Dieses Protokoll beinhaltet die Transfektion von cAMP-Sensoren und bPAC-nLuc, einem optogenetischen Protein, um seine zelluläre Verteilung und Reaktion auf Lichtstimulation genau zu verfolgen. Der innovative Ansatz, eine cAMP-Antwortkarte mit Hilfe eines Punktscansystems zu erstellen, birgt das Potenzial, die Forschung mit optogenetischen Proteinen in verschiedenen Bereichen voranzutreiben.
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Methodenartikel
Kartierung der zellulären Verteilung eines optogenetischen Proteins mit Hilfe eines Lichtstimulationsgitters
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Unser Ziel war es, die zelluläre Verteilung eines optogenetischen Proteins genau zu verfolgen und seine Funktionalität innerhalb eines bestimmten zytoplasmatischen Ortes zu bewerten. Um dies zu erreichen, haben wir Zellen mit nukleär zielgerichteten cAMP-Sensoren und unserem im Labor entwickelten optogenetischen Protein, der bakteriellen photoaktivierbaren Adenylylcyclase-Nanoluciferase (bPAC-nLuc), co-transfiziert. bPAC-nLuc erzeugt bei Stimulation mit 445 nm Licht oder Luciferase-Substraten Adenosin-3',5'-cyclisches Monophosphat (cAMP). Wir verwendeten einen Festkörper-Laser-Illuminator, der mit einem Punktscansystem verbunden war, das es uns ermöglichte, ein Gitter-/Matrixmuster aus kleinen beleuchteten Flecken (~1μm 2) im gesamten Zytoplasma von HC-1-Zellen zu erzeugen. Auf diese Weise konnten wir die Verteilung von nuklearem bPAC-nLuc effektiv verfolgen und eine umfassende cAMP-Antwortkarte erstellen. Diese Karte stellte die zelluläre Verteilung von bPAC-nLuc genau dar, und seine Reaktion auf Lichtstimulation variierte je nach Proteinmenge im beleuchteten Fleck. Dieser innovative Ansatz trägt zur Erweiterung des Instrumentariums der verfügbaren Techniken zur Untersuchung zellulärer optogenetischer Proteine bei. Die Fähigkeit, ihre Verteilung und Reaktion mit hoher Präzision abzubilden, hat weitreichendes Potenzial und könnte verschiedene Forschungsfelder voranbringen.
Einleitung
Optogenetik, geboren als ein Werkzeug, das die Neurowissenschaften revolutionierte, ist heute ein wachsendes Forschungsfeld und eine aufstrebende Technologie, die routinemäßig von vielen Laboratorien weltweit und in verschiedenen Forschungsbereichen der Biologie eingesetzt wird. Wir haben bPAC-nLuc, ein vielseitiges optogenetisches Protein, entwickelt, indem wir eine lichtempfindliche Adenylylcyclase (AC) aus Beggiatoa sp. (bakterielle photoaktivierbare Adenylylcyclase; bPAC) mit Nanoluziferase (nLuc) fusioniert haben1,2,3. Bei Stimulation mit blauem Licht produziert bPAC den zweiten Botenstoff 3',5'-cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP). nLuc ist eine kürzlich entwickelte kleine Luciferase, die in Gegenwart eines ihrer Substrate Biolumineszenz erzeugen und die cAMP-Produktion aktivieren kann4. Auf diese Weise kann dieses optogenetische Protein vorübergehend durch kurze Lichtimpulse oder stetig mit Furimazin oder anderen Luziferase-Substraten aktiviert werden, was es uns ermöglicht, verschiedene cAMP-Signalmuster nachzuahmen und zelluläre Reaktionen (Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, Genexpression, Zellproliferation, Migration usw.) zu bewerten. Jüngste Fortschritte in der 2. Boten-Signalgebung haben die Bedeutung von Ereignissen unterstrichen, die in sehr begrenzten zytosolischen Regionen auftreten (z. B. die endosomale cAMP-Produktion für die Phosphorylierung des cAMP-Response-Element-bindenden Proteins (CREB) oder dieCa-2+-Mikrodomänen für die Translokation des Kernfaktors aktivierter T-Zellen (NFAT) in den Zellkern)5,6. Daher ist es wichtig, konsistente und systematische Strategien zu entwickeln, um die Signalübertragung aus diesen Kompartimenten in lebenden Zellen zu bewerten, nachzuahmen und zu blockieren. Um die Fähigkeit von bPAC-nLuc zu zeigen, in verschiedenen Zellkompartimenten spezifisch aktiviert zu werden, haben wir eine Hepatom-abgeleitete Zelllinie (HC-1) mit dem nuklear-zielgerichteten bPAC-nLuc und H208, einem Förster Resonance Energy Transfer (FRET) cAMP-Sensor (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). HC-1-Zellen, die aus der HTC-Linie stammen, weisen keine prüfbare AC-Aktivität auf, was zu sehr niedrigen basalen cAMP-Werten führt, was sie ideal macht, um die mutmaßliche cAMP-Produktion zu messen und gleichzeitig den vollen Dynamikbereich von FRET-Sensoren zu nutzen7,8. Unter Verwendung eines Festkörperlasers (445 nm, LDI-7, 89 North), der mit einem Punktscansystem (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic) verbunden ist, beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Stimulation sehr kleiner kreisförmiger Bereiche oder Spots (~1 μm2) innerhalb einzelner Zellen. Das Punktscansystem wurde an einen der Backports eines Zweideckmikroskops angeschlossen, was es uns ermöglichte, Zellen zu stimulieren und FRET-Messungen gleichzeitig über einen unabhängigen Lichtweg durchzuführen. Wir stellen in diesem Protokoll ein Verfahren vor, bei dem die SysCon Geo Software, die mit dem Stimulationssystem von Rapp OptoElectronic geliefert wird, eingesetzt wird, um einen umfassenden Scan des Zytoplasmas von Zellen durchzuführen. Der Ansatz beinhaltet die Generierung einer cAMP-Antwortkarte, indem eine Sequenz von Beleuchtungen eingerichtet wird, die Zellen in einem Gittermuster stimulieren (Abbildung 1).
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Protokoll
1. HC-1-Zellkultur und Vorbereitung für die Bildgebung
- HC-1-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 IE/L), Streptomycin (100 mg/L) und L-Glutamin, werden in 10-cm-Schalen aufbewahrt und bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % befeuchteter Luft inkubiert.
- Passieren Sie die Zellen alle 2-4 Tage, sobald die Zellen ~90% konfluent sind, mit Verdünnungen von 1:5 oder 1:10 .
- Keimzellen für die Transfektion auf Glasdeckgläsern 2 Tage vor dem Experiment.
- Arbeiten Sie unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube mit vorgewärmtem Medium und PBS, aspirieren Sie das Medium aus einer nahezu konfluenten Zellschale und waschen Sie es vorsichtig mit 5 ml PBS.
- Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 1 ml Trypsin hinzu. Bei 37 °C 3-5 Minuten inkubieren, bis sich die Zellen abgelöst haben.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 4 ml Medium und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen zu zählen und die Zelldichte zu berechnen.
- Verdünnen Sie die Zellen auf eine Dichte von 1,5 x 104 Zellen/ml.
- 2 ml der Zellsuspension in einer 6-Well-Schale auf 25 mm Glasdeckgläser mit Poly-D-Lysin-Beschichtung pipettieren.
- Inkubieren Sie die Zellen ca. 24 h lang in einem Inkubator, bis 70% Konfluenz erreicht sind.
- Transfizieren Sie die Zellen mit einem Transfektionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Verhältnis von 0,25 μg NLS-bPAC-nLuc DNA/0,75 μg NLS-H208 DNA pro 3 μl Transfektionsreagenz und 2 μl P3000 Reagenz, verdünnt in Opti-MEM-Medien ohne Phenolrot.
- Legen Sie die Zellen für ~48 Stunden in den Inkubator, um eine ausreichende bPAC-nLuc-Expression zu ermöglichen, die für die Erzeugung nachweisbarer cAMP.
unerlässlich ist HINWEIS: Das erforderliche Mindestniveau der bPAC-nLuc-Expression hängt von der Potenz des Stimulationssystems und den Parametern der Stimulation ab. - Bereiten Sie die Zellen auf Deckgläsern für die Bildgebung vor.
- Aspirieren Sie das Medium aus einer Vertiefung und waschen Sie es zweimal mit 2 ml PBS.
- Heben Sie das Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette an und legen Sie es in die Bildgebungskammer.
- Geben Sie 1 ml Opti-MEM ohne Phenolrot in die Bildgebungskammer. Zellen können auch in HBSS oder einer anderen physiologischen Fluoreszenz-kompatiblen Lösung abgebildet werden.
2. Lichtsimulation und Live-Zell-Imaging
- Durchführung von Zellkulturen und Manipulationen von Zellen, die NLS-bPAC-nLuc exprimieren, in einer dunklen Umgebung. Um eine Exposition gegenüber Wellenlängen <500 nm zu vermeiden, verwenden Sie eine rote Safelight-Lampe (Materialtabelle) mit einer bernsteinfarbenen 13-W-Kompaktleuchtstofflampe (Materialtabelle).
- Führen Sie Experimente in einem motorisierten Zweideckmikroskop (Materialtabelle) durch, das mit einer 6-Linien-Multi-LED-Light-Engine (Materialtabelle), einem Emissionsfilterrad (Materialtabelle), einem XY-Tisch (Materialtabelle), einer ORCA-Fusion Digital CMOS-Kamera (Materialtabelle) und einem 100x/1,4 NA-Ölobjektiv (∞/0,17/FN26,5) ausgestattet ist. Erfassen Sie Bilder mit einer digitalen Mikroskopiesoftware (Table of Materials). Dieser Aufbau ist in der Lage, Zellen zu stimulieren und gleichzeitig FRET-Messungen durchzuführen, indem ein unabhängiger Strahlengang verwendet wird, der mit einem dichroitischen Filter ZT458rdc versehen ist (Materialtabelle).
HINWEIS: Jedes Aufnahme-Setup kann verwendet werden, wenn es eine gleichzeitige optogenetische Stimulation und FRET/intensiometrische Bildgebung mit einem kompatiblen Sensor ermöglicht. - Schalten Sie das Geosystem UGA - 42 ein. Schalten Sie das Mikroskop ein und richten Sie es mit den entsprechenden Parametern ein, um es mit dem H208 FRET-Sensor aufzunehmen. Die Erfassungskonfiguration hängt von den Expressionspegeln des FRET-Sensors ab. Die typischen Parameter sind 40 ms Simulationszeit für YFP/mScarletI, 15 % LED-Leistung und 0,5 Hz.
- Öffnen Sie die SysCon-Software und die Bildgebungssoftware, die das Mikroskop steuert.
- Wählen Sie im Kamerafenster die Registerkarte Kalibrierung aus, und wählen Sie die Laserwellenlänge aus, die mit dem optogenetischen Protein kompatibel ist. Um bPAC-nLuc zu stimulieren, verwenden Sie eine Wellenlänge von 445 nm.
- Kalibrieren Sie das System vor jedem Gebrauch. Dies ist wichtig, da kleine Variationen in der Einrichtung oder sogar Änderungen der Raumtemperatur (RT) die Präzision der Stimulation verändern können.
- Wählen Sie im Kamerafenster die Registerkarte Kamera und klicken Sie auf um die Erfassung über die Imagining-Software zu starten.
- Visualisieren Sie im Bildbetrachter-Fenster eine Live- oder vorherige Erfassung der Fluoreszenz der Zellen, die von der Bildgebungssoftware entnommen wurde und die Positionierung der Stimulationsobjekte leitet.
- Verwenden Sie den Modus "Klicken und Feuer", um die Reaktionsfähigkeit einer einzelnen Zelle schnell zu bewerten, bevor Sie das Experiment starten.
- Wählen Sie im Sequenz-Manager-Fenster aus, um eine neue Sequenz zu erstellen.
HINWEIS: Um die korrekte Systemkalibrierung zu überprüfen, zeichnen Sie verschiedene Formen und Größen im Bildbetrachter-Fenster. Diese sollten genau den Stimulationsmustern entsprechen, die auf die Zellen projiziert werden, um eine genaue Ausrichtung auf das beabsichtigte Design zu gewährleisten. - Wählen Sie im Bildbetrachter-Fenster das Symbol "Rund" in der Symbolleiste auf der linken Seite aus, um kreisförmige Stimulationsobjekte zu zeichnen.
- Erstellen Sie mehrere kleine identische Kreise und verteilen Sie diese gleichmäßig, um eine homogene Abdeckung des gesamten Zytoplasmas der zu stimulierenden Zellen zu gewährleisten.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jedes einzelne, um die Homogenität der zirkulären Stimulationsobjekte zu überprüfen. Ein Fenster wird angezeigt. Verwenden Sie es, um ihren Radius, ihre Position usw. zu untersuchen.
- Legen Sie den Radius zwischen 1 und 5 fest, abhängig vom verwendeten Ziel und der Größe der Zelle.
- Um den gleichmäßigen Abstand und die Ausrichtung der Kreise zu verbessern, verwenden Sie die Schaltfläche im Unterfenster Ansicht. Legen Sie außerdem die Eigenschaften des Rasters mit der Schaltfläche fest.
- Stellen Sie sicher, dass das Gitter oder die Matrix aus gleichmäßig verteilten zirkulären Stimulationsobjekten die Zelle vollständig bedeckt und ihre Größe (z. B. 6 x 6 oder 10 x 10) durch die Größe der Zelle bestimmt wird. Als Kontrolle für die Nullstimulation, die keine zellulären Ereignisse auslösen sollte, schließen Sie einige Kreise ein, die außerhalb der Zelle positioniert sind.
- Jedes Objekt, das im Image Viewer-Fenster erstellt wird, wird im Timeline-Fenster angezeigt.
- Konfigurieren Sie im Unterfenster Objekt-Timing die zeitlichen Eigenschaften jedes Stimulationsobjekts (Startzeit, Dauer, Verzögerung).
- Konfigurieren Sie im Unterfenster "Lichtquelle" die Wellenlänge und Intensität der einzelnen Objekte. Stellen Sie für dieses Protokoll sicher, dass jedes Objekt die gleiche Wellenlänge verwendet und in Dauer und Intensität identisch ist. Die Startzeit ist für jedes Objekt unterschiedlich, und die Verzögerung zwischen ihnen kann je nach erwartetem Ergebnis variiert werden, um eine Überlagerung der Wirkung verschiedener Stimulationen zu vermeiden.
- Ändern Sie im Zeitleistenfenster bei Bedarf die Reihenfolge, in der die einzelnen Stimulationsobjekte aktiviert werden. Konfigurieren Sie die Stimulationen in einem regelmäßigen Muster (z. B. von links nach rechts, von oben nach unten) oder in einem zufälligen Muster, je nach Experiment.
- Laden Sie die Sequenz in das System hoch und konfigurieren Sie die Anzahl der Sequenzzyklen (Durchläufe), die das System ausführen soll.
- Platzieren Sie die Regions of Interest (ROIs) in der Imaging-Software an den gewünschten Positionen.
- Beginnen Sie mit der Aufnahme von Fluoreszenzbildern mit dem Mikroskop und drücken Sie am UGA-42-Fenster.
3. Datenanalyse
- Die vom Stimulationssystem bereitgestellte Software ermöglicht zwar das Speichern von Sequenzen für die weitere Verwendung, zeichnet jedoch nicht die eigentlichen Versuchsinformationen auf. Dokumentieren Sie daher akribisch alle Details zu den während des Experiments verwendeten Stimulationsspots und -sequenzen, einschließlich Parametern wie Position, Intensität, Dauer, Anzahl der Durchläufe usw. Dokumentieren Sie alle anderen relevanten Versuchsbedingungen, wie z. B. pharmakologische Wirkstoffe oder spezifische Lösungen.
- Positionieren Sie während des Experiments die festgelegten ROIs an der Bildgebungssoftware, um Änderungen der Fluoreszenzintensität von der gesamten Zelle oder von bestimmten Stellen innerhalb der Zellen zu erfassen.
- Achten Sie besonders auf die Positionierung der ROIs relativ zu den Stimulationspunkten. Messen Sie die Änderungen der Fluoreszenzintensität entweder innerhalb oder weit von den stimulierten Bereichen entfernt. Passen Sie die Positionen der ROIs nach dem Experiment an, indem Sie die Bildgebungssoftware bereitstellen, die das Speichern von Bildern ermöglicht, die während des Experiments aufgenommen wurden, und nicht nur die ROI-Intensitätswerte.
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Ergebnisse
Die in Abbildung 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass nur Stimulationen, die auf den Zellkern gerichtet waren, messbare Anstiege des cAMP-Spiegels hervorrufen konnten. Dies bestätigt, dass NLS-bPAC-nLuc ausschließlich im nukleären Kompartiment von HC-1-Zellen exprimiert wird. Mithilfe dieses Raster-/Matrixmusters lässt sich ein optogenetisches Protein gezielt stimulieren, um dessen intrazelluläre Verteilung abzubilden. Zudem spiegeln die stärkeren cAMP-Ans...
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Diskussion
Das Ziel dieser Studie war es, die intrazelluläre Verteilung eines optogenetischen Proteins genau zu überwachen und seine Leistung innerhalb eines bestimmten zytoplasmatischen Kompartiments zu bewerten. Wir zeigten auch die präzisen Stimulationsfähigkeiten eines Punktscansystems an Zellen, die ein optogenetisches Protein exprimieren. Um dies zu erreichen, verwendeten wir ein nuklear-zielgerichtetes bPAC-nLuc mit hohen Expressionsniveaus, aber einer sehr begrenzten Verteilung, die auf den Zellkern beschränkt war. Die Erge...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Danksagungen
Die Finanzierung wurde von den National Institutes of Health (NIH) zur Verfügung gestellt, gewährt R01 GM099775 und GM130612 an D.L.A.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 13 W Amber Kompaktleuchtstofflampe - Low Blue Lights | Photonische Entwicklungen | ||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| 6-zeiliges Multi-LED-Lumencor Spectra X | Lumencor | 6-zeilige Multi-LED-Light-Engine | |
| Corning - DMEM | Thermo Fischer | MT10013CMEA | |
| Corning - Normales fötales Rinderserum | Thermo Fischer | MT35011CV | |
| Deckbrille: Kreise | Thermo Fischer | 12545102P | |
| GBX-2 dunkelrot Safelight Filter 5,5" | Kodak | 1416827 | Rote Safelight-Lampe |
| Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) 10x | Thermo Fischer | 14185052 | Verdünnt auf 1x, angepasster pH |
| LDI-7 | 89 North | ||
| L-Glutamin | Thermo Fischer | BW17605E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fischer | L3000001 | Transfektions-Kit |
| Olympus IX83 motorisiert mit zwei Decks Mikroskop | Olympus | Motorisiertes Zweideck-Mikroskop | |
| Opti-MEM, ohne Phenolrot | Thermo Fischer | 11058021 | |
| ORCA-Fusion digitale CMOS-Kamera | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Phosphat gepufferte Lösung (1x) | Lonza | 17516F | |
| Prior Emission Filterrad und Filtersätze | Prior Scientific, Inc. | Rad des Emissionsfilters | |
| Vorher Proscan XY-Stufe | Prior Scientific, Inc. | XY-Tisch | |
| Diabook 6 | Intelligent Imaging Innovations | Digitale Mikroskopie-Software | |
| SysCon-Software | SysCon-Software | Software, die vom Stimulationssystem bereitgestellt wird | |
| UGA-42 Geo | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA Ölobjektiv (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dichroit | Chroma Technology Corp | BS, Wellenlänge (CWL): 498 nm |
Referenzen
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