Dieses Protokoll stellt eine Locus-spezifische Chromatin-Isolierungsmethode vor, die auf ortsspezifischer Rekombination basiert, um einen interessierenden Single-Copy-Genlocus in seinem nativen Chromatinkontext aus knospender Hefe, Saccharomyces cerevisiae, zu reinigen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die grundlegende Organisationseinheit des eukaryotischen Chromatins ist das Nukleosomenkernpartikel (NCP), das aus DNA besteht, die ~1,7-mal um ein Histon-Oktamer gewickelt ist. Chromatin ist definiert als die Entität von NCPs und zahlreichen anderen Proteinkomplexen, einschließlich Transkriptionsfaktoren, Chromatin-Remodeling und modifizierenden Enzymen. Es ist noch unklar, wie diese Protein-DNA-Interaktionen auf der Ebene spezifischer genomischer Loci in verschiedenen Stadien des Zellzyklus orchestriert werden. Dies ist vor allem auf die derzeitigen technischen Einschränkungen zurückzuführen, die es schwierig machen, präzise Messungen solcher dynamischen Wechselwirkungen zu erhalten. Hier beschreiben wir eine verbesserte Methode, die ortsspezifische Rekombination mit einem effizienten einstufigen Affinitätsreinigungsprotokoll kombiniert, um einen Genlocus von Interesse in seinem nativen Chromatinzustand zu isolieren. Die Methode ermöglicht die robuste Anreicherung des Zielortes über genomisches Chromatin, was diese Technik zu einer effektiven Strategie zur unvoreingenommenen und systematischen Identifizierung und Quantifizierung von Proteininteraktionen macht, z. B. durch Massenspektrometrie. Zusätzlich zu solchen Zusammensetzungsanalysen spiegelt natives Chromatin, das mit dieser Methode gereinigt wurde, wahrscheinlich die In-vivo-Situation in Bezug auf Nukleosomenpositionierung und Histonmodifikationen wider und ist daher für weitere strukturelle und biochemische Analysen von Chromatin zugänglich, das von praktisch jedem genomischen Locus in Hefe stammt.
Einleitung
Die dynamische Organisation eukaryotischer Genome in Chromatin verdichtet die DNA, um in die Grenzen des Zellkerns zu passen, während gleichzeitig eine ausreichende Dynamik für die Genexpression und die Zugänglichkeit für regulatorische Faktoren gewährleistet wird. Diese Vielseitigkeit wird zum Teil durch das Nukleosom vermittelt, die Grundeinheit des Chromatins, das aus einem Kernpartikel mit 147 bp DNA besteht, das ~1,7-mal um das Histon-Oktamer1 gewickelt ist. Das Nukleosom ist eine hochdynamische Struktur in Bezug auf seine Zusammensetzung, mit zahlreichen Histonvarianten und posttranslationalen Modifikationen (PTMs) an den N- und C-termina....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden. In Tabelle 1 finden Sie eine Liste der verwendeten Lösungen, Puffer und Medien.
1. Rekombinanter Hefestammaufbau
- Um einen rekombinationskompetenten Hefestamm zu konstruieren, transformieren Sie das SbfI-verdaute Plasmid K238 in einen Hefestamm mit integrierten LexA-Bindungsstellen und RS-Rekombinationsstellen am interessierenden Locus13,14.
HINWEIS: Das transformierte SbfI-Restriktionsfragment ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die Aufreinigung der ~1,4 kb ARS316 Chromatindomäne wurde durch das konstitutiv exprimierte LexA-TAP Adapterprotein vermittelt. Um als Negativkontrolle zu dienen, führten wir Aufreinigungen mit einem isogenen Stamm durch, der LexA-TAP exprimiert, aber keine integrierten RS- und LexA-Bindungsstellen enthält. Abbildung 3 zeigt das Ergebnis der DNA-Analyse eines Standard-Aufreinigungsexperiments, das sowohl an der Kontrolle als auch an einem rekombinationskompetenten Stamm durchgeführt wurde, d.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Identifizierung der Faktoren und der Chromatinlandschaft einer bestimmten genomischen Zielregion stellt nach wie vor eine große Herausforderung in der Chromatinforschungdar 18. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes System zur gezielten Exzision und Reinigung bestimmter Chromatindomänen aus Hefechromosomen. Unseres Wissens nach überwinden die Reinheit und Ausbeute dieser einstufigen Aufreinigung viele der Einschränkungen von Locus-spezifischen Chromatin-Aufreinigungsmethoden, wodurch eine.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Die Arbeiten im S.H.-Labor wurden von der DFG durch SFB1064 (Projekt-ID 213249687), den Europäischen Forschungsrat (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) und die Helmholtz Gesellschaft unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Hefestämme | |||
| Kontrolle Stamm: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; his3Δ 1; met15Δ 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Abschnitt 1, siehe Referenzen 13 und 14 | ||
| Rekombination Dehnung: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; his3Δ 1; met15Δ 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Abschnitt 1, siehe Referenz 13 und 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 Plasmid | Abschnitt 1, siehe Referenz 13 Lagerung: Lagerung bei -20 &de; C | ||
| K071 Spike-in-Plasmid-DNA | Abschnitt 7.1, siehe Referenz 13 Lagerung: Lagerung bei -20 μde; C | ||
| Reagents | |||
| Aceton | Carl Roth | 5025.1 | Abschnitt 2 Lagerung: |
| Ammoniumacetat (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Abschnitt 6 und 7.1 Lagerung: Lagerung bei Raumtemperatur |
| Ammoniumlösung (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Abschnitt 6 Lagerung: Bei Raumtemperatur |
| lagern Ammoniumsulfat | Santa Cruz | Sc-29085 | Abschnitt 2 Lagerung: |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Abschnitt 3 lagern: Bei Raumtemperatur lagern |
| Bacto Pepton | BD (VWR) | 211820 | Abschnitt 3 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Abschnitt 7.2 Lagerung: Bei 4 μg lagern; C |
| Chemilumineszenz-Substrat-Kit | ThermoFisher | 34580 | Abschnitt 7.2 Lagerung: Lagerung bei 4 Grad; C |
| Di-Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat | Merck | 1.06579.1000 | Abschnitt 2 und 7.1 Lagerung: |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Abschnitt 4 Lagerung: Lagerung bei 4 μd; C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Abschnitt 7.1 Lagerung: |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur |
| lagern Galaktose (20% (w/v) Lagerbestand) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Abschnitt 3 Lagerung: Bei Raumtemperatur |
| lagern Gel Ladefarbstoff (6x) | BioLabs | B7024A | Abschnitt 7.1 Lagerung: Lagerung bei -20 Grad; C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Abschnitt Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Glycin | Carl | Roth.0079.4 | Abschnitt 2 Lagerung: |
| Glykogen (5 mg/ml) | lagernInvitrogen | AM9510 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei -20 μg lagern; C |
| Salzsäure (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Abschnitt 2, 4 und 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Magnesiumacetat (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Abschnitt 4 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Magnesiumchlorid (MgCl2 | )Sigma Aldrich | M8266 | Abschnitt 6 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Nu PAGE LDS-Probenpuffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Abschnitt 7.2 Lagerung: |
| Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1 v/v) | lagernInvitrogen | 15593-031 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Lagerung bei 4 μd; C |
| Kaliumchlorid (KCl) | Sigma | P9541 | Abschnitt 4 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Radioaktiv markiert α-32P dATP (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/ml) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Lagerung bei 4 μd; C |
| RadPrime Etikettiersystem | ThermoFisher | 18428-011 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Lagerung bei -20 Grad C |
| Raffinose (20% (w/v) Lagerbestand) | SERVA | 34140.03 | Abschnitt 3 Lagerung: Bei Raumtemperatur |
| lagern Natriumchlorid (NaCl) | Merck | K53710504142 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Natriumcitrat (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur |
| lagern Natriumhydroxid (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Natrium-n-Dodecylsulfat (SDS) (5% Stamm (w/v) ) | Alfa Aesar A11183 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern | |
| Natriumphosphat monobasisch | Sigma-Aldrich | 71496 | Abschnitt 2 und 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur |
| lagern Natrium azid | Santa Cruz Biotechnologie | sc-208393 | Abschnitt 2 Lagerung: Lagern bei -20 Grad; C |
| Triethylamin | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 und 4 Lagerung: Bei Raumtemperatur |
| lagern Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 und 4 Lagerung: Bei Raumtemperatur |
| lagern Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Abschnitt 4 Lagerung: Hefeextrakt |
| BD (VWR) | 212720 | Abschnitt 3 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern | |
| Hefe-Paarungsfaktor alpha (1 µ g/mL Lagerbestand ) | Biomol | Y2016.5 | Abschnitt 3 Lagerung: Lagerung bei -20 μg; C |
| Hefe Synthetisches Drop-out-Medium Ergänzungen ohne LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Abschnitt 1, siehe Referenz 14 |
| EnzymeHpaI-Restriktionsenzym | |||
| (5.000 U/ml) | NEB | R0105S | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei -20 μg lagern; C |
| Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Abschnitt 4 Lagerung: Lagerung bei4 &Grad; C |
| Proteinase K (10 mg/ml) | SERVA | 33756 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei -20 μg lagern; C |
| RNase A (10 mg/ml) | ThermoFisher | EN0531 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Lagerung bei -20 Grad C |
| TEV Protease (10000 U/µ L) | NEB | P8112S | Abschnitt 5 Lagerung: Bei -20 Grad lagern; C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxidaktivierte magnetische Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Abschnitt 2 Lagerung: Bei 4 Grad lagern; C |
| Trockeneis | Sektion 4 | ||
| Zentrifugenröhrchen mit geringer Bindung 2,0 mL | Eppendorf | 22431102 | Sektion 4 |
| Microspin G-25 Säulen | Cytiva | 27-5325-01 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Parafilm | Merck | P7793 | Abschnitt 4 |
| Positive Nylonmembran | Biozol | 11MEMP0001 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| PVDF-Transfermembran | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Abschnitt 7.2 Lagerung: Im Raum lagern Temperatur |
| SDS-PAGE Gel 4-12% Bis-Tris (15 Well, 1,5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Abschnitt 7.2 Lagerung: Lagerung bei 4 Grad; C |
| Spritze (25 mL) mit Luer-Anschluss | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Abschnitt 3 |
| Whatman Papier (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Abschnitt 7.1 Lagerung: Bei Raumtemperatur lagern |
| Antikörper | |||
| Anti-LexA, polyklonales IgG Kaninchen, Antikörper in der DNA-Bindungsregion | Merck Millipore | 06-719 | Abschnitt 7.2 Lagerung: Lagerung bei -20 Grad; C |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), Meerrettichperoxidase-Konjugat | Invitrogen | G21234 | Abschnitt 7.2 Lagerung: Bei -20 & deg lagern; C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) Antikörper, hergestellt in Kaninchen zum Nachweis von TAP-markierten Proteinen | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Abschnitt 7.2 Lagerung: Lagerung bei -20 &de; C |
| Kaninchen-IgG-Antikörper | Sigma | I5006-100MG | Abschnitt 2 Lagerung: Bei 4 μg lagern; C |
| Primer (10 & Mikro; M) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Abschnitt 7.1 | ||
| K071 Spike-in-Plasmid-DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Abschnitt 7.1 | ||
| PCRFragment aus genomischer Hefe-DNA als Template für ARS316-Amplifikation (für Southern Blot): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Abschnitt 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Abschnitt 7.1 | ||
| Ausrüstung | |||
| Kaffeemühle | Gastroback | 42601 | Abschnitt 4 |
| Dewarwarkolben | NAL GENE | 4150-2000 | Sektion 3 |
| DynaMag TM-2 Magnetgestell | Invitrogen | 12321D | Sektion 4, 5 und 6 |
| Hybridisierungsofen | Hybaid Mini10 | Ri418 | Sektion 2 |
| Mikrozentrifuge | Eppendorf | 5424R | Sektion 4 und 7.1 |
| UV-Vernetzer | Analytikjena | 95-0174-02 | Sektion 7.1 |
Referenzen
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
