Kartierung der zellulären Verteilung eines optogenetischen Proteins mit Hilfe eines Lichtstimulationsgitters

Summary

Dieses Protokoll beinhaltet die Transfektion von cAMP-Sensoren und bPAC-nLuc, einem optogenetischen Protein, um seine zelluläre Verteilung und Reaktion auf Lichtstimulation genau zu verfolgen. Der innovative Ansatz, eine cAMP-Antwortkarte mit Hilfe eines Punktscansystems zu erstellen, birgt das Potenzial, die Forschung mit optogenetischen Proteinen in verschiedenen Bereichen voranzutreiben.

Abstract

Unser Ziel war es, die zelluläre Verteilung eines optogenetischen Proteins genau zu verfolgen und seine Funktionalität innerhalb eines bestimmten zytoplasmatischen Ortes zu bewerten. Um dies zu erreichen, haben wir Zellen mit nukleär zielgerichteten cAMP-Sensoren und unserem im Labor entwickelten optogenetischen Protein, der bakteriellen photoaktivierbaren Adenylylcyclase-Nanoluciferase (bPAC-nLuc), co-transfiziert. bPAC-nLuc erzeugt bei Stimulation mit 445 nm Licht oder Luciferase-Substraten Adenosin-3',5'-cyclisches Monophosphat (cAMP). Wir verwendeten einen Festkörper-Laser-Illuminator, der mit einem Punktscansystem verbunden war, das es uns ermöglichte, ein Gitter-/Matrixmuster aus kleinen beleuchteten Flecken (~1^{μm 2}) im gesamten Zytoplasma von HC-1-Zellen zu erzeugen. Auf diese Weise konnten wir die Verteilung von nuklearem bPAC-nLuc effektiv verfolgen und eine umfassende cAMP-Antwortkarte erstellen. Diese Karte stellte die zelluläre Verteilung von bPAC-nLuc genau dar, und seine Reaktion auf Lichtstimulation variierte je nach Proteinmenge im beleuchteten Fleck. Dieser innovative Ansatz trägt zur Erweiterung des Instrumentariums der verfügbaren Techniken zur Untersuchung zellulärer optogenetischer Proteine bei. Die Fähigkeit, ihre Verteilung und Reaktion mit hoher Präzision abzubilden, hat weitreichendes Potenzial und könnte verschiedene Forschungsfelder voranbringen.

Introduction

Optogenetik, geboren als ein Werkzeug, das die Neurowissenschaften revolutionierte, ist heute ein wachsendes Forschungsfeld und eine aufstrebende Technologie, die routinemäßig von vielen Laboratorien weltweit und in verschiedenen Forschungsbereichen der Biologie eingesetzt wird. Wir haben bPAC-nLuc, ein vielseitiges optogenetisches Protein, entwickelt, indem wir eine lichtempfindliche Adenylylcyclase (AC) aus Beggiatoa sp. (bakterielle photoaktivierbare Adenylylcyclase; bPAC) mit Nanoluziferase (nLuc) fusioniert haben^1,2,3. Bei Stimulation mit blauem Licht produziert bPAC den zweiten Botenstoff 3',5'-cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP). nLuc ist eine kürzlich entwickelte kleine Luciferase, die in Gegenwart eines ihrer Substrate Biolumineszenz erzeugen und die cAMP-Produktion aktivieren kann⁴. Auf diese Weise kann dieses optogenetische Protein vorübergehend durch kurze Lichtimpulse oder stetig mit Furimazin oder anderen Luziferase-Substraten aktiviert werden, was es uns ermöglicht, verschiedene cAMP-Signalmuster nachzuahmen und zelluläre Reaktionen (Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, Genexpression, Zellproliferation, Migration usw.) zu bewerten. Jüngste Fortschritte in der 2^. Boten-Signalgebung haben die Bedeutung von Ereignissen unterstrichen, die in sehr begrenzten zytosolischen Regionen auftreten (z. B. die endosomale cAMP-Produktion für die Phosphorylierung des cAMP-Response-Element-bindenden Proteins (CREB) oder die^Ca-2+-Mikrodomänen für die Translokation des Kernfaktors aktivierter T-Zellen (NFAT) in den Zellkern)^5,6. Daher ist es wichtig, konsistente und systematische Strategien zu entwickeln, um die Signalübertragung aus diesen Kompartimenten in lebenden Zellen zu bewerten, nachzuahmen und zu blockieren. Um die Fähigkeit von bPAC-nLuc zu zeigen, in verschiedenen Zellkompartimenten spezifisch aktiviert zu werden, haben wir eine Hepatom-abgeleitete Zelllinie (HC-1) mit dem nuklear-zielgerichteten bPAC-nLuc und H208, einem Förster Resonance Energy Transfer (FRET) cAMP-Sensor (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). HC-1-Zellen, die aus der HTC-Linie stammen, weisen keine prüfbare AC-Aktivität auf, was zu sehr niedrigen basalen cAMP-Werten führt, was sie ideal macht, um die mutmaßliche cAMP-Produktion zu messen und gleichzeitig den vollen Dynamikbereich von FRET-Sensoren zu nutzen^7,8. Unter Verwendung eines Festkörperlasers (445 nm, LDI-7, 89 North), der mit einem Punktscansystem (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic) verbunden ist, beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Stimulation sehr kleiner kreisförmiger Bereiche oder Spots (~1 μm²) innerhalb einzelner Zellen. Das Punktscansystem wurde an einen der Backports eines Zweideckmikroskops angeschlossen, was es uns ermöglichte, Zellen zu stimulieren und FRET-Messungen gleichzeitig über einen unabhängigen Lichtweg durchzuführen. Wir stellen in diesem Protokoll ein Verfahren vor, bei dem die SysCon Geo Software, die mit dem Stimulationssystem von Rapp OptoElectronic geliefert wird, eingesetzt wird, um einen umfassenden Scan des Zytoplasmas von Zellen durchzuführen. Der Ansatz beinhaltet die Generierung einer cAMP-Antwortkarte, indem eine Sequenz von Beleuchtungen eingerichtet wird, die Zellen in einem Gittermuster stimulieren (Abbildung 1).

Protocol

1. HC-1-Zellkultur und Vorbereitung für die Bildgebung

1. HC-1-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 IE/L), Streptomycin (100 mg/L) und L-Glutamin, werden in 10-cm-Schalen aufbewahrt und bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % befeuchteter Luft inkubiert.
2. Passieren Sie die Zellen alle 2-4 Tage, sobald die Zellen ~90% konfluent sind, mit Verdünnungen von 1:5 oder 1:10
.
3. Keimzellen für die Transfektion auf Glasdeckgläsern 2 Tage vor dem Experiment.
   1. Arbeiten Sie unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube mit vorgewärmtem Medium und PBS, aspirieren Sie das Medium aus einer nahezu konfluenten Zellschale und waschen Sie es vorsichtig mit 5 ml PBS.
   2. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 1 ml Trypsin hinzu. Bei 37 °C 3-5 Minuten inkubieren, bis sich die Zellen abgelöst haben.
   3. Resuspendieren Sie die Zellen in 4 ml Medium und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
   4. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen zu zählen und die Zelldichte zu berechnen.
   5. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Dichte von 1,5 x 10⁴ Zellen/ml.
   6. 2 ml der Zellsuspension in einer 6-Well-Schale auf 25 mm Glasdeckgläser mit Poly-D-Lysin-Beschichtung pipettieren.
   7. Inkubieren Sie die Zellen ca. 24 h lang in einem Inkubator, bis 70% Konfluenz erreicht sind.
4. Transfizieren Sie die Zellen mit einem Transfektionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Verhältnis von 0,25 μg NLS-bPAC-nLuc DNA/0,75 μg NLS-H208 DNA pro 3 μl Transfektionsreagenz und 2 μl P3000 Reagenz, verdünnt in Opti-MEM-Medien ohne Phenolrot.
5. Legen Sie die Zellen für ~48 Stunden in den Inkubator, um eine ausreichende bPAC-nLuc-Expression zu ermöglichen, die für die Erzeugung nachweisbarer cAMP.
   unerlässlich ist HINWEIS: Das erforderliche Mindestniveau der bPAC-nLuc-Expression hängt von der Potenz des Stimulationssystems und den Parametern der Stimulation ab.
6. Bereiten Sie die Zellen auf Deckgläsern für die Bildgebung vor.
   1. Aspirieren Sie das Medium aus einer Vertiefung und waschen Sie es zweimal mit 2 ml PBS.
   2. Heben Sie das Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette an und legen Sie es in die Bildgebungskammer.
   3. Geben Sie 1 ml Opti-MEM ohne Phenolrot in die Bildgebungskammer. Zellen können auch in HBSS oder einer anderen physiologischen Fluoreszenz-kompatiblen Lösung abgebildet werden.

2. Lichtsimulation und Live-Zell-Imaging

1. Durchführung von Zellkulturen und Manipulationen von Zellen, die NLS-bPAC-nLuc exprimieren, in einer dunklen Umgebung. Um eine Exposition gegenüber Wellenlängen <500 nm zu vermeiden, verwenden Sie eine rote Safelight-Lampe (Materialtabelle) mit einer bernsteinfarbenen 13-W-Kompaktleuchtstofflampe (Materialtabelle).
2. Führen Sie Experimente in einem motorisierten Zweideckmikroskop (Materialtabelle) durch, das mit einer 6-Linien-Multi-LED-Light-Engine (Materialtabelle), einem Emissionsfilterrad (Materialtabelle), einem XY-Tisch (Materialtabelle), einer ORCA-Fusion Digital CMOS-Kamera (Materialtabelle) und einem 100x/1,4 NA-Ölobjektiv (∞/0,17/FN26,5) ausgestattet ist. Erfassen Sie Bilder mit einer digitalen Mikroskopiesoftware (Table of Materials). Dieser Aufbau ist in der Lage, Zellen zu stimulieren und gleichzeitig FRET-Messungen durchzuführen, indem ein unabhängiger Strahlengang verwendet wird, der mit einem dichroitischen Filter ZT458rdc versehen ist (Materialtabelle).
   HINWEIS: Jedes Aufnahme-Setup kann verwendet werden, wenn es eine gleichzeitige optogenetische Stimulation und FRET/intensiometrische Bildgebung mit einem kompatiblen Sensor ermöglicht.
3. Schalten Sie das Geosystem UGA - 42 ein. Schalten Sie das Mikroskop ein und richten Sie es mit den entsprechenden Parametern ein, um es mit dem H208 FRET-Sensor aufzunehmen. Die Erfassungskonfiguration hängt von den Expressionspegeln des FRET-Sensors ab. Die typischen Parameter sind 40 ms Simulationszeit für YFP/mScarletI, 15 % LED-Leistung und 0,5 Hz.
4. Öffnen Sie die SysCon-Software und die Bildgebungssoftware, die das Mikroskop steuert.
5. Wählen Sie im Kamerafenster die Registerkarte Kalibrierung aus, und wählen Sie die Laserwellenlänge aus, die mit dem optogenetischen Protein kompatibel ist. Um bPAC-nLuc zu stimulieren, verwenden Sie eine Wellenlänge von 445 nm.
6. Kalibrieren Sie das System vor jedem Gebrauch. Dies ist wichtig, da kleine Variationen in der Einrichtung oder sogar Änderungen der Raumtemperatur (RT) die Präzision der Stimulation verändern können.
7. Wählen Sie im Kamerafenster die Registerkarte Kamera und klicken Sie auf um die Erfassung über die Imagining-Software zu starten.
8. Visualisieren Sie im Bildbetrachter-Fenster eine Live- oder vorherige Erfassung der Fluoreszenz der Zellen, die von der Bildgebungssoftware entnommen wurde und die Positionierung der Stimulationsobjekte leitet.
9. Verwenden Sie den Modus "Klicken und Feuer", um die Reaktionsfähigkeit einer einzelnen Zelle schnell zu bewerten, bevor Sie das Experiment starten.
10. Wählen Sie im Sequenz-Manager-Fenster aus, um eine neue Sequenz zu erstellen.
    HINWEIS: Um die korrekte Systemkalibrierung zu überprüfen, zeichnen Sie verschiedene Formen und Größen im Bildbetrachter-Fenster. Diese sollten genau den Stimulationsmustern entsprechen, die auf die Zellen projiziert werden, um eine genaue Ausrichtung auf das beabsichtigte Design zu gewährleisten.
11. Wählen Sie im Bildbetrachter-Fenster das Symbol "Rund" in der Symbolleiste auf der linken Seite aus, um kreisförmige Stimulationsobjekte zu zeichnen.
12. Erstellen Sie mehrere kleine identische Kreise und verteilen Sie diese gleichmäßig, um eine homogene Abdeckung des gesamten Zytoplasmas der zu stimulierenden Zellen zu gewährleisten.
13. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jedes einzelne, um die Homogenität der zirkulären Stimulationsobjekte zu überprüfen. Ein Fenster wird angezeigt. Verwenden Sie es, um ihren Radius, ihre Position usw. zu untersuchen.
14. Legen Sie den Radius zwischen 1 und 5 fest, abhängig vom verwendeten Ziel und der Größe der Zelle.
15. Um den gleichmäßigen Abstand und die Ausrichtung der Kreise zu verbessern, verwenden Sie die Schaltfläche im Unterfenster Ansicht. Legen Sie außerdem die Eigenschaften des Rasters mit der Schaltfläche fest.
16. Stellen Sie sicher, dass das Gitter oder die Matrix aus gleichmäßig verteilten zirkulären Stimulationsobjekten die Zelle vollständig bedeckt und ihre Größe (z. B. 6 x 6 oder 10 x 10) durch die Größe der Zelle bestimmt wird. Als Kontrolle für die Nullstimulation, die keine zellulären Ereignisse auslösen sollte, schließen Sie einige Kreise ein, die außerhalb der Zelle positioniert sind.
17. Jedes Objekt, das im Image Viewer-Fenster erstellt wird, wird im Timeline-Fenster angezeigt.
    1. Konfigurieren Sie im Unterfenster Objekt-Timing die zeitlichen Eigenschaften jedes Stimulationsobjekts (Startzeit, Dauer, Verzögerung).
    2. Konfigurieren Sie im Unterfenster "Lichtquelle" die Wellenlänge und Intensität der einzelnen Objekte. Stellen Sie für dieses Protokoll sicher, dass jedes Objekt die gleiche Wellenlänge verwendet und in Dauer und Intensität identisch ist. Die Startzeit ist für jedes Objekt unterschiedlich, und die Verzögerung zwischen ihnen kann je nach erwartetem Ergebnis variiert werden, um eine Überlagerung der Wirkung verschiedener Stimulationen zu vermeiden.
18. Ändern Sie im Zeitleistenfenster bei Bedarf die Reihenfolge, in der die einzelnen Stimulationsobjekte aktiviert werden. Konfigurieren Sie die Stimulationen in einem regelmäßigen Muster (z. B. von links nach rechts, von oben nach unten) oder in einem zufälligen Muster, je nach Experiment.
19. Laden Sie die Sequenz in das System hoch und konfigurieren Sie die Anzahl der Sequenzzyklen (Durchläufe), die das System ausführen soll.
20. Platzieren Sie die Regions of Interest (ROIs) in der Imaging-Software an den gewünschten Positionen.
21. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Fluoreszenzbildern mit dem Mikroskop und drücken Sie am UGA-42-Fenster.

3. Datenanalyse

1. Die vom Stimulationssystem bereitgestellte Software ermöglicht zwar das Speichern von Sequenzen für die weitere Verwendung, zeichnet jedoch nicht die eigentlichen Versuchsinformationen auf. Dokumentieren Sie daher akribisch alle Details zu den während des Experiments verwendeten Stimulationsspots und -sequenzen, einschließlich Parametern wie Position, Intensität, Dauer, Anzahl der Durchläufe usw. Dokumentieren Sie alle anderen relevanten Versuchsbedingungen, wie z. B. pharmakologische Wirkstoffe oder spezifische Lösungen.
2. Positionieren Sie während des Experiments die festgelegten ROIs an der Bildgebungssoftware, um Änderungen der Fluoreszenzintensität von der gesamten Zelle oder von bestimmten Stellen innerhalb der Zellen zu erfassen.
3. Achten Sie besonders auf die Positionierung der ROIs relativ zu den Stimulationspunkten. Messen Sie die Änderungen der Fluoreszenzintensität entweder innerhalb oder weit von den stimulierten Bereichen entfernt. Passen Sie die Positionen der ROIs nach dem Experiment an, indem Sie die Bildgebungssoftware bereitstellen, die das Speichern von Bildern ermöglicht, die während des Experiments aufgenommen wurden, und nicht nur die ROI-Intensitätswerte.

Results

Die in Abbildung 1 vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass nur Stimulationen, die auf den Zellkern gerichtet waren, messbare cAMP-Erhöhungen erzeugen konnten. Dies bestätigt, dass NLS-bPAC-nLuc ausschließlich im Kernkompartiment von HC-1-Zellen exprimiert wird. Es ist möglich, ein optogenetisches Protein anhand dieses Gitter-/Matrixmusters präzise zu stimulieren, um seine intrazelluläre Verteilung zu kartieren. Zusätzlich spiegeln die höheren cAMP-Höhen zum Kernzentrum hin die höhere Masse von bPAC-nLuc wider, die von zentralen Spots simuliert wird, verglichen mit denen, die an der nuklearen Peripherie platziert sind (Abbildung 1).

Abbildung 1: Das Gitterstimulationsprotokoll und die cAMP-Antwortkarte. Sequentielle Blaulichtstimulationen (445 nm; 30 s Intervall zwischen den Pulsen; Pulsfolge: 50 ms, 500 ms Gesamtdauer, 10 Hz, 7% Laserleistung) an HC-1-Zellen, transfiziert mit NLS-H208 (cAMP-Sensor) und NLS-bPAC-nLuc. Im linken Bereich wird die Fluoreszenz des gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) des H208 angezeigt, die mit den tatsächlichen Lichtpulsen überlagert wurde, die von der sCMOS-Kamera in einem einzigen Bild dargestellt wurden. Die Spuren auf der rechten Seite zeigen vorübergehende cAMP-Erhöhungen, die durch NLS-bPAC-nLuc-Stimulation an jedem Stimulationspunkt ausgelöst wurden. Die hintergrundsubtrahierte NLS-H208-Fluoreszenz wurde mit einem einzigen ROI gemessen, der den gesamten Zellkern abdeckte, und es wurden normalisierte Verhältnisse (R/R0) berechnet. Die Antworten in den äußeren Bereichen (Zeilen 1 und 7, Spalten A und G) waren negativ und werden nicht dargestellt. Riegel = 3 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Das Ziel dieser Studie war es, die intrazelluläre Verteilung eines optogenetischen Proteins genau zu überwachen und seine Leistung innerhalb eines bestimmten zytoplasmatischen Kompartiments zu bewerten. Wir zeigten auch die präzisen Stimulationsfähigkeiten eines Punktscansystems an Zellen, die ein optogenetisches Protein exprimieren. Um dies zu erreichen, verwendeten wir ein nuklear-zielgerichtetes bPAC-nLuc mit hohen Expressionsniveaus, aber einer sehr begrenzten Verteilung, die auf den Zellkern beschränkt war. Die Ergebnisse zeigten, dass Stimulationspunkte, die nur ~1 μm voneinander entfernt sind, die cAMP-Produktion auslösen können oder nicht, abhängig von der zellulären Verteilung des optogenetischen Proteins; Nur Stimulationen, die auf den Zellkern gerichtet waren, konnten den cAMP-Spiegel erhöhen. In diesem Protokoll bestand das Ziel nicht darin, lokalisierte cAMP-Erhebungen zu erzeugen, sondern vielmehr zu zeigen, dass kurze Lichtstimulationen genau genug sein können, um optogenetische Proteine in sehr begrenzten Bereichen der Zelle zu aktivieren, ohne die umgebenden Proteine zu stimulieren. Dieser Ansatz stellt jedoch eine notwendige Kontrolle für die Untersuchung anderer optogenetischer Proteine mit diffusen Verteilungen und/oder die Erzeugung lokalisierter cAMP-Erhebungen dar. Dies kann erreicht werden, indem die Expressionsniveaus des optogenetischen Proteins, die Intensität und Häufigkeit der Stimulation usw. variiert werden. Um diese lokalisierten Signale genau zu messen, ist eine sorgfältige Berücksichtigung der Erfassungsparameter und Sensoreigenschaften von entscheidender Bedeutung. Dazu gehören die Auswahl geeigneter ROI-Positionen und -Größen, die Bestimmung der Erfassungsfrequenz und die Auswahl von FRET-/intensitätometrischen Sensoren mit optimaler Affinität, Intensität, Dynamikbereich und Dissoziationskonstante.

In einem kürzlich veröffentlichten Artikel haben wir eine ähnliche Strategie verwendet, um die Verteilung eines nuklear gerichteten bPAC-nLuc und die Fähigkeit einer modifizierten Phosphodiesterase (PDE; ΔRI-PDE8) zur Aufhebung von cAMP-Erhöhungen in einer von der Schilddrüse abgeleiteten Zelllinie funktionell zu demonstrieren⁹. In diesem Artikel haben wir die Zellstimulation entlang einer geraden Linie anstelle eines Gitters durchgeführt, und die Beleuchtungspunkte wurden relativ zu zellulären Orientierungspunkten (z. B. Kernzentrum, Kernrand usw.) und nicht in einem systematischen Muster platziert. Bemerkenswerterweise reichten selbst Stimulationen, die auf den Kernrand gerichtet waren, nicht aus, um eine nachweisbare cAMP-Reaktion auszulösen. Wir vermuteten, dass dies wahrscheinlich auf die Stimulation einer unzureichenden Masse von NLS-bPAC-nLuc⁹ zurückzuführen ist. Im vorliegenden Protokoll führten jedoch einige Stimulationen, die in die Nähe des Kernrandes gerichtet waren, zu einem nachweisbaren cAMP-Anstieg. Diese Diskrepanz könnte auf verschiedene Faktoren zurückgeführt werden, darunter die Expressionsniveaus des bPAC-nLuc, die Eigenschaften der Stimulation, die Morphologie des Zellkerns, das Vorhandensein von endogenen PDEs, Pufferproteinen usw.

Während andere zielgerichtete oder nicht zielgerichtete optogenetische Proteine diffusere Verteilungen aufweisen können, unterstützt dieser systematische Ansatz das Ziehen aussagekräftiger Schlussfolgerungen durch sorgfältiges Einrichten von Experimenten und Analysieren der Daten. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz das Targeting spezialisierter zellulärer Strukturen (z. B. Lamellipodien, Dendriten, primäre Zilien usw.), was einen Vergleich zwischen Reaktionen in den distalen und proximalen Regionen dieser Strukturen und/oder des Zellkörpers ermöglicht.

Diese Strategie kann auch verwendet werden, um die Aktivierung von nachgeschalteten Elementen im cAMP-Signalweg zu bewerten, wie z. B. die Proteinkinase A (PKA) oder das direkt durch cAMP aktivierte Austauschprotein (EPAC1). Da bPAC-nLuc nicht von denselben Modulatoren beeinflusst wird wie endogene ACs, die durch lokale Wechselwirkungen mit Proteinen oder anderen Faktoren beeinflusst werden können, kann davon ausgegangen werden, dass bei gleichem Expressionsniveau konsistent die gleiche Menge an cAMP erzeugt wird. Durch die Untersuchung der Reduktion von cAMP-Erhebungen oder der Abnahme der cAMP-Spiegel nach einem vorübergehenden Anstieg ermöglicht dieser Ansatz die Bewertung des cAMP-Abbaus, der Diffusion oder der Funktionalität und Verteilung endogener oder transfizierter PDEs. Diese Strategie erweist sich als besonders nützlich für die Beurteilung des Verhaltens eines optogenetischen Proteins an verschiedenen zellulären Stellen und hilft, die Verzerrung durch willkürliche Platzierung von Stimulationspunkten im Zytoplasma zu vermeiden.

Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass die Größe des Stimulationspunkts und seine Energie letztendlich von den besonderen Eigenschaften des verwendeten Setups (Lichtwege, Objektive, Scansystem usw.) abhängen. Um genaue Ergebnisse zu gewährleisten, sollten bei jedem Experiment in jedem einzelnen System die relative Expression des optogenetischen Proteins, die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber der verwendeten Wellenlänge und alle anderen Parameter berücksichtigt werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass wir nicht das volle Ausmaß untersucht haben, in dem das System bei der Implementierung kleinerer Stimulationspunkte und/oder dichterer Gitter (d.h. weniger verteilter Stimulationspunkte) eingesetzt werden kann, um kleinere zelluläre Strukturen systematisch und mit erhöhter Präzision zu bewerten. Darüber hinaus haben wir diese Strategie nur mit dem UGA-42 Geo-Punktscansystem getestet. Dieser Ansatz kann mit verschiedenen Systemen möglich sein, vorausgesetzt, sie können reproduzierbar gleichmäßig verteilte lokalisierte Spots erzeugen. Jedes System sollte optimiert werden, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen.

Schließlich sollte die potentielle Stimulation von FRET-Sensoren durch das Stimulationssystem sorgfältig bewertet werden. Zum Beispiel wird das cyanfarbene fluoreszierende Protein (CFP) durch den in diesem Protokoll verwendeten 445-nm-Laser sicherlich stimuliert oder sogar gebleicht. Die Verwendung höherer Laserstärken (oder Filter mit höherer Durchlässigkeit für die Neutraldichte (ND)) erhöht die Chancen, die Fluoreszenzsensoren zu stimulieren und falsche Informationen in das Experiment einzuführen und/oder Probleme bei der Datenanalyse zu verursachen. Auch das normale Photobleaching der FRET/intensiometrischen Sensoren sollte sorgfältig evaluiert werden. Da bPAC empfindlich auf Umgebungslicht reagieren und auch unter dunklen Bedingungen cAMP erzeugen kann (die Dunkelaktivität von bPAC wurde mit 33 ± 5 pmol/min/mg Protein³ gemessen), sollten die Zellen nach der Transfizierung von bPAC-nLUC sorgfältig manipuliert werden, um eine Lichtkontamination zu vermeiden (z. B. im Inkubator, vor und/oder während der Experimente usw.). Optional können Zellen mit einem PDE-Hemmer (z. B. 3-Isobutyl-1-methylxanthin; IBMX¹⁰), um die Ausgangsaktivität von bPAC-nLuc zu bestimmen und zu bestätigen, dass die verwendeten Lichtverhältnisse angemessen dunkel sind.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
13 W Amber Kompaktleuchtstofflampe - Low Blue Lights	Photonische Entwicklungen
3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)	Sigma	I7018
6-zeiliges Multi-LED-Lumencor Spectra X	Lumencor		6-zeilige Multi-LED-Light-Engine
Corning - DMEM	Thermo Fischer	MT10013CMEA
Corning - Normales fötales Rinderserum	Thermo Fischer	MT35011CV
Deckbrille: Kreise	Thermo Fischer	12545102P
GBX-2 dunkelrot Safelight Filter 5,5"	Kodak	1416827	Rote Safelight-Lampe
Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) 10x	Thermo Fischer	14185052	Verdünnt auf 1x, angepasster pH
LDI-7	89 North
L-Glutamin	Thermo Fischer	BW17605E
Lipofectamine 3000	Thermo Fischer	L3000001	Transfektions-Kit
Olympus IX83 motorisiert  mit zwei Decks  Mikroskop	Olympus		Motorisiertes Zweideck-Mikroskop
Opti-MEM, ohne Phenolrot	Thermo Fischer	11058021
ORCA-Fusion digitale CMOS-Kamera	Hamamatsu	C14440-20UP
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo Fischer	15140122
Phosphat gepufferte Lösung (1x)	Lonza	17516F
Prior Emission Filterrad und Filtersätze	Prior Scientific, Inc.		Rad des Emissionsfilters
Vorher  Proscan XY-Stufe	Prior Scientific, Inc.		XY-Tisch
Diabook 6	Intelligent Imaging Innovations		Digitale Mikroskopie-Software
SysCon-Software	SysCon-Software		Software, die vom Stimulationssystem bereitgestellt wird
UGA-42  Geo	Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100x	Olympus		100x/1.4 NA Ölobjektiv (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc dichroit	Chroma Technology Corp		BS, Wellenlänge (CWL):  498 nm