Abgleich von synchronisierten Zeitreihendaten unter Verwendung des Modells zur Charakterisierung des Zellzyklusverlusts für experimentübergreifende Vergleiche

Summary

Eine Herausforderung bei der Analyse synchronisierter Zeitreihenexperimente besteht darin, dass sich die Experimente oft in der Dauer der Erholung von der Synchronität und der Zellzyklusperiode unterscheiden. Daher können die Messungen aus verschiedenen Experimenten nicht aggregiert analysiert oder ohne weiteres verglichen werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Ausrichtung von Experimenten, um phasenspezifische Vergleiche zu ermöglichen.

Abstract

Die Untersuchung des Zellzyklus hängt oft von der Synchronisierung von Zellpopulationen ab, um verschiedene Parameter in einer Zeitreihe zu messen, während die Zellen den Zellzyklus durchlaufen. Aber auch unter ähnlichen Bedingungen zeigen Replikationsexperimente Unterschiede in der Zeit, die benötigt wird, um sich von der Synchronität zu erholen und den Zellzyklus zu durchlaufen, wodurch direkte Vergleiche zu jedem Zeitpunkt verhindert werden. Das Problem des Vergleichs dynamischer Messungen in verschiedenen Experimenten wird in mutierten Populationen oder unter alternativen Wachstumsbedingungen, die sich auf die synchrone Erholungszeit und/oder die Zellzykluszeit auswirken, noch verschärft.

Wir haben bereits ein parametrisches mathematisches Modell mit dem Namen Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) veröffentlicht, das überwacht, wie sich synchrone Zellpopulationen aus der Synchronität lösen und den Zellzyklus durchlaufen. Die gelernten Parameter aus dem Modell können dann verwendet werden, um experimentelle Zeitpunkte aus synchronisierten Zeitreihenexperimenten in eine normalisierte Zeitskala (Lebenslinienpunkte) umzuwandeln. Anstatt die verstrichene Zeit in Minuten seit Beginn des Experiments darzustellen, stellt die Lebenslinienskala den Verlauf von der Synchronität zum Eintritt in den Zellzyklus und dann durch die Phasen des Zellzyklus dar. Da die Lebenslinienpunkte der Phase der durchschnittlichen Zelle innerhalb der synchronisierten Population entsprechen, ermöglicht diese normalisierte Zeitskala direkte Vergleiche zwischen Experimenten, einschließlich solcher mit unterschiedlichen Zeiträumen und Erholungszeiten. Darüber hinaus wurde das Modell verwendet, um Zellzyklusexperimente zwischen verschiedenen Arten (z.B. Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe) aufeinander abzustimmen, wodurch ein direkter Vergleich von Zellzyklusmessungen ermöglicht wird, die evolutionäre Ähnlichkeiten und Unterschiede aufzeigen können.

Introduction

Zeitreihenmessungen an synchronisierten Zellpopulationen auf ihrem Weg durch den Zellzyklus sind eine Standardmethode zur Untersuchung der Mechanismen, die das Fortschreiten des Zellzyklus steuern 1,2,3,4,5,6,7,8 . Die Fähigkeit, Vergleiche zwischen Synchronie-/Release-Zeitreihenexperimenten anzustellen, ist für unser Verständnis dieser dynamischen Prozesse von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung vo....

Protocol

1. Sammeln von Zellzyklusphasen- und experimentellen Daten

1. Synchronisieren Sie die Zellen in Bezug auf den Zellzyklus unter Verwendung der gewünschten Synchronisationsmethode (z. B. zentrifugale Abschlämmung, wie in Leman et al.18 beschrieben, oder Paarungspheromonarrest, wie in Rosebrock 19 beschrieben; sowohl Leman et al.18 als auch Rosebrock ¹⁹ beinhalten auch Methoden zur Freisetzung aus der Synchronität). Beginnen Sie mit der Stichprobenentnahme während der gesamten Zeitreihe, stellen Sie sicher, dass die Zeitreihe mindestens zwei volle Zellz....

Results

Die im obigen Protokoll und im Workflow in Abbildung 1 beschriebenen Schritte wurden auf fünf Zellzyklus-synchronisierte Zeitreihenexperimente angewendet, um zwei repräsentative Vergleiche zu demonstrieren: zwischen Replikaten mit unterschiedlichen Synchronitätsmethoden (Paarungspheromon und zentrifugale Elutriierung¹⁸) und Sequenzierungsplattformen (RNA-Sequenzierung [RNA-seq] und Microarray) sowie zwischen experimentellen Bedingungen. Es wurden mehrere Experimen.......

Discussion

In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, mit der Daten aus Zeitreihenexperimenten an synchronisierten Zellpopulationen genauer und quantitativ ausgewertet werden können. Die Methode verwendet erlernte Parameter von CLOCCS, einem Bayes'schen Inferenzmodell, das Eingabedaten der Zellzyklusphase, wie z. B. Knospungsdaten und durchflusszytometrische DNA-Inhaltsdaten, verwendet, um jedes Experiment zu parametrisieren^14,15. CLOCCS verwendet die eingegebenen Zell.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			für Fixierlösung. Beschrieben in Leman 2014.
4% Formaldehyd			für die Fixierlösung.
100% Ethanol			Für die Fixierung der Durchflusszytometrie. Beschrieben in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Durchflusszytometer			Für das Durchflusszytometrieprotokoll.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Mikroskop	Zum Zählen von Zellen und Knospen.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Proteaselösung			Für das Durchflusszytometrieprotokoll. Beschrieben in Haase 2002.
RNAse Eine Lösung			für das Durchflusszytometrie-Protokoll. Beschrieben in Haase 2002.
SYTOX Green Nukleinsäure-Färbung	Invitrogen	S7020	Für die Durchflusszytometrie-Färbung. Beschrieben in Haase 2002.
Tris			pH 7,5