Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus frischen Nierenbiopsien wurde mit einer Analyse der Stoffwechselfunktion und der intrazellulären ATP-Spiegel gekoppelt. Die Glykolyse wird durch die Messung der ECAR und die mitochondriale Atmung durch die Messung der OCR bewertet. Zur Optimierung der Methodik wurden Porinnierenbiopsien ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Keiner der Co-Autoren hat konkurrierende finanzielle Interessen oder andere Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die AK wurde unterstützt von der Stiftung Universitäres Gesundheitsnetzwerk (Preise 579067450776, 579072310776 und 579068260776). SC-F wurde durch das Programm "Kidney Research Scientist Core Education and National Training" (KRESCENT) (2019KPPDF637713 und 24KNIA-1291062) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD6134Kompetitiver Inhibitor der Glykolyse
5 ml Reagenzglas aus Polystyrol
mit Zellsieb, Schnappkappe,		Falcon352235Dissoziationsröhrchen
Antimycin A aus  Streptomyces  sp.SigmaA8674Inhibitor des Komplexes III der Atmungskette
AOF BP ProteaseVitaCyte003-1000Dissoziationsenzym
Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)
phenylhydrazon (FCCP)Sigma		C2920Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung
CellTiter-Glo 2.0 Assay, 100 mLPromegaG9242Messung von intrazellulärem ATP
Kollagenase MAVitaCyte001-2030Dissoziationsenzym
CyQUANT Zellproliferationsassay für Zellen in KulturInvitrogenC7026Messung der intrazellulären
DNA D-GLUCOSE, WASSERFREI, ReagenzqualitätBioshopGLU501Stoffwechselsubstrat
DNase IStammzelle07469Dissoziationsenzym
Fötales Rinderserum, Premium,
US-Herkunft, hitzeinaktiviert, 500 mL		Wisent080-450Dissoziationsmedienzusatz
L-Glutamin-200 mM (100x) flüssig (100 mL)Gibco25030081metabolisches
Substrat Oligomycin ASigma75351Inhibitor der ATP-Synthase
PBS, -/-, 500 mLWisent311-010-CLZellwäsche
rATP,  10 mM,  0?5 mLPromegaP1132Messung von intrazellulärem ATP
RotenonSigmaR8875Inhibitor des Komplexes I der Atmungskette
RPMI 1640Gibco11875119Dissoziationsmedien
Seahorse Wave Controller Software 2.6AgilentN/AEinrichtung von Stoffwechselfunktionsmessungen
Seahorse Wave Desktop Software 2.6AgilentN/AAnalyse der Stoffwechselfunktion
Seahorse XF Basismedium  ohne Phenolrot, 500 mLAgilent103335-100Messung der Stoffwechselfunktion
Seahorse XFe96 FluxPak  (20 Platten, 18 Kartuschen,
und 500 ml kalibrierte Lösung)		Agilent102416-100Messung der Stoffwechselfunktion
Seahorse XFe96 StoffwechselfunktionsanalysatorAgilent101991-100Messung der Stoffwechselfunktion
Natriumpyruvatlösung 100 mM (100X), flüssig 100 mLGibco11360070Stoffwechselsubstrat

Referenzen

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

NierentransplantationIschämie-Reperfusionsschadenverzögerte Transplantatfunktionakutes Nierenversagenmitochondriale RespirationSauerstoffverbrauchrateGlykolyse-Bestimmungintrazelluläre ATP-Spiegel

Dieser Artikel wurde veröffentlicht

Video demnächst verfügbar

Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.